Name: Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę preparowania rozwijającej się tkanki węchowej u Drosophila do analiz molekularnych i immunohistochemicznych. Technika umożliwia badanie dynamiki ekspresji genów w układzie węchowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantem z National Science Foundation dla Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Etyki Badań Uniwersytetu Duke'a.
1. Przygotowanie tkanek i stopień rozwoju poczwarki Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>Najpierw określ, ile much będzie potrzebnych do sekcji. W przypadku RT-PCR i RNAseq należy pobrać od osobników 100 - 200 krążków antenowych i czułków, które są niezbędne w stadium prepulalnym, 8 godzin APF, 40 godzin APF i dorosłym. W przypadku immunohistochemii przeprowadź sekcję 10-20 osób.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie materiały, w tym podkładki preparacyjne i kleszcze, za pomocą chusteczek z 70% EtOH. Jeśli wypreparowany materiał ma być użyty do ekstrakcji RNA, wyczyść wszystko neutralizatorami RNazy i przygotuj wszystkie roztwory, używając wody uzdatnionej bez nukleaz lub pirowęglanu dietylu (DEPC). 
	UWAGA: W tym protokole do sekcji używa się silikonowych podkładek preparacyjnych zamiast szkła. Podkładki silikonowe są przyjazne dla ultracienkich kleszczy i sprzyjają szybkim i wysokiej jakości preparacjom.</li>
	<li>Zbierz poczwarkę w 0 h fazie APF/poczwarki.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić najbardziej precyzyjną inscenizację, monitoruj larwy w odstępach od 30 minut do 1 godziny. 
		UWAGA: Wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego w umiarkowanie zatłoczonej butelce prawdopodobnie przepoczwarzają się w ciągu kilku godzin.</li>
		<li>Gdy larwy staną się nieruchome i zostaną otoczone bardzo jasną (prawie białą) skrzynką poczwarki, przenieś je na małą 2-calową szalkę Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Kontynuuj przez 1 - 2 godziny, od czasu do czasu monitorując, identyfikując i przenosząc prepupae. 
		UWAGA: Alternatywnie, wyczyść butelkę ze wszystkich poczwarek i pozwól larwom rozwijać się przez 2 godziny. Wszystkie poczwarki zebrane po 2 godzinach będą mieścić się w zakresie APF 0 - 2 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast przejdź do kroku 3.1, aby wyciąć tarczę czułkową poczwarki dla etapu APF 0 h. Jeśli prepupa musi zostać poddana leżakowaniu, zbierz je do naczynia, przykryj naczynie i umieść warstwę parafinową wokół krawędzi, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie umieść szalkę Petriego w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Poczwarki mogą być teraz postarzane do eclosion.</li>
	<li>W przypadku poczwarek zebranych w ciągu 2 godzin, poczwarki należy postarzać o 2 godziny krócej niż pożądany wiek, aby upewnić się, że poczwarki nie starzeją się nadmiernie.</li>
	<li>Używaj ultracienkich kleszczyków (Dumont 55), ponieważ tkanka jest bardzo mała i delikatna.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek i etap rozwoju poczwarek innych gatunków Drosophila
<ol>
	<li>Aby określić długość rozwoju poczwarki u innych gatunków Drosophila, umieść próbki w optymalnej temperaturze, zapisz daty, w których obserwuje się poczwarki, posortuj je do świeżej fiolki i zapisz liczbę dni od poczwarki do dorosłości.</li>
	<li>Zapisać stosunek czasu do rozwoju poczwarki dla gatunków innych niż melanogaster i dla melanogaster. Pomnóż stosunek czasu rozwoju przez liczbę godzin wykorzystanych do oceny stopnia zaawansowania melanogaster, aby uzyskać liczbę godzin do starzenia się gatunków niemelanogasterowych.</li>
</ol>
3. Sekcja dysku poczwarkowego D. melanogaster 
Uwaga: Wszystkie czasy starzenia i protokoły sekcji są opisane dla Drosophila melanogaster. W przypadku wszystkich innych gatunków wymagana będzie modyfikacja protokołu starzenia się w oparciu o punkty czasowe rozwoju specyficzne dla gatunku, jak opisano powyżej.
<ol>
	<li>W przypadku rozwarstwienia dysku czułkowego poczwarki zbierz 50 - 100 0 - 2 h lub 6 - 8 h za pomocą szpatułki i umieść je na podkładce preparucyjnej.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odpipetować 150 μl roztworu izolacyjnego RNA do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml bez RNaz i umieścić probówkę na lodzie.</li>
	<li>Rozetnij poczwarki w 150 - 200 μL 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez nukleaz). Umieść wiele kropel PBS (150 - 200 μl na kroplę) na podkładce do preparacji.</li>
	<li>Na podkładce preparacyjnej umieścić poczwarki w wieku 0 - 2 godzin lub 6 - 8 godzin (jedna poczwarka na kroplę) do wypreparowania w jednej z kropel 1x PBS. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby ustabilizować ciało.</li>
	<li>W przypadku poczwarek w wieku 0 - 2 godzin, używając kleszczy w drugiej ręce, przytrzymaj najbardziej przednią część (haczyki ustne) poczwarki i wyciągnij ją, aby odsłonić mózg i wyimaginowane dyski przyczepione do przedniej obudowy poczwarki.</li>
	<li>W przypadku 8-godzinnych poczwarek APF najpierw delikatnie oderwij obudowę poczwarki od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, odsłaniając głowę w worku błonowym otaczającym ciało. 
	UWAGA: Ciało na tym etapie wygląda jak zwyrodniała larwa.</li>
	<li>Zdejmij głowę ze stawu szyjnego. 
	UWAGA: Gwarantuje to, że nie zostaną utracone krążki antenowe, które na tym etapie są połączone przede wszystkim z płatami wzrokowymi mózgu.</li>
	<li>Przenieś tkankę z mózgiem i wyimaginowanymi dyskami do innej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy lub pipety 20 μL.</li>
	<li>Zidentyfikuj tarczę oczno-czułkową połączoną z mózgiem w płatach wzrokowych. Za pomocą kleszczy odłącz krążek oczno-czułkowy od mózgu i obudowy poczwarki. Przenieś go do nowej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy lub pipety 20 μL. 
	UWAGA: Tarcza oczkowo-czułkowa przedpleśni jest płaską tkanką. Jednak w wieku 8 godzin krążki oczu są obracane, obejmując dyski czułkowe, które znajdują się przed centralną częścią mózgu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przeciąć tkankę w miejscu połączenia oka z dyskiem antenowym. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl delikatnie przenieś wypreparowaną tkankę do odczynnika do izolacji RNA. Zminimalizuj ilość przenoszonego płynu, pipetując jak najmniejszą ilość.</li>
	<li>Powtarzaj, aż wszystkie poczwarki zostaną wycięte.</li>
</ol>
4. Sekcja czułków D. melanogaster Śródpoczwarkowych i Dorosłych
Uwaga: Po 40 godzinach APF większość metamorfozy jest zakończona, a dorosłe struktury stają się widoczne, ale nadal są białe i nijakie. W tym momencie rozwoju dorosła antena przybrała swój ostateczny kształt, ale nadal jest przezroczysta, a większość receptorów węchowych, z wyjątkiem kilku, nie rozpoczęła ekspresji.
<ol>
	<li>W przypadku rozwarstwienia czułków poczwarkowych należy zebrać 50 - 100 poczwarek zgodnie z opisem w kroku 1 i starzyć je przez 40 godzin w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 150 μl roztworu izolacyjnego RNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz za pomocą pipety o pojemności 200 μl i umieścić probówkę na lodzie.</li>
	<li>Na podkładce preparacyjnej umieść poczwarkę do wycięcia w jednej z 1x kropel PBS. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby ustabilizować ciało. Używając kleszczy w drugiej ręce, delikatnie oderwij obudowę poczwarki od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, odsłaniając głowę w worku błonowym, który otacza ciało.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie odetnij głowę od reszty ciała poczwarki, przytrzymując ciało jednym zestawem kleszczy i odrywając głowę w stawie szyyjnym innym zestawem kleszczy. Delikatnie przenieś głowę do kolejnej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy. Pipetuj w górę i w dół, aby oczyścić zawartość głowy (mózg itp.), aby uzyskać przezroczystą błonę, która kiedyś otaczała rozwijającą się głowę Drosophila. 
	UWAGA: Po 40 - 50 godzinach APF anteny są połączone z najbardziej wysuniętą do przodu częścią błony. Staną się one widoczne do rozbioru, gdy zawartość głowicy zostanie oczyszczona za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy odłącz czułki poczwarki od błony. Odłącz 2. segment anteny od 3. za pomocą kleszczy, aby przeciąć staw segmentowy, ponieważ tylko 3. segment będzie zawierał neurony receptorów węchowych.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 20 μl, aby delikatnie przenieść wypreparowaną tkankę do odczynnika do izolacji roztworu RNA. Zminimalizuj ilość przenoszonego płynu, pipetując jak najmniejszą ilość. Powtarzaj, aż wszystkie poczwarki zostaną wycięte.</li>
	<li>W przypadku preparacji czułków u dorosłych, zbierz około 50 dorosłych osób i postażuj je przez tydzień po ekluzji. 
	UWAGA: Ekspresja genów receptorów węchowych i innych genów osiąga szczyt tydzień po zamknięciu. Dorosłe osobniki są starzone przez tydzień, aby zapewnić, że biologicznie istotne geny z transkryptami o niskiej liczebności wzrosną powyżej progu wykrywalności.</li>
	<li>W przypadku ekstrakcji RNA należy przeprowadzić sekcję much, gdy są jeszcze żywe, na podkładce CO2 . Leczyć elektrodę CO2 inhibitorami RNazy. W przypadku obrazowania konfokalnego należy wypreparować muchy na podkładce preparacyjnej w 1x PBS lub PBS + 0,2% Triton.</li>
	<li>Najpierw ułóż dorosłe osoby spać na podkładce stacji CO2 pod lunetą sekcyjną. Na podkładce stacji CO2, używając kleszczy w jednej ręce do stabilizacji ciała, użyj kleszczyków w drugiej ręce, aby delikatnie wyciągnąć / uszczypnąć trzeci segment anteny z drugiej.</li>
	<li>Przenieś anteny do roztworu izolującego RNA, używając kleszczy, aby umieścić anteny bezpośrednio w cieczy. Powtarzaj, aż wszystkie dorosłe osoby zostaną wypreparowane. 
	UWAGA: Upewnij się, że anteny są zanurzone w roztworze izolacyjnym RNA. Anteny mogą utknąć z boku rurki. Spowoduje to zwiększoną degradację RNA, zmniejszając jakość i ilość RNA.</li>
	<li>Bezpośrednio przejść do ekstrakcji RNA lub umieścić probówkę w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA z wypreparowanych tkanek
<ol>
	<li>Wyjąć wszystkie próbki z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.</li>
	<li>Krótko odwiruj (5 - 6 s, ~6,000 x g) każdą próbkę, aby zebrać materiał na dnie probówki.</li>
	<li>Miel każdą próbkę za pomocą autoklawowanego plastikowego tłuczka i silnika elektrycznego przez 10 s na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.2 i 5.3 4.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów i postępując zgodnie z protokołami producenta, aby uzyskać optymalną wydajność.</li>
	<li>Wykonaj qRT-PCR przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i specyficznych starterów przeciwko genom będącym przedmiotem zainteresowania i zgodnie z protokołami producenta.
	<ol>
		<li>Wszystkie reakcje PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s i 60 °C przez 30 s. 
		UWAGA: Pary starterów dla genów DIP i dpr są wymienione w tabeli 1, a startery dla genów receptorów węchowych są wymienione w Hueston CE i wsp.8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Utrwalenie dysków czułkowych i czułków do immunohistochemii
UWAGA: Napraw tkanki w partiach od 10 do 20 osób, aby upewnić się, że tkanki są utrwalone przez ten sam okres czasu. Zminimalizuj czas, przez jaki próbki pozostają w PBT (PBS z detergentem) przed przeniesieniem ich do utrwalacza, aby zmaksymalizować integralność tkanek.
<ol>
	<li>Zebrać wypreparowane krążki czułkowe lub czułki poczwarki do probówki PCR o pojemności 200 μl zawierającej 200 μl 0,2% PBT na lodzie, aby zachować integralność tkanek i uniknąć przywierania próbki do ścianki probówek PCR o pojemności 200 μl, co doprowadzi do niepełnego utrwalenia. 
	Uwaga: Czułki poczwarki i dyski czułkowe mogą być trudne do zauważenia, ponieważ są dość przezroczyste. Zaleca się stosowanie lunety preparacyjnej na wszystkich etapach mycia, aby zapobiec utracie tkanki. Alternatywnie, 96-dołkowe płytki Terasaki mogą być używane do utrwalania i barwienia, aby jak najlepiej śledzić tkankę.</li>
	<li>Wypreparowany dysk antenowy i próbki czułków poczwarek należy umieścić w około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W tym i kolejnych krokach należy przechowywać probówki z próbkami na nutatorze, aby prawidłowo wymieszać próbki w roztworze. Przechodzenie do kroku 6.7.</li>
	<li>W przypadku anteny dla osoby dorosłej należy najpierw wyciąć całą głowę i umieścić ją w około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć 3x 200 μl 0,2% PBT przez 10 min każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.</li>
	<li>Wróć do mikroskopu preparacyjnego, aby dokładniej wyciąć drugi segment czułka z nieruchomych głów. Używając kleszczy do ustabilizowania głowy, delikatnie wyciągnij/ściśnij trzeci segment anteny od drugiego.</li>
	<li>Przenieś wypreparowane trzecie segmenty czułki do około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) i utrwal je na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć 3x 200 μl 0,2% PBT przez 10 min każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio kontynuować immunohistochemię całej góry. 
	Uwaga: Skuteczność barwienia może ulec zmianie w przypadku stosowania przeciwciała. Ta metoda powinna być odpowiednia dla mniej obfitych znaczników białkowych lub słabszych przeciwciał. Czasami jednak może to wymagać optymalizacji protokołu (albo tożsamości, albo ilości utrwalacza, albo czasu utrwalenia).</li>
</ol>

<ol><li>Barish, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory+receptor+neuron+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).</li>
<li>Pan, J. W., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mechanisms-of-development-and-evolution-of-the-insect-olfactory-system-2168-9296.1000130.php?aid=21773">Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system.</a> Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).</li>
<li>Ramdya, P., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+olfactory+systems+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolving olfactory systems on the fly.</a> Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).</li>
<li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Knecht, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+combinations+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+mediate+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> eLife. 5, 44-60 (2016).</li>
<li>Enjin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Humidity sensing in Drosophila.</a> Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).</li>
<li>Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+endogenous+rotund+expression+and+function+in+developing+Drosophila.+olfactory+system+using+CRISPR-Cas9-mediated+protein+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).</li>
<li>Hueston, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modulatory+proteins+and+olfactory+receptor+signaling+in+the+refinement+and+maintenance+of+fruitless+expression+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons.</a> PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+rules+of+precursor+specification+underlying+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity.</a> Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+gene+regulatory+network+module+governing+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity.</a> PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+transcriptional+parallelism+and+variation+in+the+developing+olfactory+system+of+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+behavioral+and+transcriptional+variation+underlying+CO2+sensory+neuron+function+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila.</a> Fly. 11 (4), 239-252 (2017).</li>
<li>Stern, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transgenic+reagents+for+Drosophila+simulans%2C+D.+mauritiana%2C+D.+yakuba%2C+D.+santomea%2C+and+D.+virilis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest przydatnym źródłem informacji dla laboratoriów zainteresowanych identyfikacją programów genetycznych i transkrypcyjnych działających w rozwoju tkanki węchowej Drosophila , a także analizą porównawczą tych programów u różnych gatunków Drosophila . Jest to szczególnie przydatne, jeśli profile transkrypcyjne na poziomie systemowym z różnych etapów rozwoju są potrzebne jako podstawa do przyszłych badań. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak etapować i izolować rozwijającą się tkankę węchową...

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowany w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, badaniach zachowania i ewolucji behawioralnej1,2,3,4. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych1,5,6. Ogólnym celem tego manuskryptu jest pokazanie, jak inscenizować i preparować rozwijającą się poczwarkę i dorosłą tkankę węchową u gatunków Drosophila. Uzasadnieniem dla tej techniki jest generowanie próbek z różnych stadiów poczwarki do analiz molekularnych i rozwojowych obwodowego układu węchowego, takich jak RNAseq i ilościowy RT-PCR, oprócz technik znakowania tkanek in vivo. Technika ta może być szczególnie przydatna do identyfikacji dynamiki profili transkrypcyjnych w rozwijającym się dorosłym układzie węchowym u gatunków Drosophila nienależących do melanogastru, które nie mają wszystkich odczynników transgenicznych do znakowania i analiz specyficznych dla typu komórki. W tym manuskrypcie pokazujemy, jak preparować krążki czułkowe i czułki poczwarek i dorosłych gatunków Drosophila. Po pierwsze, pokazujemy, jak zidentyfikować Drosophila 0 h tworzenia się poczwarki (APF, białe poczwarki lub poczwarki) w celu oceny stopnia zaawansowania i starzenia się specyficznego dla gatunku. Następnie pokazujemy, jak rozciąć krążki antenowe i trzeci segment anteny; w szczególności, jak oddzielić je od tarczy oka i drugiego segmentu anteny w celu uzyskania czystości tkanek wymaganej do RNAseq lub RT-PCR. Stadia u D. melanogaster opisane w tym protokole odpowiadają w przybliżeniu wstępnie wzorzystej tarczy czułkowej (prepupae), doborowi prekursorów z tarczy antenowej (8 h APF), początkowi różnicowania końcówek dla ORN (40 h APF) i dorosłej antenie. Na koniec podajemy przykłady ilościowego RT-PCR z dorosłych czułków wyizolowanych przy użyciu tej metody oraz dla immunohistochemii in vivo. Metoda ta może być stosowana do generowania próbek do analizy RNA/DNA oraz do immunohistochemii rozwoju obwodowych tkanek węchowych różnych gatunków Drosophila.

<table><tbody><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>Rozcieńczony do 1X w wodzie wolnej od RNaz</td></tr><tr><td>CO2 zbiornik</td><td>Gaz powietrzny</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>Dwa ostre kleszcze (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Roztwory do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> preparacyjny<td></td></tr><tr><td>Małe wiaderko z lodem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety P20 i P200 oraz końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Probówki</td><td></td><td></td> do mikrofuge <td>Kup nukleazę bez nukleazy, aby uzyskać najlepsze wyniki</td></tr><tr><td>0,2 ml probówki do PCR Proszek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Polysciences</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td>Rozcieńczyć do 0,2% v/v w 1X PBS</td></tr><tr><td>2" szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Bibuła filtracyjna 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Zwilż wodą i umieść na szalce Petriego, aby poczwarki były wilgotne</td></tr><tr><td>25 C inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dejonizowany H2O</td><td></td><td></td><td>Kup bez nukleaz lub potraktuj DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>do stosowania do wykonywania podkładek preparacyjnych z pokryw płyt Terizaki.</td></tr><tr><td>MicroWell Mini Tacks z pokrywkami</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>Pokrywki mogą być używane do produkcji silikonowych podkładek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP królika</td><td>Międzynarodowy korpus MBL</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>PM005</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td></td></tr><tr><td>ADL195 (anty lamina, mysz)</td><td>Badania deweloperskie hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>przeciwciało</td></tr> <tr><td>pierwszorzędoweAlexa Fluor&reg; 488 kozie przeciwciało przeciw królikom IgG (H + L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Cy3 Koza Anty-mysie IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Triton X-100, detergent klasy białkowej, 10% roztwór, sterylnie filtrowany</td><td>detergent CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Lab Rotator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Rotator</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>Lekkie</td></tr><tr><td>wycieraczki do tkanek</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>Do czyszczenia materiałów preparacyjnych</td></tr><tr><td>Indeks górny II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Odwrotna transkryptaza&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>Ekstrakcja RNA</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18</td><td>Technologie życia</td><td>startera RT</td><td>18418012</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia RNeasy MinElute (50)Ekstrakcja</td> <td>RNA</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td></td></tr><tr><td>06402712001 LIGHTCYCLER 480 - PŁYTKA WIELODOŁKOWA 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowanym systemem w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, zachowaniu i ewolucji behawioralnej. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych. W tym protokole opisujemy sekcję rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej dorosłego gatunku Drosophila. Najpierw opisujemy, jak etapować i starzeć larwy Drosophila, następnie sekcję tarczy czułkowej od wczesnych stadiów poczwarki, a następnie sekcję czułków od połowy stadium poczwarki i dorosłych. Pokazujemy również metody, w których preparaty mogą być wykorzystywane w technikach molekularnych, takich jak ekstrakcja RNA do qRT-PCR, RNAseq czy immunohistochemia. Metody te można również zastosować do innych gatunków Drosophila po określeniu specyficznych dla danego gatunku czasów rozwoju poczwarki i obliczeniu odpowiednich etapów dla odpowiedniego starzenia.

Wypreparowaną rozwijającą się tkankę węchową można wykorzystać do ekstrakcji RNA z późniejszą analizą RT-PCR w celu oceny ekspresji genów lub poddać procedurom immunohistochemicznym, aby określić wzór ekspresji oraz lokalizację subkomórkową interesujących genów. W tej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane przy zastosowaniu obu tych protokołów. Rycina 1 przedstawiony jest reprezentatywny wynik ilościowej RT-PCR wykazujący transkrypcję genów rece...

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Ogólnym celem oceny stopnia zaawansowania i preparacji rozwijających się obwodowych tkanek węchowych źrenic i dorosłych u gatunków Drosophila jest wygenerowanie próbek do analiz molekularnych i rozwojowych obwodowych tkanek węchowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju i ewolucji układu węchowego, takie jak dynamika ekspresji, poziomy i wzorce określonych genów w rozwijających się obwodowych tkankach węchowych. Dzięki tej metodzie możemy uzyskać wgląd w rozwijający się obwodowy układ węchowy u gatunków Drosophila.Może być również stosowany do innych układów sensorycznych, takich jak obwodowy układ smakowy i wzrokowy. W przypadku eksperymentu sekwencjonowania RNA zaplanuj zebranie od 100 do 200 dysków antenowych lub anteny na czterech różnych etapach rozwoju. W przypadku immunohistochemii zaplanuj sekcję od 10 do 20 much.Oczyść wszystkie materiały biorące udział w sekcji za pomocą 70% etanolu. Następnie należy dalej czyścić materiały za pomocą neutralizatorów RNazy. I przygotuj wszystkie roztwory, używając wody wolnej od nukleaz lub uzdatnionej DEPC.Aby zebrać poczwarki, monitoruj larwy w 30-minutowych odstępach. I zbierz poczwarkę w fazie przedsłupkowej APF w godzinie zero. Larwy będą nieruchome i otoczone bardzo jasną, prawie białą kopertą poczwarki.Na tym etapie przenieś larwy na małą dwucalową szalkę Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną. W przypadku rozwarstwienia APF w godzinie zero należy natychmiast przystąpić do zbierania dysku czułka poczwarkowego. W przeciwnym razie przykryj naczynie folią parafinową i pozwól zwierzętom rozwijać się w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż znajdą się w interesującym je stadium rozwoju.Aby zainscenizować rozwój poczwarki innych gatunków Drosophila, zbierz larwy przedsłupkowa w godzinie zero i posortuj je do świeżej fiolki. Następnie zapisz liczbę dni od poczwarki do dorosłości. I po prostu przeskaluj ten czas do osi czasu dla melanogaster.Na początek schłodź 150 mikrolitrów roztworu izolacyjnego RNA w 1,5-milimetrowej probówce bez RNaz. Następnie umieść kilka oddzielnych kropel PBS na podkładce preparcyjnej. W każdej kropli PBS umieść jedną poczwarkę do wycięcia.W przypadku poczwarek od zera do dwóch godzin, użyj kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i pociągnij za te struktury, aby wyrwać i odsłonić mózgi i wyimaginowane dyski. W przypadku ośmiogodzinnych poczwarek najpierw delikatnie oderwij poczwarkę od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, aby odsłonić rozwijającą się głowę. Następnie odczep głowę w stawie szyjnym.Na tym etapie rozwoju dyski antenowe znajdują się w głowie. Teraz przenieś tkanki zawierające krążki czułkowe do innej kropli PBS. Następnie zidentyfikuj tarczę antenową oka połączoną z mózgiem w płatach wzrokowych.Za pomocą kleszczy odłącz krążek anteny oka i przenieś go do nowej kropli. W ośmiogodzinnych poczwarkach krążki oczu obejmują dyski czułkowe i oba znajdują się przed mózgiem. W następnej kropli podziel oko i krążki czułkowe za pomocą kleszczy.Następnie za pomocą końcówki do pipety P20 delikatnie zbierz wypreparowaną tkankę z minimalną ilością płynu. Umieść krążek w odczynniku do izolacji roztworu izolacji RNA i kontynuuj preparowanie krążków antenowych, aż zbierze się co najmniej 100 takich krążków. Po 40 godzinach od powstania poczwarki dorosła antena nabiera ostatecznego kształtu, ale nadal jest przezroczysta.Do pobrania sekwencji RNA potrzebnych jest co najmniej 50 poczwarek na tym etapie. Najpierw przygotuj 150 mikrolitrów schłodzonego roztworu do izolacji RNA. Na podkładce do sekcji umieść poczwarki w kropli PBS.Następnie ustabilizuj ciało za pomocą jednej pary kleszczy i delikatnie zdejmij etui poczwarki z najbardziej przedniej ćwiartki, aby odsłonić głowę. Następnie ostrożnie zdejmij głowę w stawie szyjnym. Teraz delikatnie przenieś głowę do czystej kropli PBS.Tam, aby usunąć membranę otaczającą głowicę, pipetuj głowicę w górę iw dół w PBS. Dzięki temu czyszczeniu antena powinna stać się widoczna. Teraz odłącz antenę od membrany między drugim a trzecim segmentem na złączu segmentowym.Trzeci segment zawiera czułkowe receptory węchowe. Następnie za pomocą pipety delikatnie przenieś wypreparowaną tkankę do roztworu izolującego RNA, minimalizując ilość przenoszonego płynu. W celu ekstrakcji RNA należy przeprowadzić sekcję zwłok dorosłych, gdy są znieczulone na podkładce CO2.Najpierw potraktuj podkładkę CO2 i kleszcze inhibitorami RNazy. Następnie znieczulij dorosłych i obejrzyj podkładkę pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą dwóch par kleszczy ustabilizuj ciało i delikatnie pociągnij lub ściśnij trzeci segment anteny z drugiego segmentu czułka, aby zebrać tkanki.Przenieś anteny do probówki z roztworem izolacyjnym RNA, zanurzając kleszcze w płynie i uwalniając. Antena musi być zanurzona. Jeśli antena przyklei się do bocznej ściany, RNA ulegnie przedwczesnej degradacji.Po zebraniu wystarczającej liczby czułków przystąp do ekstrakcji RNA. Lub przechowuj probówkę zbiorczą w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony. Jeśli anteny są przeznaczone do immunohistochemii, należy przeprowadzić tę sekcję na podkładce preparacyjnej z muchą zanurzoną w PBS z Tritonem lub bez.Wypreparowaną rozwijającą się tkankę węchową można wykorzystać do ekstrakcji RNA, a następnie RT-PCR w celu oceny ekspresji genów. Na przykład w ten sposób można badać ekspresję transkryptów receptorów powierzchniowych i transkryptów receptorów węchowych. Alternatywnie, tkanki można wykorzystać do immunohistochemii w celu określenia wzorca ekspresji i subkomórkowej lokalizacji genów będących przedmiotem zainteresowania.Na przykład transgeniczne muchy Rn-EGFP mogą być barwione przeciwciałami anty-GFP i anty-Laminina. Analiza pokazuje, że po 40 godzinach od powstania poczwarki gen Or67d jest aktywny w określonych komórkach anteny, napędzając ekspresję GFP w systemie GAL4-UAS. Po opanowaniu sekcje można wykonać w ciągu godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu czasu i odpowiednio zaplanowanego zbierania, starzenia i sekcji, w oparciu o ramy czasowe rozwoju poczwarki dla każdego gatunku Drosophila. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak qRT-PCR, immunohistochemia, a także inne techniki barwienia in vivo i profilowania transkrypcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wzorca i profili transkrypcji na poziomie systemów w rozwijającej się tkance. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się ewolucją i rozwojem systemów sensorycznych do badania dynamiki transkrypcji i odkrywania nowych genów w innych systemach sensorycznych u gatunków Drosophila.Nie zapominaj, że praca z ostrymi kleszczami, niektórymi roztworami do ekstrakcji RNA i formaldehydem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wcześniejsza praktyka z sekcjami, rozwijanie umiejętności motorycznych, wysoka uważność i noszenie odpowiednich ubrań laboratoryjnych.

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.

Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia

Poznaj metodę preparowania rozwijającej się tkanki węchowej u Drosophila do analiz molekularnych i immunohistochemicznych. Technika umożliwia badanie dynamiki ekspresji genów w układzie węchowym.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów