Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Ogólnym celem oceny stopnia zaawansowania i preparacji rozwijających się obwodowych tkanek węchowych źrenic i dorosłych u gatunków Drosophila jest wygenerowanie próbek do analiz molekularnych i rozwojowych obwodowych tkanek węchowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju i ewolucji układu węchowego, takie jak dynamika ekspresji, poziomy i wzorce określonych genów w rozwijających się obwodowych tkankach węchowych. Dzięki tej metodzie możemy uzyskać wgląd w rozwijający się obwodowy układ węchowy u gatunków Drosophila.

Może być również stosowany do innych układów sensorycznych, takich jak obwodowy układ smakowy i wzrokowy. W przypadku eksperymentu sekwencjonowania RNA zaplanuj zebranie od 100 do 200 dysków antenowych lub anteny na czterech różnych etapach rozwoju. W przypadku immunohistochemii zaplanuj sekcję od 10 do 20 much.

Oczyść wszystkie materiały biorące udział w sekcji za pomocą 70% etanolu. Następnie należy dalej czyścić materiały za pomocą neutralizatorów RNazy. I przygotuj wszystkie roztwory, używając wody wolnej od nukleaz lub uzdatnionej DEPC.

Aby zebrać poczwarki, monitoruj larwy w 30-minutowych odstępach. I zbierz poczwarkę w fazie przedsłupkowej APF w godzinie zero. Larwy będą nieruchome i otoczone bardzo jasną, prawie białą kopertą poczwarki.

Na tym etapie przenieś larwy na małą dwucalową szalkę Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną. W przypadku rozwarstwienia APF w godzinie zero należy natychmiast przystąpić do zbierania dysku czułka poczwarkowego. W przeciwnym razie przykryj naczynie folią parafinową i pozwól zwierzętom rozwijać się w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż znajdą się w interesującym je stadium rozwoju.

Aby zainscenizować rozwój poczwarki innych gatunków Drosophila, zbierz larwy przedsłupkowa w godzinie zero i posortuj je do świeżej fiolki. Następnie zapisz liczbę dni od poczwarki do dorosłości. I po prostu przeskaluj ten czas do osi czasu dla melanogaster.

Na początek schłodź 150 mikrolitrów roztworu izolacyjnego RNA w 1,5-milimetrowej probówce bez RNaz. Następnie umieść kilka oddzielnych kropel PBS na podkładce preparcyjnej. W każdej kropli PBS umieść jedną poczwarkę do wycięcia.

W przypadku poczwarek od zera do dwóch godzin, użyj kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i pociągnij za te struktury, aby wyrwać i odsłonić mózgi i wyimaginowane dyski. W przypadku ośmiogodzinnych poczwarek najpierw delikatnie oderwij poczwarkę od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, aby odsłonić rozwijającą się głowę. Następnie odczep głowę w stawie szyjnym.

Na tym etapie rozwoju dyski antenowe znajdują się w głowie. Teraz przenieś tkanki zawierające krążki czułkowe do innej kropli PBS. Następnie zidentyfikuj tarczę antenową oka połączoną z mózgiem w płatach wzrokowych.

Za pomocą kleszczy odłącz krążek anteny oka i przenieś go do nowej kropli. W ośmiogodzinnych poczwarkach krążki oczu obejmują dyski czułkowe i oba znajdują się przed mózgiem. W następnej kropli podziel oko i krążki czułkowe za pomocą kleszczy.

Następnie za pomocą końcówki do pipety P20 delikatnie zbierz wypreparowaną tkankę z minimalną ilością płynu. Umieść krążek w odczynniku do izolacji roztworu izolacji RNA i kontynuuj preparowanie krążków antenowych, aż zbierze się co najmniej 100 takich krążków. Po 40 godzinach od powstania poczwarki dorosła antena nabiera ostatecznego kształtu, ale nadal jest przezroczysta.

Do pobrania sekwencji RNA potrzebnych jest co najmniej 50 poczwarek na tym etapie. Najpierw przygotuj 150 mikrolitrów schłodzonego roztworu do izolacji RNA. Na podkładce do sekcji umieść poczwarki w kropli PBS.

Następnie ustabilizuj ciało za pomocą jednej pary kleszczy i delikatnie zdejmij etui poczwarki z najbardziej przedniej ćwiartki, aby odsłonić głowę. Następnie ostrożnie zdejmij głowę w stawie szyjnym. Teraz delikatnie przenieś głowę do czystej kropli PBS.

Tam, aby usunąć membranę otaczającą głowicę, pipetuj głowicę w górę iw dół w PBS. Dzięki temu czyszczeniu antena powinna stać się widoczna. Teraz odłącz antenę od membrany między drugim a trzecim segmentem na złączu segmentowym.

Trzeci segment zawiera czułkowe receptory węchowe. Następnie za pomocą pipety delikatnie przenieś wypreparowaną tkankę do roztworu izolującego RNA, minimalizując ilość przenoszonego płynu. W celu ekstrakcji RNA należy przeprowadzić sekcję zwłok dorosłych, gdy są znieczulone na podkładce CO2.

Najpierw potraktuj podkładkę CO2 i kleszcze inhibitorami RNazy. Następnie znieczulij dorosłych i obejrzyj podkładkę pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą dwóch par kleszczy ustabilizuj ciało i delikatnie pociągnij lub ściśnij trzeci segment anteny z drugiego segmentu czułka, aby zebrać tkanki.

Przenieś anteny do probówki z roztworem izolacyjnym RNA, zanurzając kleszcze w płynie i uwalniając. Antena musi być zanurzona. Jeśli antena przyklei się do bocznej ściany, RNA ulegnie przedwczesnej degradacji.

Po zebraniu wystarczającej liczby czułków przystąp do ekstrakcji RNA. Lub przechowuj probówkę zbiorczą w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony. Jeśli anteny są przeznaczone do immunohistochemii, należy przeprowadzić tę sekcję na podkładce preparacyjnej z muchą zanurzoną w PBS z Tritonem lub bez.

Wypreparowaną rozwijającą się tkankę węchową można wykorzystać do ekstrakcji RNA, a następnie RT-PCR w celu oceny ekspresji genów. Na przykład w ten sposób można badać ekspresję transkryptów receptorów powierzchniowych i transkryptów receptorów węchowych. Alternatywnie, tkanki można wykorzystać do immunohistochemii w celu określenia wzorca ekspresji i subkomórkowej lokalizacji genów będących przedmiotem zainteresowania.

Na przykład transgeniczne muchy Rn-EGFP mogą być barwione przeciwciałami anty-GFP i anty-Laminina. Analiza pokazuje, że po 40 godzinach od powstania poczwarki gen Or67d jest aktywny w określonych komórkach anteny, napędzając ekspresję GFP w systemie GAL4-UAS. Po opanowaniu sekcje można wykonać w ciągu godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu czasu i odpowiednio zaplanowanego zbierania, starzenia i sekcji, w oparciu o ramy czasowe rozwoju poczwarki dla każdego gatunku Drosophila. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak qRT-PCR, immunohistochemia, a także inne techniki barwienia in vivo i profilowania transkrypcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wzorca i profili transkrypcji na poziomie systemów w rozwijającej się tkance. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się ewolucją i rozwojem systemów sensorycznych do badania dynamiki transkrypcji i odkrywania nowych genów w innych systemach sensorycznych u gatunków Drosophila.

Nie zapominaj, że praca z ostrymi kleszczami, niektórymi roztworami do ekstrakcji RNA i formaldehydem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wcześniejsza praktyka z sekcjami, rozwijanie umiejętności motorycznych, wysoka uważność i noszenie odpowiednich ubrań laboratoryjnych.