Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Mikroskopia siatkowa z arkuszami świetlnymi jest potężną technologią obrazowania, ale niewiele laboratoriów na świecie jest w stanie z niej korzystać. Protokół ten zawiera szczegółowy przegląd sposobu korzystania z dostępnego na rynku mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi. Jest to niezwykle potężny system zdolny do czterowymiarowego obrazowania pojedynczych komórek lub zarodków, który pozwala na śledzenie cząsteczek w czasie rzeczywistym.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona trójwymiarowo obrazować pojedyncze żywe komórki lub narządy z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną i minimalnym wybielaniem zdjęć. Wzór sieciowy arkusza świetlnego pozwala nam na szybkie obrazowanie próbek i uzyskiwanie w czasie rzeczywistym filmów trójwymiarowych żywych komórek i organów ze szczegółami molekularnymi, których inne techniki nie są w stanie osiągnąć. Ten pierwszy protokół wideo pokazujący, jak za pomocą mikroskopii świetlnej w kratę obrazować pojedynczą komórkę w czterech wymiarach.

Jest to bardzo skomplikowana technika ze względu na wyrównanie i przygotowanie próbki. Wierzymy, że demonstracja wizualna poprawi dostępność, umożliwiając większej liczbie naukowców obrazowanie wielu różnych molekuł, komórek i narządów w biologii. Aby rozpocząć tę procedurę, inkubuj pięciomilimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe z 0,1% poli-L-lizyną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Odessać płyn i pozostawić szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia. Następnie dodaj trzy mililitry gradientu gęstości do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Ostrożnie dodaj komórki kroplami do krawędzi probówki.

Wirować w temperaturze 930 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie ostrożnie usuń cienką środkową warstwę komórek między całym podłożem a odczynnikiem gradientu gęstości, upewniając się, że każdy typ komórek został umieszczony w osobnej stożkowej probówce. Wirować 300 razy g przez pięć minut, aby umyć komórki.

Odrzuć supernatant i dodaj pięć mililitrów RPMI do probówek limfocytów T i komórek CH27. Powtarzaj pranie ze świeżym RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania. Następnie ponownie zawieś ogniwa w każdej probówce jednym mililitrem pełnego RPMI i policz ogniwa za pomocą hemocytometru.

Ponownie zawiesić milion komórek prezentujących antygen w 500 mikrolitrach pełnego RPMI i dodać 10 mikromolowych MCC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Następnie ponownie zasymij milion limfocytów T w 500 mikrolitrach pełnego RPMI.

Dodaj dwa mikrogramy anty-TCR beta Alexa 488 oznaczonego FAB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odwirować obie komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów pełnego RPMI i powtórz wirówkę, aby umyć komórki.

Powtarzaj pranie ze świeżymi RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania, wyrzucając supernatant po każdym praniu. Następnie ponownie zawieś oba typy komórek w 500 mikrolitrach pożywki obrazowej. Najpierw dodaj 10 mililitrów wody i 30 mikrolitrów fluoresceiny do kąpieli LLSM.

Naciśnij przycisk Image Home (Strona główna obrazu), aby przesunąć obiekt do pozycji obrazu i spojrzeć na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnicy i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania, aby wiązka była cienkim wzorem, który jest zrównoważony we wszystkich kierunkach. Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza.

Użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, mikrometru górnej ostrości i koloru obiektywu, aby wyregulować wiązkę. Następnie umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 mililitrami wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę. Aby wyświetlić standardowe koraliki fluorescencyjne, włącz roztrząsanie, ustawiając wartość trzy w polu Zakres Xgalvo i naciśnij Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole.

Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kolor obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości. Następnie dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywem, Z galvo, Z plus obiektywu i skanowania próbki. Następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki, aby pobrać funkcję rozrzutu punktów próbkowania w celu skorygowania i dekonwolucji.

Zmień lasery na tryb trzech kolorów i ponownie naciśnij Wykonaj. Na początek dodaj 100 000 komórek zapobiegających prezentacji do przygotowanego okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy pięciu milimetrów i pozwól im osiąść przez 10 minut. Nasmaruj uchwyt próbki i dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry.

Następnie dodaj kroplę nośnika do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego. Przykręć sample uchwyt do piezo i naciśnij Image Home. Znajdź komórkę prezentującą antygen do zobrazowania i upewnij się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania działają prawidłowo.

Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki. Znajdź środek komórki prezentującej antygen, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij Stop, aby zatrzymać laser.

Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia. Naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj, aby zebrać dane. Obniż stolik do pozycji obciążenia i dodaj 50 mikrolitrów limfocytów T i pożywki obrazowej kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym.

Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś stół montażowy do tyłu, klikając przycisk Powrót obrazu. Rozpocznij obrazowanie.

Pamiętaj, aby ustawić żądany stos Z i długość timelapse. Na przykład obraz 60 Z układa się w stosy w odstępie co 0,4 mikrometra i wprowadza 500 ramek czasowych. Zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć wybielania zdjęć.

Użyj trybu na żywo, aby wyszukać pary komórek, a po wprowadzeniu gotowych i żądanych ustawień naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. W tym badaniu pierwotne mysie limfocyty T 5CC7 są izolowane i przygotowywane, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopu siatkowego. Pokazano tutaj prawidłową ścieżkę wiązki i wyrównanie wiązki podczas obrazowania za pomocą fluoresceiny.

Skan obiektywu powinien pokazywać duży kształt X w rzutach XZ i YZ, który jest tak symetryczny, jak to tylko możliwe. Powinny być również dostosowane tak, aby były jak najmniejsze od X. Skan Z galvo powinien pokazywać owal w XZ i XY z pojedynczą kropką po obu stronach.

Wreszcie, zarówno skan obiektywu Z plus, jak i skan próbki powinny pokazać kropki, które wyglądają na tak okrągłe, jak to tylko możliwe. Korzystając z tego protokołu, można było zobaczyć czterowymiarową dynamikę receptorów limfocytów T na powierzchni komórek T. Główną zaletą tego mikroskopu jest możliwość śledzenia wizualizowanych jednostek powierzchniowych receptorów limfocytów T i uzyskiwania danych ilościowych na podstawie ich wielkości, ruchu, intensywności sygnału i wydalin

Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest jakość Twojego wyrównania. Arkusz światła kratowego musi być codziennie wyrównywany, a niewykonanie tego spowoduje zniekształcone obrazowanie. Podobnie, jakość zebranych PSF ma bezpośredni wpływ na jakość dekonwolucji, co ostatecznie przekłada się na jakość końcowego obrazu.

Jednym z powodów, dla których ta metoda jest tak potężna, jest to, że każdą komórkę i etykietę można zastąpić, aby uwidocznić wiele typów komórek i cząsteczek. Dlatego metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na każde pytanie związane z czterowymiarowym śledzeniem molekuł. Uważamy, że ta technika utoruje naukowcom drogę do zbadania nowych pytań w dziedzinie transportu molekularnego.

Nie jest jeszcze szeroko stosowany ze względu na skomplikowany system, więc mamy nadzieję, że ten film Jove poprawi dostępność tej techniki. Lasery używane w systemie należą do klasy czwartej, dlatego należy zachować absolutną ostrożność, aby zapewnić bezpieczeństwo lasera. Przed użyciem tej metody należy przejść niezbędne szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera.