Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej
January 30th, 2020
Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.
Mikroskopia siatkowa z arkuszami świetlnymi jest potężną technologią obrazowania, ale niewiele laboratoriów na świecie jest w stanie z niej korzystać. Protokół ten zawiera szczegółowy przegląd sposobu korzystania z dostępnego na rynku mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi. Jest to niezwykle potężny system zdolny do czterowymiarowego obrazowania pojedynczych komórek lub zarodków, który pozwala na śledzenie cząsteczek w czasie rzeczywistym.
Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona trójwymiarowo obrazować pojedyncze żywe komórki lub narządy z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną i minimalnym wybielaniem zdjęć. Wzór sieciowy arkusza świetlnego pozwala nam na szybkie obrazowanie próbek i uzyskiwanie w czasie rzeczywistym filmów trójwymiarowych żywych komórek i organów ze szczegółami molekularnymi, których inne techniki nie są w stanie osiągnąć. Ten pierwszy protokół wideo pokazujący, jak za pomocą mikroskopii świetlnej w kratę obrazować pojedynczą komórkę w czterech wymiarach.
Jest to bardzo skomplikowana technika ze względu na wyrównanie i przygotowanie próbki. Wierzymy, że demonstracja wizualna poprawi dostępność, umożliwiając większej liczbie naukowców obrazowanie wielu różnych molekuł, komórek i narządów w biologii. Aby rozpocząć tę procedurę, inkubuj pięciomilimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe z 0,1% poli-L-lizyną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Odessać płyn i pozostawić szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia. Następnie dodaj trzy mililitry gradientu gęstości do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Ostrożnie dodaj komórki kroplami do krawędzi probówki.
Wirować w temperaturze 930 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie ostrożnie usuń cienką środkową warstwę komórek między całym podłożem a odczynnikiem gradientu gęstości, upewniając się, że każdy typ komórek został umieszczony w osobnej stożkowej probówce. Wirować 300 razy g przez pięć minut, aby umyć komórki.
Odrzuć supernatant i dodaj pięć mililitrów RPMI do probówek limfocytów T i komórek CH27. Powtarzaj pranie ze świeżym RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania. Następnie ponownie zawieś ogniwa w każdej probówce jednym mililitrem pełnego RPMI i policz ogniwa za pomocą hemocytometru.
Ponownie zawiesić milion komórek prezentujących antygen w 500 mikrolitrach pełnego RPMI i dodać 10 mikromolowych MCC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Następnie ponownie zasymij milion limfocytów T w 500 mikrolitrach pełnego RPMI.
Dodaj dwa mikrogramy anty-TCR beta Alexa 488 oznaczonego FAB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odwirować obie komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów pełnego RPMI i powtórz wirówkę, aby umyć komórki.
Powtarzaj pranie ze świeżymi RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania, wyrzucając supernatant po każdym praniu. Następnie ponownie zawieś oba typy komórek w 500 mikrolitrach pożywki obrazowej. Najpierw dodaj 10 mililitrów wody i 30 mikrolitrów fluoresceiny do kąpieli LLSM.
Naciśnij przycisk Image Home (Strona główna obrazu), aby przesunąć obiekt do pozycji obrazu i spojrzeć na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnicy i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania, aby wiązka była cienkim wzorem, który jest zrównoważony we wszystkich kierunkach. Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza.
Użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, mikrometru górnej ostrości i koloru obiektywu, aby wyregulować wiązkę. Następnie umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 mililitrami wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę. Aby wyświetlić standardowe koraliki fluorescencyjne, włącz roztrząsanie, ustawiając wartość trzy w polu Zakres Xgalvo i naciśnij Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole.
Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kolor obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości. Następnie dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywem, Z galvo, Z plus obiektywu i skanowania próbki. Następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki, aby pobrać funkcję rozrzutu punktów próbkowania w celu skorygowania i dekonwolucji.
Zmień lasery na tryb trzech kolorów i ponownie naciśnij Wykonaj. Na początek dodaj 100 000 komórek zapobiegających prezentacji do przygotowanego okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy pięciu milimetrów i pozwól im osiąść przez 10 minut. Nasmaruj uchwyt próbki i dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry.
Następnie dodaj kroplę nośnika do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego. Przykręć sample uchwyt do piezo i naciśnij Image Home. Znajdź komórkę prezentującą antygen do zobrazowania i upewnij się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania działają prawidłowo.
Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki. Znajdź środek komórki prezentującej antygen, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij Stop, aby zatrzymać laser.
Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia. Naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj, aby zebrać dane. Obniż stolik do pozycji obciążenia i dodaj 50 mikrolitrów limfocytów T i pożywki obrazowej kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym.
Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś stół montażowy do tyłu, klikając przycisk Powrót obrazu. Rozpocznij obrazowanie.
Pamiętaj, aby ustawić żądany stos Z i długość timelapse. Na przykład obraz 60 Z układa się w stosy w odstępie co 0,4 mikrometra i wprowadza 500 ramek czasowych. Zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć wybielania zdjęć.
Użyj trybu na żywo, aby wyszukać pary komórek, a po wprowadzeniu gotowych i żądanych ustawień naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. W tym badaniu pierwotne mysie limfocyty T 5CC7 są izolowane i przygotowywane, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopu siatkowego. Pokazano tutaj prawidłową ścieżkę wiązki i wyrównanie wiązki podczas obrazowania za pomocą fluoresceiny.
Skan obiektywu powinien pokazywać duży kształt X w rzutach XZ i YZ, który jest tak symetryczny, jak to tylko możliwe. Powinny być również dostosowane tak, aby były jak najmniejsze od X. Skan Z galvo powinien pokazywać owal w XZ i XY z pojedynczą kropką po obu stronach.
Wreszcie, zarówno skan obiektywu Z plus, jak i skan próbki powinny pokazać kropki, które wyglądają na tak okrągłe, jak to tylko możliwe. Korzystając z tego protokołu, można było zobaczyć czterowymiarową dynamikę receptorów limfocytów T na powierzchni komórek T. Główną zaletą tego mikroskopu jest możliwość śledzenia wizualizowanych jednostek powierzchniowych receptorów limfocytów T i uzyskiwania danych ilościowych na podstawie ich wielkości, ruchu, intensywności sygnału i wydalin
.Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest jakość Twojego wyrównania. Arkusz światła kratowego musi być codziennie wyrównywany, a niewykonanie tego spowoduje zniekształcone obrazowanie. Podobnie, jakość zebranych PSF ma bezpośredni wpływ na jakość dekonwolucji, co ostatecznie przekłada się na jakość końcowego obrazu.
Jednym z powodów, dla których ta metoda jest tak potężna, jest to, że każdą komórkę i etykietę można zastąpić, aby uwidocznić wiele typów komórek i cząsteczek. Dlatego metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na każde pytanie związane z czterowymiarowym śledzeniem molekuł. Uważamy, że ta technika utoruje naukowcom drogę do zbadania nowych pytań w dziedzinie transportu molekularnego.
Nie jest jeszcze szeroko stosowany ze względu na skomplikowany system, więc mamy nadzieję, że ten film Jove poprawi dostępność tej techniki. Lasery używane w systemie należą do klasy czwartej, dlatego należy zachować absolutną ostrożność, aby zapewnić bezpieczeństwo lasera. Przed użyciem tej metody należy przejść niezbędne szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje zastosowanie mikroskopi kratowej warstwy świetlnej do wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach, szczególnie receptorów komórek T na pierwotnych komórkach T CD4+. Podkreśla zalety tej technologii obrazowania dla śledzenia szczegółów molekularnych w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Mikroskopia kratowa warstwy świetlnej to nowoczesna technologia obrazowania.
- Umożliwia czterowymiarowe obrazowanie żywych komórek lub zarodków.
- Technika ta minimalizuje blaknięcie zdjęcia przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiej rozdzielczości przestrzenno-czasowej.
- Jest w stanie śledzić w czasie rzeczywistym cząsteczki wewnątrz komórek.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dotyczącego zastosowania mikroskopi kratowej warstwy świetlnej.
- Demonstracja obrazowania receptorów komórek T w żywych komórkach.
- Przedstawienie zalet tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami obrazowania.
Stosowane metody
- Wykorzystanie komercyjnie dostępnego mikroskopu kratowej warstwy świetlnej.
- Obrazowano w czasie rzeczywistym pojedyncze żywe komórki.
- Wysokoprędkowe obrazowanie za pomocą kratowego wzorca warstw świetlnych.
- Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki komórkowej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dynamiki receptorów komórek T w żywych komórkach T CD4+.
- Demonstracja wysokorozdzielczych, czasu rzeczywistego filmów żywych komórek.
- Ilustracja zalet mikroskopi kratowej warstwy świetlnej.
- Dostarczenie kompleksowego protokołu dla badaczy.
Wnioski
- Mikroskopia kratowa warstwy świetlnej jest potężnym narzędziem do obrazowania żywych komórek.
- Ten protokół umożliwia badaczom wizualizację dynamicznych procesów w czasie rzeczywistym.
- Technika ta oferuje znaczne zalety pod względem jakości i rozdzielczości obrazowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Lattice Light-Sheet Microscopy enables four-dimensional tracking of surface receptor dynamics with high spatiotemporal resolution and minimal photobleaching, providing quantitative data on molecular motion, size, and signal intensity. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying structure-function relationships of therapeutic targets like T-cell receptors. The method enhances predictive confidence in target validation and assay development for immunotherapies and immunomodulatory drugs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of T-cell receptor dynamics to validate therapeutic hypotheses and clarify signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides quantitative readouts on receptor size, motion, and intensity for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking receptor dynamics to cellular function in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible imaging data for assay readiness in receptor-ligand interaction studies.
- Operational Value: Enables high-speed, real-time tracking of molecular interactions with minimal photobleaching for reliable compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and molecules due to adaptable labeling and sample preparation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by enabling consistent visualization of receptor dynamics across model systems.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships to inform risk-adjusted advancement decisions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of dynamic biomarkers correlated with functional outcomes in immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing dynamic, quantitative data on surface receptor behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing real-time TCR dynamics and interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible, high-resolution imaging of molecular interactions in live cells.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of receptor size, motion, and signal intensity to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling consistent receptor tracking across immune cell models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform for diverse molecules and cell types beyond TCRs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic insight into receptor dynamics and target validation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 4D imaging across projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on validated target dynamics and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced optical alignment and sample preparation for live-cell imaging.
- Dependence on commercially available lattice light-sheet microscope with laser safety infrastructure.
- Needs cross-team standardization for consistent imaging protocols and data analysis.
- Adaptation considerations include labeling strategies and imaging media optimization across cell types.
- Practical limitations include system complexity, alignment sensitivity, and photobleaching risk if protocols are not followed.
