Name: Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj czterowymiarową wizualizację dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej. Ta metoda umożliwia śledzenie molekuł w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za rady i wskazówki od dr Vytasa Bindokasa z Uniwersytetu w Chicago. Dziękujemy Integrated Light Microscopy Core Facility na Uniwersytecie w Chicago za wsparcie i konserwację mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi. Praca ta była wspierana przez NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 i NSF Career Award 1653782 (dla J.H.). J.R. jest wspierany przez program stypendialny dla absolwentów NSF.

5C. C7 TCR-transgeniczne myszy z nokautem RAG2 w B10. W tym badaniu wykorzystano tło zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago.
1. Zbieranie i aktywacja limfocytów T
UWAGA: Ta część protokołu jest oparta na poprzednich protokołach. Zobacz cytaty, aby uzyskać więcej informacji20,21.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowego 5C. Transgeniczna mysz C7 dowolnej płci (~20-25 g) zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC (tj. komora CO2, po której następuje zwichnięcie szyjki macicy).</li>
	<li>Spryskaj tuszę myszy dokładnie 70% etanolem, aby namoczyć futro i umieścić w szafie bezpieczeństwa BSL-2.</li>
	<li>Obróć mysz na prawy bok i wykonaj małe nacięcie w jamie ciała nożyczkami chirurgicznymi. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy chirurgicznych. W razie potrzeby odetnij tkankę łączną nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Umieścić śledzionę w sitku do komórek z siatką o długości 70 μm i rozgnieść grzbietem tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Dokładnie przemyć sitko kompletnym RPMI (RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Odwirować jednokomórkową zawiesinę splenocytów przy stężeniu 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Granulka w tym momencie będzie czerwona.</li>
	<li>Ponownie zawiesić splenocyty w 5 ml buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut, a następnie schłodzić 5 ml pełnego RPMI.</li>
	<li>Odwirować jednokomórkową zawiesinę splenocytów przy stężeniu 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Pellet w tym momencie powinien być biały, a nie czerwony.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml pełnego RPMI.</li>
	<li>Przenieść do kolby T-25 i dodać 10 μM cytochromu C (MCC, sekwencja ANERADLIAYLKQATK). Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia dodać rekombinowaną myszą IL-2 do końcowego stężenia 100 U/ml.</li>
	<li>Obserwuj przez kolejne dni, dodając nowe nośniki, gdy bieżące nośniki zmienią kolor na żółty. Limfocyty T umrą, jeśli zostaną pozostawione w żółtym podłożu bez nadzoru przez ponad 48 godzin. Komórki są gotowe do użycia 6-10 dni po zbiorach.</li>
</ol>
2. Przygotuj komórki
<ol>
	<li>Inkubować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 5 mm z 0,1% poli-L-lizyną przez 10 minut. Odessać i pozostawić do naturalnego wyschnięcia.</li>
	<li>Użyj odczynnika gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów), aby oddzielić martwe komórki i uzyskać 1 x 106 limfocytów T i 1 x 106 APC (komórki CH2721,22 transdukowany cytozolowym mCherry) oddzielnie. 
	UWAGA: Komórki są liczone za pomocą hemocytometru.
	<ol>
		<li>Dodaj 3 ml odczynnika do gradientu gęstości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ostrożnie dodawaj komórki kroplami do krawędzi probówki. Nie mieszać. Wirować przy 930 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; użyj przyspieszania/zwalniania: WOLNY/WOLNY. Ostrożnie usuń cienką środkową warstwę komórek między całym podłożem a odczynnikiem gradientu gęstości, umieszczając każdy typ komórek w oddzielnych stożkowych rurkach. 
		UWAGA: Konieczne jest przygotowanie większej liczby komórek niż jest to potrzebne do obrazowania, ponieważ okazuje się, że średnio 50% jest tracone podczas procesu. Im więcej komórek jest używanych w procesie, tym łatwiej jest je zebrać z gradientu gęstości. Używamy 4-8 ml obu typów komórek, aby zapewnić nadmiar komórek. W razie potrzeby komórki można policzyć przed tym krokiem, aby zapewnić potrzebną objętość. Wszelkie dodatkowe komórki są umieszczane z powrotem w odpowiednich kolbach.</li>
		<li>Umyj obie probówki limfocytów T i komórek CH27 trzykrotnie 5 ml pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Supernatant należy wyrzucić za każdym razem podczas prania. Ponownie zawiesić każdą probówkę w 1 ml pełnego RPMI i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawieś 1 x 106 APC w 500 μl pełnej prędkości RPMI i dodaj 10 μM MCC. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie 500 μl pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Zawieś 1 x 106 limfocytów T w 500 μl pełnych RPMI. Dodaj 2 μg Fab znakowanego anty-TCRβ Alexa488 (klon H57) do 500 μl komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie 500 μl pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Wyrzucić supernatant po każdym praniu. 
	UWAGA: Dwuwartościowe przeciwciało anty-TCR pocięto na monowalentne Fab za pomocą zestawu do przygotowania Fab (patrz Tabela materiałów), aby uniknąć sieciowania receptorów limfocytów T przez przeciwciało dwuwartościowe (ten krok jest opcjonalny).</li>
	<li>Zawiesić oba typy komórek w 500 μl pożywki do obrazowania (pożywka L-15 Leibovitz bez czerwieni fenolowej z 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy).</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie codziennych wyrównań LLSM
UWAGA: (Ważne) Ten protokół wyrównania jest oparty na używanym przyrządzie LLSM (zobacz Tabelę Materiałów). Każdy LLSM może być inny i wymagać różnych strategii dostosowania, zwłaszcza tych, które są budowane w domu. Przeprowadzić odpowiednie rutynowe wyrównanie i przejść do sekcji 4.
<ol>
	<li>Dodaj 10 ml wody plus 30 μl fluoresceiny (1 mg/ml bulionu) do kąpieli LLSM (~10 ml objętości), naciśnij Obraz (Home), aby przesunąć obiektyw do pozycji obrazu i spójrz na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnic i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania (ROI), aby wiązka była cienkim wzorem zrównoważonym we wszystkich kierunkach.
	<ol>
		<li>Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza. Do regulacji użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, górnego mikrometru, ostrości i kołnierza obiektywu emisyjnego. Zobacz Rysunek 2A,B dla prawidłowo wyrównanej belki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 ml wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę.</li>
	<li>Standardowe kulki fluorescencyjne obrazu w mediach obrazowych (przygotowane przez przyklejenie kulek do szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm z poli-L-lizyną, patrz Tabela materiałów; można je wstępnie przygotować i ponownie wykorzystać) do funkcji fizycznego rozproszenia punktowego (PSF) w podłożach obrazowych. 
	UWAGA: W polu widzenia może być tylko jeden koralik do późniejszego przetworzenia, więc spróbuj znaleźć koralik, który jest sam w przeglądarce lub można go łatwo przyciąć, aby uzyskać pojedynczy koralik.
	<ol>
		<li>Włącz roztrząsanie, ustawiając wartość 3 w polu "Zakres X Galvo". Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole. Przesuń się wzdłuż kierunku Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i ściegi. Znajdź środek ściegu, przesuwając się wzdłuż Z, naciśnij Stop, aby zatrzymać laser. Zaznacz pole wyboru 3D, naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj). Spowoduje to zebranie danych.</li>
		<li>Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kołnierz obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości, a następnie wyreguluj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywu, z galvo, z+obiektyw (totPSF) i skanowania próbki (samplePSF). Zobacz Rysunek 2C-F dla prawidłowo dostosowanych projekcji maksymalnej intensywności (MIP). 
		UWAGA: Różne tryby przechwytywania (skanowanie obiektywne, z galvo, z+obiektyw i skanowanie próbki) zmieniają sposób, w jaki arkusz świetlny porusza się po próbce. Do wyrównania należy używać wszystkich trybów skanowania.</li>
		<li>Przykładowy skan pokazuje, w jaki sposób dane będą zbierane podczas eksperymentu. Pobrać próbkę PSF, naciskając przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki w celu prostowania i dekonwolucji (patrz punkt 5). Przełącz lasery na tryb trzech kolorów (488, 560, 647) i ponownie naciśnij przycisk Wykonaj. 
		UWAGA: Ponieważ obrazy LLSM są ustawione pod kątem (57,2°), obrazy przechwycone w trybie "skanowania próbki" są zbierane pod tym kątem, a zatem są "przekrzywione". Korekcja przekrzywienia to proces korekcji pod tym kątem i "ponownego wyrównania" obrazu do prawdziwego stosu z. Dane te muszą być zebrane na nośnikach obrazowania i we wszystkich kanałach, które będą obrazowane podczas eksperymentu. Jeśli nie zostanie to prawidłowo zebrane, dane nie zostaną prawidłowo skorygowane. Podobnie, upewnij się, że podłoże zostało podgrzane do 37 °C (lub żądanej temperatury eksperymentalnej).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja komórek za pomocą LLSM
<ol>
	<li>Dodaj 100 000 APC (50 μl) z kroku 2.5 do okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm z kroku 2.1 i pozwól im osiąść przez 10 minut.</li>
	<li>Nasmaruj uchwyt próbki, a następnie dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry. Dodaj kroplę podłoża do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęcherzyków powietrza przed umieszczeniem w kąpieli. Przykręć uchwyt próbki do piezo i naciśnij Obraz (Strona główna).</li>
	<li>Znajdź APC do obrazu, aby upewnić się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) działają prawidłowo. 
	UWAGA: Obrazujemy w kroku co 0,4 μm z 60 krokami z i ekspozycją 10 ms dla dwóch kolorów z ditherem ustawionym na 3, co daje 1,54 s na klatkę obrazu 3D o rozdzielczości XY ~200 nm i 400 nm Z. Ustawienia te mogą wymagać dostosowania w zależności od rozmiaru komórki, pożądanej rozdzielczości z i siły sygnału z zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego. Zużycie energii lasera będzie się również różnić w zależności od zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż punktu Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki.</li>
		<li>Znajdź środek transportera opancerzonego, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać działanie lasera. Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia (patrz krok 4.3.1), naciśnij Środek, a następnie naciśnij Wykonaj. Spowoduje to zebranie danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obniż stolik do pozycji ładowania i dodaj 50 μl limfocytów T do podłoża obrazowego (100 000 komórek, od kroku 2.5) kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym. Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś scenę z powrotem, klikając "Obraz (Powrót)".</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie. Pamiętaj, aby ustawić żądany rozmiar stosu i długość upływu czasu. Na przykład zobrazuj 60 stosów z krokiem 0,4 μm i wprowadź 500 ramek czasowych. (Zazwyczaj) zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć fotowybielania. Użyj trybu Na żywo, aby wyszukać pary komórek, a gdy zostaną wprowadzone gotowe i żądane ustawienia, naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. Zobacz film 1 i Rysunek 1 dla przykładu.</li>
</ol>
5. Dynamika nawierzchni toru
<ol>
	<li>Wyeksportuj dane z oprogramowania do obrazowania (patrz tabela materiałów). Spowoduje to utworzenie plików TIF z-stack dla każdego punktu czasowego w każdym kolorze.</li>
	<li>Najpierw przeprostuj i zdekonwolucjonizuj dane. 
	UWAGA: Używamy potoku LLSpy na licencji udzielonej przez HHMI's Janelia Research Campus18, ale prostowanie i dekonwolucja są również dostępne w wielu programach do obrazowania (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Usuń dane. 
	UWAGA: Używamy funkcji debleach Fidżi z dopasowaniem histogramu (Fiji Pathway: Image | Dostosuj | Korekcja wybielacza | Dopasowanie histogramu | Dobrze).</li>
	<li>Zaimportuj do oprogramowania śledzącego (patrz tabela materiałów). Śledź klastry zgodnie ze specyfikacją oprogramowania. Zobacz film 2, aby zobaczyć przykład. 
	UWAGA: Wyniki śledzenia będą zależeć od używanego oprogramowania śledzącego, wybranego algorytmu, wybranych żądanych parametrów wyjściowych itp. Na przykład w oprogramowaniu do śledzenia, z którego korzystaliśmy (patrz Tabela materiałów), zdecydowaliśmy się zezwolić oprogramowaniu na śledzenie nieregularnych kształtów, zamiast przypisywać każdej funkcji jedno miejsce, ponieważ klastry TCR nie są zorganizowane w idealne sfery. Ponadto zdecydowaliśmy się zebrać 35 parametrów, w tym prędkość, kierunek, głośność, intensywność, obszar, lokalizację i informacje o czasie trwania ścieżki. Jednak różne metody lub parametry będą korzystne, aby odpowiedzieć na różne pytania.
	<ol>
		<li>Jeśli śledzenie nie jest pożądane, użyj wtyczki ClearVolume dla Fidżi do wizualizacji i tworzenia filmów na podstawie danych hyperstack.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+%28TIRF%29+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelrod%2C+D+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 89, Chapter 7 169-221 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+%28PALM%29+of+Adhesion+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li>
<li>Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009(2016).</li>
<li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li>
<li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161(2014).</li>
<li>Schöneberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+cell+biology%3A+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li>
<li>Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGao%2C+R+%22Science%22">Science</a>. 363 (6424), New York, N.Y. 8302(2019).</li>
<li>Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCai%2C+E+%22Science%22">Science</a>. 356 (6338), New York, N.Y. 3118(2017).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596(2016).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4%2B+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li>
<li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li>
<li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentowany protokół został zoptymalizowany pod kątem wykorzystania limfocytów T CD4+ wyizolowanych z 5C. Myszy transgeniczne C7 na używanym instrumencie LLSM, a zatem inne systemy komórkowe i LLSM mogą wymagać innej optymalizacji. Jednak protokół ten pokazuje moc obrazowania 4D, ponieważ można go wykorzystać do ilościowego określenia dynamiki receptora powierzchniowego na całej komórce przy najmniejszych zniekształceniach w warunkach fizjologicznych. Dlatego istnieje wiele możliwych przyszłych zastosowań tej...

Precyzyjna dynamika molekuł przemieszczających się i dyfundujących na powierzchni trójwymiarowej komórki w czasie rzeczywistym była zagadką do rozwiązania. Mikroskopia zawsze była równowagą między szybkością, czułością i rozdzielczością; Jeśli jeden lub dwa są maksymalizowane, trzeci jest minimalizowany. Dlatego, ze względu na niewielkie rozmiary i ogromną prędkość, z jaką poruszają się receptory powierzchniowe, śledzenie ich dynamiki pozostało głównym wyzwaniem technologicznym w dziedzinie biologii komórki. Na przykład wiele badań przeprowadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)1,2,3, który ma wysoką rozdzielczość czasową, ale może obrazować tylko bardzo cienki wycinek błony komórek T (~100 nm), a zatem pomija zdarzenia dziejące się dalej w komórce. Te obrazy TIRF również pokazują tylko dwuwymiarowy wycinek komórki. Z kolei techniki superrozdzielcze, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)4, mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywowaną (PALM)5 i mikroskopia zubożenia emisji stymulowanej (STED)6, mogą pokonać limit dyfrakcji światła Abbego. Techniki te mają wysoką rozdzielczość przestrzenną (rozdzielczość ~20 nm)4,5,6,7, ale często potrzebują wielu minut, aby uzyskać pełny obraz dwuwymiarowy (2D) lub trójwymiarowy (3D), a zatem rozdzielczość czasowa jest tracona. Ponadto techniki takie jak STORM i PALM, które opierają się na sygnałach, mogą mieć niedokładności w liczeniu8,9. Mikroskopia elektronowa ma zdecydowanie najwyższą rozdzielczość (do 50 pm rozdzielczość)10; może być nawet przeprowadzany trójwymiarowo za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), co daje rozdzielczość do 3 nm XY i 500 nm Z11. Jednak każda forma mikroskopii elektronowej wymaga surowego przygotowania próbki i może być przeprowadzana tylko z nieruchomymi komórkami lub tkankami, co eliminuje możliwość obrazowania żywych próbek w czasie.
Techniki uzyskiwania wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej wymaganej do identyfikacji dynamiki molekuł powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach w ich prawdziwej fizjologicznej naturze 3D dopiero niedawno opracowane. Jedną z tych technik jest Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, która wykorzystuje strukturalny arkusz światła w celu drastycznego obniżenia fotowybielania. Opracowana w 2014 roku przez laureata Nagrody Nobla Erica Betziga, wysoka rozdzielczość osiowa, niski poziom fotobielenia i szumów tła oraz możliwość jednoczesnego obrazowania setek płaszczyzn na pole widzenia sprawiają, że mikroskopy LLS są lepsze od mikroskopów szerokokątnych, TIRF i konfokalnych12,13,14,15,16,17,18,19. Ta czterowymiarowa (x, y, z i czasowa) technika obrazowania, choć nadal ograniczona dyfrakcją (rozdzielczość XYZ ~200 nm), ma niesamowitą rozdzielczość czasową (osiągnęliśmy liczbę klatek na sekundę około 100 kl./s, co daje zrekonstruowany obraz komórki 3D z 0,85 sekundy na klatkę) do akwizycji przestrzennej 3D.
LLSM może być ogólnie używany do śledzenia dynamiki w czasie rzeczywistym dowolnych cząsteczek w dowolnej komórce na poziomie pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki, szczególnie tych w wysoce ruchliwych komórkach, takich jak komórki odpornościowe. Na przykład pokazujemy tutaj, jak używać LLSM do wizualizacji dynamiki receptora komórek T (TCR). Limfocyty T są komórkami efektorowymi adaptacyjnego układu odpornościowego. TCR są odpowiedzialne za rozpoznawanie ligandów peptyd-MHC (pMHC) wyświetlanych na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC), co decyduje o selekcji, rozwoju, różnicowaniu, losie i funkcji limfocytów T. To rozpoznanie zachodzi na granicy między limfocytami T i APC, co powoduje zlokalizowane grupowanie receptorów w celu utworzenia tak zwanej synapsy immunologicznej. Chociaż wiadomo, że TCR w synapsie immunologicznej są niezbędne do funkcjonowania efektora limfocytów T, nadal nieznane są mechanizmy leżące u podstaw transportu TCR w czasie rzeczywistym do synapsy. LLSM pozwolił nam zobrazować w czasie rzeczywistym dynamikę TCR przed i po przejściu do synapsy z wynikową interakcją pMHC-TCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). LLSM może być zatem wykorzystany do rozwiązania bieżących pytań dotyczących dynamiki formowania TCR i dostarczenia wglądu w to, w jaki sposób komórka odróżnia antygeny własne od obcych.

<table><tbody><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Do pobierania komórek T</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>Do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe 5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>502040</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>70um Sterylne sitko do komórek Corning</td><td></td><td>7201431</td><td>do zbierania komórek T</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciw myszemu TCR i łańcuchowi beta</td><td>BioLegend</td><td>109215</td><td>do obrazowania</td></tr><tr><td>płodowej surowicy bydlęcej (FBS)</td><td>X& Hodowla komórek Y</td><td>FBS-500</td><td>Do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Odczynnik gradientu Denisty do pobierania komórek T</td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Do wyrównania mikroskopu</td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>Do wyrównania mikroskopu</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td> Nie <td>dotyczy</td><td>Oprogramowanie do śledzenia; Inne opcje oprogramowania śledzącego to Amira lub Trackmate (Fidżi).</td></tr><tr><td>Mikroskop kratowy z arkuszami świetlnymi</td><td>3i</td><td>Mikroskop N/A</td><td>Używany</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>do obrazowania</td></tr><tr><td>L-glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia Research Campus</td><td>N/A</td><td>LLSpy był używany na podstawie licencji Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Skontaktuj się z innovation@janelia.hhmi.org, aby uzyskać dostęp. Inne metody dekonwolucji i deksowania są dostępne w programach do przetwarzania obrazu, takich jak Fiji, Slidebook, Amira i inne. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td></tr><tr><td>Moth Cytochrom C (MCC), sekwencja ANERADLIAYLKQATK</td><td>Niestandardowa synteza</td><td>Elimbio</td><td>do pozyskiwania limfocytów T</td></tr><tr><td>Penacylina/Streptamycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122_3683884612</td><td>Do hodowli komórek</td></tr><tr><td>T Produkty badawcze Poly-L-Lizyna</td><td>Phenix</td><td>P8920-100ML</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>buforu do lizy RBC</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>Do zbierania komórek T</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0523</td><td>Do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT10040CV</td><td>do hodowli komórek</td></tr><tr><td>T Slidebook</td><td>3i</td><td>Oprogramowanie do obrazowania N/A</td><td>LLSM</td></tr><tr><td>Chirurgiczne narzędzia</td> <td>do preparacjiNova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>Do zbierania limfocytów T</td></tr><tr><td>Kolby T-25</td><td>Eppendorf</td><td>2231710126</td><td>Do hodowli komórek</td></tr><tr><td>T Thermo Scientific Pierce Fab Micro Zestawy przygotowawcze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44685</td><td>Do przygotowania Fab</td></tr></tbody></table>

czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów t przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Sygnalizacja i funkcja komórki są podyktowane dynamicznymi strukturami i interakcjami jej receptorów powierzchniowych. Aby naprawdę zrozumieć zależność struktura-funkcja tych receptorów in situ, musimy je wizualizować i śledzić na powierzchni żywej komórki z wystarczającą rozdzielczością czasoprzestrzenną. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać niedawno opracowaną mikroskopię Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) do czterowymiarowego obrazowania receptorów komórek T (TCR) (4D, przestrzeń i czas) na żywej błonie komórkowej. Limfocyty T są jednymi z głównych komórek efektorowych adaptacyjnego układu odpornościowego, a tutaj użyliśmy limfocytów T jako przykładu, aby pokazać, że sygnalizacja i funkcja tych komórek są napędzane przez dynamikę i interakcje TCR. LLSM pozwala na obrazowanie 4D z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasoprzestrzenną. Ta technika mikroskopowa może być zatem ogólnie stosowana do szerokiej gamy cząsteczek powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych różnych komórek w biologii.

W niniejszej pracy opisujemy izolację, przygotowanie i obrazowanie pierwotnych limfocytów T 5C.C7 myszy z wykorzystaniem mikroskopu z arkuszem światła sieciowego (lattice light-sheet microscope). W sekcji 3 kluczowe jest prawidłowe wyrównanie mikroskopu oraz codzienne zbieranie funkcji punktowej rozproszonego światła (PSF), która służy do dekonwolucji danych po ich zebraniu. Na Rysunku 2 przedstawiamy prawidłowe obrazy wyrównania, które są widoczne podczas kalibracji mikroskopu. <strong clas...

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Mikroskopia siatkowa z arkuszami świetlnymi jest potężną technologią obrazowania, ale niewiele laboratoriów na świecie jest w stanie z niej korzystać. Protokół ten zawiera szczegółowy przegląd sposobu korzystania z dostępnego na rynku mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi. Jest to niezwykle potężny system zdolny do czterowymiarowego obrazowania pojedynczych komórek lub zarodków, który pozwala na śledzenie cząsteczek w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona trójwymiarowo obrazować pojedyncze żywe komórki lub narządy z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną i minimalnym wybielaniem zdjęć. Wzór sieciowy arkusza świetlnego pozwala nam na szybkie obrazowanie próbek i uzyskiwanie w czasie rzeczywistym filmów trójwymiarowych żywych komórek i organów ze szczegółami molekularnymi, których inne techniki nie są w stanie osiągnąć. Ten pierwszy protokół wideo pokazujący, jak za pomocą mikroskopii świetlnej w kratę obrazować pojedynczą komórkę w czterech wymiarach.Jest to bardzo skomplikowana technika ze względu na wyrównanie i przygotowanie próbki. Wierzymy, że demonstracja wizualna poprawi dostępność, umożliwiając większej liczbie naukowców obrazowanie wielu różnych molekuł, komórek i narządów w biologii. Aby rozpocząć tę procedurę, inkubuj pięciomilimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe z 0,1% poli-L-lizyną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Odessać płyn i pozostawić szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia. Następnie dodaj trzy mililitry gradientu gęstości do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Ostrożnie dodaj komórki kroplami do krawędzi probówki.Wirować w temperaturze 930 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie ostrożnie usuń cienką środkową warstwę komórek między całym podłożem a odczynnikiem gradientu gęstości, upewniając się, że każdy typ komórek został umieszczony w osobnej stożkowej probówce. Wirować 300 razy g przez pięć minut, aby umyć komórki.Odrzuć supernatant i dodaj pięć mililitrów RPMI do probówek limfocytów T i komórek CH27. Powtarzaj pranie ze świeżym RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania. Następnie ponownie zawieś ogniwa w każdej probówce jednym mililitrem pełnego RPMI i policz ogniwa za pomocą hemocytometru.Ponownie zawiesić milion komórek prezentujących antygen w 500 mikrolitrach pełnego RPMI i dodać 10 mikromolowych MCC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Następnie ponownie zasymij milion limfocytów T w 500 mikrolitrach pełnego RPMI.Dodaj dwa mikrogramy anty-TCR beta Alexa 488 oznaczonego FAB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odwirować obie komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów pełnego RPMI i powtórz wirówkę, aby umyć komórki.Powtarzaj pranie ze świeżymi RPMI, aż zostaną wykonane łącznie trzy prania, wyrzucając supernatant po każdym praniu. Następnie ponownie zawieś oba typy komórek w 500 mikrolitrach pożywki obrazowej. Najpierw dodaj 10 mililitrów wody i 30 mikrolitrów fluoresceiny do kąpieli LLSM.Naciśnij przycisk Image Home (Strona główna obrazu), aby przesunąć obiekt do pozycji obrazu i spojrzeć na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnicy i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania, aby wiązka była cienkim wzorem, który jest zrównoważony we wszystkich kierunkach. Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza.Użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, mikrometru górnej ostrości i koloru obiektywu, aby wyregulować wiązkę. Następnie umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 mililitrami wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę. Aby wyświetlić standardowe koraliki fluorescencyjne, włącz roztrząsanie, ustawiając wartość trzy w polu Zakres Xgalvo i naciśnij Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole.Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kolor obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości. Następnie dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywem, Z galvo, Z plus obiektywu i skanowania próbki. Następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki, aby pobrać funkcję rozrzutu punktów próbkowania w celu skorygowania i dekonwolucji.Zmień lasery na tryb trzech kolorów i ponownie naciśnij Wykonaj. Na początek dodaj 100 000 komórek zapobiegających prezentacji do przygotowanego okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy pięciu milimetrów i pozwól im osiąść przez 10 minut. Nasmaruj uchwyt próbki i dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry.Następnie dodaj kroplę nośnika do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego. Przykręć sample uchwyt do piezo i naciśnij Image Home. Znajdź komórkę prezentującą antygen do zobrazowania i upewnij się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania działają prawidłowo.Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki. Znajdź środek komórki prezentującej antygen, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij Stop, aby zatrzymać laser.Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia. Naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj, aby zebrać dane. Obniż stolik do pozycji obciążenia i dodaj 50 mikrolitrów limfocytów T i pożywki obrazowej kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym.Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś stół montażowy do tyłu, klikając przycisk Powrót obrazu. Rozpocznij obrazowanie.Pamiętaj, aby ustawić żądany stos Z i długość timelapse. Na przykład obraz 60 Z układa się w stosy w odstępie co 0,4 mikrometra i wprowadza 500 ramek czasowych. Zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć wybielania zdjęć.Użyj trybu na żywo, aby wyszukać pary komórek, a po wprowadzeniu gotowych i żądanych ustawień naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. W tym badaniu pierwotne mysie limfocyty T 5CC7 są izolowane i przygotowywane, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopu siatkowego. Pokazano tutaj prawidłową ścieżkę wiązki i wyrównanie wiązki podczas obrazowania za pomocą fluoresceiny.Skan obiektywu powinien pokazywać duży kształt X w rzutach XZ i YZ, który jest tak symetryczny, jak to tylko możliwe. Powinny być również dostosowane tak, aby były jak najmniejsze od X. Skan Z galvo powinien pokazywać owal w XZ i XY z pojedynczą kropką po obu stronach.Wreszcie, zarówno skan obiektywu Z plus, jak i skan próbki powinny pokazać kropki, które wyglądają na tak okrągłe, jak to tylko możliwe. Korzystając z tego protokołu, można było zobaczyć czterowymiarową dynamikę receptorów limfocytów T na powierzchni komórek T. Główną zaletą tego mikroskopu jest możliwość śledzenia wizualizowanych jednostek powierzchniowych receptorów limfocytów T i uzyskiwania danych ilościowych na podstawie ich wielkości, ruchu, intensywności sygnału i wydalin.Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest jakość Twojego wyrównania. Arkusz światła kratowego musi być codziennie wyrównywany, a niewykonanie tego spowoduje zniekształcone obrazowanie. Podobnie, jakość zebranych PSF ma bezpośredni wpływ na jakość dekonwolucji, co ostatecznie przekłada się na jakość końcowego obrazu.Jednym z powodów, dla których ta metoda jest tak potężna, jest to, że każdą komórkę i etykietę można zastąpić, aby uwidocznić wiele typów komórek i cząsteczek. Dlatego metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na każde pytanie związane z czterowymiarowym śledzeniem molekuł. Uważamy, że ta technika utoruje naukowcom drogę do zbadania nowych pytań w dziedzinie transportu molekularnego.Nie jest jeszcze szeroko stosowany ze względu na skomplikowany system, więc mamy nadzieję, że ten film Jove poprawi dostępność tej techniki. Lasery używane w systemie należą do klasy czwartej, dlatego należy zachować absolutną ostrożność, aby zapewnić bezpieczeństwo lasera. Przed użyciem tej metody należy przejść niezbędne szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera.

visualizing-surface-t-cell-receptor-dynamics-four-dimensionally-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii świetlnej w kratach, aby zobrazować interakcje między żywymi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda polega na skupieniu ultracienkiego arkusza światła sieciowego na oddziałującej parze komórek w celu uzyskania serii dwuwymiarowych obrazów, które są łączone w celu uzyskania czterowymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, które ujawniają czasoprzestrzenną dynamikę interakcji komórka-komórka.

Mikroskopia świetlna w sieci do wizualizacji interakcji receptor-ligand w żywych komórkach

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Poznaj czterowymiarową wizualizację dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej. Ta metoda umożliwia śledzenie molekuł w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Przeglądaj więcej filmów