Name: Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę analizy kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidowych Chlamydomonas reinhardtii przy użyciu spektrometrii masowej. Technika ta pozwala badać zmiany w składzie białkowym pod wpływem warunków beztlenowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.H. dziękuje za wsparcie ze strony "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Wkład autora: M.H. zaprojektował badania; K. T., J. S. i M. T. przeprowadzili badania i przeanalizowali dane; Autorami artykułu byli K.T. i M.H.

1. Hodowla Chlamydomonas
<ol>
	<li>W niniejszej pracy wykorzystano następujące szczepy C. reinhardtii: WT cc124, WT cw15-arg7 (auksotrof z niedoborem ściany komórkowej i argininą), zmutowany szczep ΔPSI29 i szczep nokautujący pgrl1 4.</li>
	<li>Wszystkie szczepy były hodowane w podłożu tris-octano-fosforanowym (TAP)-30, w temperaturze 25 °C z ciągłym natężeniem światła 20-50 μE/m2 sekundy i wytrząsaniem przy 120 obr./min. Hodowlę ΔPSI należy owinąć bibułą w celu naświetlania światłem <5 μE/m2 sek.</li>
	<li>Kultury znakowanych szczepów (odpowiednio ΔPSI i WT cc124) zawierały 7,5 mM 15N NH4Cl, podczas gdy kultury dla szczepów nieznakowanych (WT cw15-arg7 i pgrl1, odpowiednio) zawierały 7,5 mM 14N NH4Cl. Komórki muszą rosnąć przez co najmniej cztery pokolenia, aby osiągnąć pełne znakowanie i muszą być utrzymywane w fazie wzrostu wykładniczego.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym rozpoczęcie doświadczenia należy policzyć i rozcieńczyć komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml w objętości co najmniej 750 ml/szczep.</li>
</ol>
Proszę zauważyć, że dwa rodzaje nieciągłych gradientów gęstości sacharozy są opisane w poniższym protokole. Gradienty gęstości sacharozy w fotosystemie według Takahashi i wsp.9 stosuje się do oddzielenia różnych fotosyntetycznych kompleksów białkowych od wyizolowanych i rozpuszczonych tylakoidów podczas wirowania w ciągu nocy i muszą być przygotowane dzień wcześniej (patrz protokół 2), a gradienty gęstości tylakoidów sacharozy8 są stosowane w procedurze izolacji tylakoidów (patrz protokół 3).
2. Przygotowanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie
<ol>
	<li>Do wylewania gradientów potrzebne są trzy roztwory podstawowe:
	<ol>
		<li>2 M sacharoza</li>
		<li>10% β-s.m. w H2O</li>
		<li>0,5 M trycyna, pH 8,0 (NaOH)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z tych zapasów, przygotuj następujące roztwory:
	<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
		<tbody>
			<tr height="20">
				<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:94px;">Koncentracja:</td>
				<td style="szerokość:75px;">1,3 mln</td>
				<td style="szerokość:75px;">1.0 M</td>
				<td style="szerokość:75px;">0.85 M</td>
				<td style="szerokość:75px;">0.7 M</td>
				<td style="szerokość:75px;">0,65 mln</td>
				<td style="szerokość:75px;">0.4 M</td>
			</tr>
			<tr height="20">
				<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:94px;">2 m Sacharoza</td>
				<td style="szerokość:75px;">13 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">10 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">8,5 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">7 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">6,5 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">4 ml</td>
			</tr>
			<tr height="20">
				<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:94px;">10% β-DM</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">100 μl</td>
			</tr>
			<tr height="20">
				<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:94px;">0,5 m tricine</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
				<td style="szerokość:75px;">200 μl</td>
			</tr>
			<tr height="20">
				<td height="21" style="wysokość:20px;szerokość:94px;">H2O</td>
				<td style="szerokość:75px;">6,7 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">9,7 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">11.2 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">12.7 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">13.2 ml</td>
				<td style="szerokość:75px;">15.7 ml</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Użyj probówek wirówkowych o wymiarach 14 mm x 89 mm i bardzo powoli wlewaj gradienty, zaczynając od roztworu o najwyższej gęstości sacharozy do roztworu o niższej gęstości.</li>
	<li>Wlać tylko po 1 ml dla roztworów 1,3 i 1,0 M oraz 2 ml dla pozostałych roztworów.</li>
	<li>Pozostaw gradienty na noc w chłodni.</li>
</ol>
3. Indukcja beztlenowa i izolacja błon tylakoidowych8
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do izolacji błon tylakoidowych należy wywołać warunki beztlenowe, bulgocząc argonem przez 4 godziny. Bulgotanie można przeprowadzić za pomocą szklanej pipety w kolbach hodowlanych z ciągłym mieszaniem kultury za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Rozpocznij od izolacji błon tylakoidów poprzez granulowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 2,500 x g, ponownie zawiesić w buforze H1 (0,3 M sacharozy, 25 mM HEPES (pH7,5), 5 mM MgCl 2). 
	(Należy pamiętać, że rozpoczynając izolację błon tylakoidów, próbki należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć degradacji białka, wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 °C i zdecydowanie zaleca się pracę w rękawicach, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną.)</li>
	<li>Ogniwa osadzane przez 5 minut przy 2 500 x g, ponownie zawieszone w buforze H1.</li>
	<li>Rozbij komórki dwoma przejściami przez nebulizator o ciśnieniu azotu 1,500 hPa (dla szczepów bez ściany komórkowej wykonaj tylko jedno przejście).</li>
	<li>Obracaj komórki przez 7 minut przy 2,500 x g. 
	(Po tym kroku supernatant powinien być jasnozielony, jeśli nie, pęknięcie komórki nie powiodło się.)</li>
	<li>Zawieś komórki w buforze H2 (0,3 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i komórki osadkowe na 10 minut przy 32 800 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze H3 (1,8 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i homogenizować osad za pomocą garnka (na końcu tego etapu roboczego nie powinny pozostać żadne zielone cząstki).</li>
	<li>Przygotować gradienty gęstości sacharozy tylakoidów w probówkach (25 mm x 89 mm), zaczynając od dołu od warstwy 12 ml buforu H3 z komórkami, wlać środkową warstwę 12 ml buforu H4 (1,3 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i na wierzch 12 ml buforu H5 (0,5 M sacharozy, 5 mM KWASÓW (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Zachowaj ostrożność podczas nalewania gradientów i unikaj mieszania trzech warstw.</li>
	<li>Zrównoważyć z buforem H5 i odwirować gradienty gęstości tylakoidów sacharozy przez 1 godzinę przy 70 700 x g.</li>
	<li>Usunąć prążki tylakoidów z gradientów gęstości sacharozy tylakoidów i rozcieńczyć je buforem H6 o odpowiedniej objętości (5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)).</li>
	<li>Wiruj komórki przy 37 900 x g przez 20 minut. Jeśli osad nie jest szczelny, do tego etapu wirowania potrzeba więcej buforu H6.</li>
	<li>Ponownie zawiesić tylakoidy w buforze H6 o małej objętości i przystąpić do oznaczania stężenia chlorofilu.</li>
</ol>
4. Oznaczanie stężenia chlorofilu31
<ol>
	<li>Oznaczanie ilości chlorofilu odbywa się za pomocą 80% acetonu.</li>
	<li>Zmieszać 995 μl 80% acetonu i 5 μl tylakoidów w buforze H6 (rozcieńczenie 1:200).</li>
	<li>Wirować przez kilka sekund, aż nie pozostaną żadne zielone cząstki, a następnie wirować w dół przy 14,1 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Weź supernatant i zmierz wartość wygaszania odpowiednio przy 663,6 i 646,6 nm oraz 750 nm.</li>
	<li>Oblicz ilość chlorofilu, korzystając z następujących wzorów:
	<ol>
		<li>CChl a [mg/ml] = (0,01225 * E663,6 – 0,00255 * E646,6) * współczynnik rozcieńczenia</li>
		<li>CChl b [mg/ml] = (0,02031 * E646,6 – 0,00491 * E663,6) * współczynnik rozcieńczenia</li>
		<li>CChl [mg/ml] = CChl a + CChl b</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wczytywanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie
<ol>
	<li>Oblicz ilości tylakoidów, β-DM i buforu H6, które są potrzebne dla każdego gradientu:
	<ol>
		<li>Każdy gradient należy obciążyć całkowitą objętością 700 μl 0,8 mg/ml chlorofilu w 0,9% β-DM (rozpuścić β-DM w H2O), pozostałą objętość wypełnić buforem H6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do solubilizacji przygotuj różne porcje z tylakoidami, β-DM i buforem H6 dla każdego gradientu.</li>
	<li>Pozostawić próbki na 20 minut na lodzie, regularnie mieszając (odwracając) co kilka minut (etap rozpuszczania).</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (14 000 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	(Po odwirowaniu osad powinien być mały i białawy, podczas gdy supernatant jest ciemnozielony.)</li>
	<li>Załaduj supernatant na gradienty.</li>
	<li>Zrównoważyć buforem H6 i odwirować za pomocą ultrawirówki przy 134 470 x g przez noc (14 godzin) w temperaturze 4 °C. 
	(Należy pamiętać, że pomyślne rozdzielenie kompleksów fotosyntetycznych przy użyciu gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie, jak przedstawiono w tym protokole, osiąga się tylko przy użyciu świeżo wyizolowanych tylakoidów, ponieważ przewidywanie rozpuszczania i separacji kompleksów jest trudne do wykonania podczas pracy z błonami tylakoidów, które zostały wcześniej zamrożone).</li>
</ol>
6. Frakcjonowanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie
<ol>
	<li>Zrób zdjęcia gradientów.</li>
	<li>Nakłuć otwór na dnie probówki za pomocą igły i frakcjonować gradienty w probówkach o pojemności 500 μl. Alternatywnie frakcjonowanie można również przeprowadzić przy użyciu 96-dołkowej płytki (mikropłytki).</li>
	<li>W przypadku stosowania mikropłytki należy określić absorbancję różnych frakcji gradientowych przy 675 nm. 
	(Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.)</li>
</ol>
7. SDS-PAGE i immunodetekcja
(Proszę zauważyć, że tylko dla porównania WT i ΔPSI przeprowadzono analizę western blot w celu wybrania frakcji do późniejszej analizy MS. Do eksperymentu wybrano frakcje WT i pgrl1 na podstawie absorbancji w różnych frakcjach.)
<ol>
	<li>Oddzielić 30 μl każdej frakcji od gradientu WT i ΔPSI na 13% żelu poliakrylamidowymSDS 32.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę western blot33 przy użyciu następujących przeciwciał: ANR1 (TEF7)26, PGRL134, CAS6, podjednostki PSI PSAD32 i podjednostki rdzeniowej PSII D1. Należy stosować wszystkie przeciwciała o rozcieńczeniu 1:1 000 (w celu uzyskania ulepszonej techniki wykrywania chemiluminescencji), z wyjątkiem przeciwciała D1, które należy stosować w rozcieńczeniu 1:10 000.</li>
	<li>Na podstawie wyników immunodetekcji należy pobrać frakcje pikowe ANR1, PGRL1 i PSAD dla WT i ΔPSI (tutaj odpowiednio frakcje 6 i 13), zmieszać 30 μl frakcji 6 z WT i ΔPSI i zrobić to samo z frakcją 13 z obu preparatów i ponownie rozdzielić je na 13% żelu poliakryloamidowym SDS.</li>
	<li>Do porównania ilościowego WT i pgrl1 należy wziąć frakcje nadkompleksu CEF, jak oznaczono przez pomiar absorbancji w różnych frakcjach gradientowych i wymieszać 30 μl obu próbek, a następnie rozdzielić na 13% żelu poliakrylamidowym SDS.</li>
	<li>Barwienie pasm białkowych roztworem Coomassie (85% kwasu fosforowego, 757 mM siarczanu amonu, 1,2% błękitu brylantowego Coomassie, 20% metanolu) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby usunąć niespecyficzne zabarwienia, przemyj kilkakrotnie ddH2O.</li>
	<li>Pokrój paski na kawałki żelu o średnicy 1 mm i przystąp do trawienia w żelu. 
	(Alternatywnie, próbki można suszyć przez kilka minut w wirówce próżniowej i przechowywać przez kilka tygodni przed kontynuowaniem trawienia w żelu).</li>
</ol>
8. Trawienie w żelu (zmodyfikowane z Shevchenko et al.Rozdział 35)
Proszę pamiętać, aby przygotować wszystkie i roztwory na krótko przed użyciem i wziąć szklane butelki do zawierających acetonitryl (ACN). 
OSTROŻNOŚĆ! Praca z ACN może być szkodliwa; Więcej informacji można pobrać ze strony: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
<ol>
	<li>Kawałki żelu myć >10 objętościami ddH2O (~200 μl) przez 30 sek.</li>
	<li>Inkubować kawałki żelu z 300 μl 25 mM NH4HCO3 przez 15 minut z potrząsaniem, usunąć płyn.</li>
	<li>Inkubować kawałki żelu z 300 μl 25 mM NH4HCO3 w 50% ACN (przygotować przez zmieszanie ACN i 50 mM NH4HCO3 w stosunku 1:1) przez 15 minut z wytrząsaniem, usunąć płyn.</li>
	<li>Jeśli kawałki żelu są nadal niebieskie, powtórz mycie NH4HCO3 i NH4HCO3 / ACN, aż większość Coomassie zostanie usunięta. 
	(Chociaż większość przebarwień Coomassie powinna zostać usunięta, nie jest konieczne całkowite odplamienie kawałków żelu.)</li>
	<li>Dodaj 100 μl ACN, aby odwodnić kawałki żelu przez 5 minut. Kawałki żelu powinny się skurczyć i wyglądać na całkowicie białe.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej ACN i kontynuuj trawienie trypsyny. Alternatywnie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Dodać 10-20 μl na pasmo 20 ng/μl trypsyny w 10% ACN / 25 mM NH4HCO3 (świeżo rozcieńczonym), próbki przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Po 30 minutach sprawdź, czy cały roztwór został wchłonięty i w razie potrzeby dodaj więcej buforu trypsyny. Kawałki żelu powinny być całkowicie pokryte buforem trypsyny. Próbki należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Pozostaw kawałki żelu na kolejne 90 minut na lodzie, aby nasycić je trypsyną. 
	(Etap krytyczny: wydajność peptydów tryptycznych znacznie wzrasta wraz ze wzrostem czasu inkubacji na lodzie, prawdopodobnie z powodu powolnej dyfuzji enzymu do matrycy poliakryloamidu. Konieczne jest posiadanie niewielkiego nadmiaru roztworu pokrywającego kawałki żelu, aby uniknąć wyschnięcia kawałków podczas całonocnej inkubacji.)</li>
	<li>Trawić w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin. W przypadku eksperymentów wymagających maksymalnego odzysku peptydów, trawić przez noc.</li>
	<li>Po roztrawieniu odwirować skondensowany bufor.</li>
	<li>Sonikować probówki przez 5 minut, aby wymyć peptydy i ponownie odwirować.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.</li>
	<li>Ekstrakcję peptydową 80 μl 30% ACN / 1% kwasu mrówkowego (FA) należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.</li>
	<li>Ekstrakcję 80 μl 30% ACN / 1% FA należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.</li>
	<li>Ekstrakcję 80 μl 70% ACN / 1% FA należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.</li>
	<li>Ponownie odwirować i połączyć supernatant z wcześniejszym eluatem. 
	(FA służy do inaktywacji trypsyny i zwiększenia rozpuszczalności peptydów.)</li>
	<li>Całkowicie wysuszyć roztwór peptydowy w wirówce próżniowej. 
	(W tym momencie próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do analizy MS).</li>
	<li>Ponownie zawiesić peptydy w 6 μl buforu MS (5% ACN, 0,1 v/v FA, woda) i sonikować przez 2-5 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki z maksymalną prędkością przez 5 minut w celu usunięcia cząstek stałych.</li>
	<li>Do analizy spektrometrycznej mas należy użyć 4 μl supernatantu.</li>
</ol>
9. Analiza danych MS za pomocą "Proteomatic"
Analiza danych została przeprowadzona za pomocą oprogramowania open-source "Proteomatic" (które można pobrać pod adresem http://www.proteomatic.org/), platformy, która pozwala na generowanie i uzupełnianie potoków oceny danych MS/MS, przy użyciu darmowego i komercyjnego oprogramowania36. W skrócie ustawienia są opisane poniżej, a bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w6,26.
<ol>
	<li>Identyfikacja i kwantyfikacja danych MS 
	Identyfikację i kwantyfikację białek z eksperymentów WT vs. ΔPSI przeprowadzono za pomocą OMSSA (wersja 2.1.437) i qTrace26, odpowiednio, jak opisano6,26. Do analizy danych MS z eksperymentu WT vs. pgrl1 użyto następującego zaktualizowanego potoku:
	<ol>
		<li>Oprócz OMSSA37 białka zostały również zidentyfikowane z X! Tandem (wersja 2013.02.0138). Oba algorytmy zastosowano poprzez wyszukiwanie w bazie danych wygenerowanej przez połączenie bazy danych modelu genów JGI Chlamydomonas w wersji 4.3 z bazą danych AUGUSTUS w wersji 10.2, a także w oparciu o połączoną bazę danych NCBI BK000554.2 i NC_001638.1.</li>
		<li>Identyfikację peptydów MS2 przeprowadzono przy użyciu podejścia typu cel-wabik39. Wabik dla każdego białka został stworzony przez losowe tasowanie peptydów tryptycznych przy zachowaniu nadmiarowości peptydów nieprotetypowych.</li>
		<li>Walidację statystyczną peptydów przeprowadzono za pomocą oprogramowania qvality (wersja 0.3.340) przy użyciu progu prawdopodobieństwa błędu a posteriori (PEP) mniejszego niż 0,01, a wyniki przefiltrowano z tolerancją masy prekursora wynoszącą 5 ppm.</li>
		<li>Peptydy od OMSSA i X! Serie tandemowe połączono i określono ilościowo za pomocą qTrace26, stosując następujące kroki filtrowania: wymagaj identyfikacji MS2, dodaj nazwy białek / informacje o grupach i wymagaj obu peptydów siostrzanych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Aby zbadać, czy proporcje białek znacząco różniły się względem siebie w mieszanych frakcjach nadkompleksu CEF z WT i pgrl1, przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 21). Podjednostki kompleksu cytochromu b6/f przetestowano względem siebie, a także białka FNR, FTSH2 i HCF136 względem podjednostek PSI. Proporcje peptydów w każdej liczbie skanów na białko wszystkich czterech kontrprób przetestowano pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilksa. Ponieważ populacje peptydów nie miały rozkładu normalnego (p<0,001), przeprowadzono statystyki nieparametryczne. W pierwszej kolejności zastosowano test Kruskala-Wallisa, oceniający istotną rozbieżność między grupami. Tylko wtedy, gdy test ten przewidywał znaczące różnice między grupami, przeprowadzono dalszą analizę w celu przewidzenia istotnych różnic między dwiema niezależnymi grupami za pomocą testu Manna-Whitneya-U.

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

W ostatnich latach opublikowano różne ilościowe badania proteomiczne z wykorzystaniem znakowania stabilnymi izotopami. W tych eksperymentach zwykle porównuje się dwie różne próbki, z których jedna jest znakowana stabilnym izotopem. Następnie białka lub peptydy z dwóch próbek są łączone w równych proporcjach i dalej przetwarzane razem48. Takie badania często mają na celu porównanie zdefiniowanych izolowanych przedziałów komórkowych (np. chloroplastów, mitochondriów lub błon tylakoidów) narażonych na ró...

Procesy fotosyntezy w błonach tylakoidowych roślin i glonów mogą funkcjonować w trybie liniowym i cyklicznym. Podczas liniowego przepływu elektronów (LEF) fotosystem I (PSI), fotosystem II (PSII) i cytochrom b6/f ostatecznie przenoszą elektrony z wody do NADP+1, prowadząc do wytworzenia NADPH i ATP2. W przeciwieństwie do tego, cykliczny przepływ elektronów (CEF), o którym wiadomo, że jest indukowany w różnych warunkach środowiskowych, takich jak stan 2 3 i warunki beztlenowe4, powoduje ponowną redukcję utlenionego PSI poprzez wstrzyknięcie elektronów z powrotem do łańcucha transportu elektronów. Proces ten może zachodzić albo po stronie zrębu kompleksu cytochromu b6/f 1, albo w puli plastochinonu5 i wytwarza ATP, ale nie NADPH2.

Celem prezentowanego protokołu jest zademonstrowanie metody opartej na spektrometrii mas (MS) do porównawczej, ilościowej analizy kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidowych Chlamydomonas reinhardtii w celu uzyskania wglądu w skład tych kompleksów w różnych warunkach (na przykładzie porównania genetycznie różnych szczepów). Podejście to zostało zastosowane w publikacji Terashima i in. z 2012 roku, wykazującej zależną od Ca2+ regulację CEF w C. reinhardtii, w której pośredniczy kompleks wielobiałkowy zawierający białka CAS, ANR1 i PGRL16. Procedura zostanie wyjaśniona poprzez analizę porównawczą składu superkompleksu CEF w dwóch genetycznie różnych szczepach, wykorzystując w ten sposób znakowanie jednego z dwóch szczepów ciężkim azotem (15N). Krótko mówiąc, protokół obejmuje przygotowanie błon tylakoidowych, a następnie solubilizację detergentem i frakcjonowanie kompleksów fotosyntetycznych w gradiencie gęstości sacharozy. Po frakcjonowaniu gradientu, wybrane frakcje dwóch szczepów miesza się na podstawie równej objętości, rozdziela za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeprowadza trawienie w żelu, a następnie ilościową analizę MS.

Jak wspomniano powyżej, CEF jest indukowany w różnych warunkach środowiskowych, a publikacja z 2010 roku demonstruje izolację funkcjonalnego superkompleksu CEF z komórek C. reinhardtii7 zablokowanych w stanie 2, co zostało przeprowadzone przez oddzielenie rozpuszczonych błon tylakoidowych na gradiencie gęstości sacharozy podczas ultrawirowania. Różni się od Iwai i wsp.7, przedstawiony protokół opisuje izolację superkompleksu CEF z beztlenowo hodowanych kultur C. reinhardtii przy zastosowaniu alternatywnej procedury. Obejmuje to zmiany w protokole izolacji tylakoidów, a także różnice dotyczące etapu rozpuszczania i rozdzielania kompleksów białkowych przez ultrawirowanie. W niniejszym protokole błony tylakoidalne izoluje się metodą opublikowaną przez Chua i Bennouna8, podczas gdy używane do przygotowania tylakoidów przez Iwai i wsp. zawierały 25 mM Me, 0,33 M sacharozy, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) zgodnie z opisem9. Solubilizację przeprowadzono 0,7-0,8% detergentem (n-tridecyl-β-D-maltozyd) przez 30 minut na lodzie w przypadku Iwai i współpracowników, podczas gdy opisana tutaj metoda solubilizacji polega na użyciu 0,9% detergentu (n-Dodecyl-β-D-maltozyd (β-DM)) i jest wykonywana tylko przez 20 minut na lodzie. Obie grupy używały 0,8 mg chlorofilu na ml do rozpuszczania z odpowiednim detergentem. Do oddzielenia kompleksów fotosyntetycznych od rozpuszczonych błon tylakoidowych Iwai i wsp. zastosowali stężenia sacharozy w zakresie 0,1-1,3 M, podczas gdy autorzy tego protokołu zastosowali stężenia w zakresie 0,4-1,3 M. Ostatnią różnicą jest prędkość wirowania, która jest niższa w porównaniu z wcześniejszą publikacją.

Solubilizacja błon tylakoidów za pomocą niejonowych detergentów, a następnie frakcjonowanie w gradionym gradinie gęstości sacharozy było już stosowane w licznych badaniach, począwszy od lat 80. aż do dzisiaj, 7, 9-14, a także zastosowanie metabolicznego znakowania białek jest szeroko rozpowszechnioną metodą w dziedzinie proteomiki. Opisane podejście stosuje znakowanie metaboliczne 15N dla jednego z dwóch porównywanych szczepów poprzez hodowlę go w obecności ciężkiego azotu jako jedynego źródła azotu w postaci 15N NH4Cl, który jest wbudowywany we wszystkie aminokwasy, prowadząc do przesunięcia masy w zależności od sekwencji aminokwasowej peptydu. Podczas analizy mieszaniny 14N i 15N w jednym przebiegu MS, to przesunięcie masy można wykorzystać do określenia pochodzenia próbki dla każdego peptydu, a względną obfitość peptydów można obliczyć reprezentując względną obfitość odpowiedniego białka15.

Dostępne są liczne ilościowe badania proteomiczne na C. reinhardtii, które porównują określoną ilość białka w celu analizy zmian w proteomie między warunkami eksperymentalnymi (np. zmiany w proteomie spowodowane składnikiem odżywczym16-19 lub stresem świetlnym20,21). W porównaniu z tamtymi badaniami, w obecnie prezentowanym podejściu łączone i analizowane są równe objętości próbek. Taki układ pozwala na badanie zachowań migracyjnych białek w obrębie gradientu, a ponadto na analizę składu różnych kompleksów w odniesieniu do badanych szczepów.
Ta metoda zostanie wyjaśniona głównie poprzez skupienie się na trzech białkach: Pierwszym kandydatem jest zlokalizowane w chloroplastach białko czujnika wapnia CAS, które, jak wykazano, jest zaangażowane w fotoaklimatyzację u C. reinhardtii22. Wapń jest uważany za ważny jon sygnałowy dla szlaków, które są aktywowane z powodu różnych stresów biotycznych i abiotycznych, co ostatecznie prowadzi do zmian w ekspresji genów i fizjologii komórki23 i zaproponowano, że chloroplasty mogą przyczyniać się do sygnalizacji komórkowej Ca2 + za pośrednictwem białka CAS22,24,25. Drugim białkiem jest ANR1 (odpowiedź beztlenowa 1 6), białko, które, jak wykazano, jest indukowane w warunkach beztlenowego wzrostu u C. reinhardtii26. Warto zauważyć, że CAS i ANR1 zostały zidentyfikowane jako podjednostki superkompleksu CEF, a ponadto, przy użyciu odwrotnych podejść genetycznych, wykazano, że oba białka przyczyniają się funkcjonalnie do CEF in vivo6, wspierając ich rolę jako funkcjonalnych podjednostek tego kompleksu białkowego. Trzecim białkiem jest białko tylakoidowe PGR5-Like 1 (PGRL1), które, jak wykazano, jest zaangażowane w CEF u Chlamydomonas4,27, a także u Arabidopsis5,28 i zostało również zidentyfikowane w pracy Iwai i wsp.7 

To podejście zostanie przedstawione poprzez pokazanie wyników dwóch różnych eksperymentów: typu dzikiego (WT) kontra (vs.) szczepu ΔPSI29, wykazującego delecję genu psab, kodującego dla niezbędnej podjednostki fotosystemu I, która jest również częścią superkompleksu CEF oraz WT vs. szczep nokautujący pgrl1 4. Dla każdego z tych eksperymentów porównano skład ilościowy superkompleksu CEF między szczepem znakowanym 15N i 14N.

<table><tbody><tr><td><silny>Chemikalia</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Aceton</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetonitryl Optigrade f&uuml; r LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>Szkodliwy, pracować w rękawiczkach. Zapoznaj się z tekstem protokołu, aby uzyskać dalsze środki ostrożności. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Chlorek amonu 15N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr><tr><td>Chlorek amonu 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Wodorofosforan amonu&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Siarczan amonu&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Coomassie błękit brylantowy R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041653</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltozyd</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Kwas mrówkowy&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Chlorek magnezu</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Kwas fosforowy</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Wodorofosforan dipotasu&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Diwodorofosforan potasu&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>sacharoza</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Trypsyna (zmodyfikowany stopień sekwencjonowania) i bufor trypsyny</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.promega.de/Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizator (BioNeb cell disrupttor)</td> <td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>do przygotowania gradientów w stylu Takahashi
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>do przygotowania gradientów izolacji tylakoidów.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Avanti Wirówka J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>Fuchs-Rosenthal komora do wysiewu komórek</td><td>Diagonal</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr> <tr><td>Homogenizator (Potter) 50 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>10618242</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Słupek do homogenizatora</td><td>Fisherbrand</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Ultrawirówka (Optima XPN-80 Ultrawirówka)</td><td>Strona internetowa Beckman Coulter</td><td></td><td>: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15n i ilościowej spektrometrii mas

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Wprowadzony protokół dostarcza narzędzie do analizy kompleksów wielobiałkowych w błonie tylakoidów, ujawniając wgląd w złożony skład w różnych warunkach. W tym protokole podejście to zostało zademonstrowane poprzez porównanie składu kompleksu białkowego odpowiedzialnego za cykliczny przepływ elektronów (CEF) u Chlamydomonas reinhardtii, wyizolowanego z genetycznie różnych szczepów. Procedura obejmuje izolację błon tylakoidowych, a następnie ich rozdzielenie na kompleksy wielobiałkowe poprzez wirowanie w gradionym spadku gęstości sacharozy, SDS-PAGE, immunodetekcję i porównawczą, ilościową spektrometrię mas (MS) opartą na różnicowym znakowaniu metabolicznym (14N/15N) analizowanych szczepów. Błony tylakoidowe rozpuszczone w detergentach są ładowane na gradienty gęstości sacharozy przy równym stężeniu chlorofilu. Po ultrawirowaniu gradienty są rozdzielane na frakcje, które są analizowane za pomocą spektrometrii mas opartej na równej objętości. Takie podejście pozwala na badanie składu we frakcjach gradientowych, a ponadto na analizę zachowania migracyjnego różnych białek, ze szczególnym uwzględnieniem ANR1, CAS i PGRL1. Ponadto metoda ta została zademonstrowana poprzez potwierdzenie wyników za pomocą immunoblottingu oraz dodatkowo poprzez wsparcie wyników poprzednich badań (identyfikacja i zależna od PSI migracja białek, które zostały wcześniej opisane jako wchodzące w skład superkompleksu CEF, takich jak PGRL1, FNR i cyt f). W szczególności podejście to ma zastosowanie do odpowiedzi na szeroki zakres pytań, dla których protokół ten może zostać przyjęty i np. wykorzystany do analiz porównawczych składu kompleksu wielobiałkowego wyizolowanego z różnych warunków środowiskowych.

Wprowadzona metoda proteomiki ilościowej ma na celu charakterystykę składu kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidów, co zaprezentowano poprzez analizę porównawczą komponentów superkompleksów CEF w genetycznie różnych szczepach C. reinhardtii. Opisana metoda została z sukcesem zastosowana przez Terashimę et al.6 i obejmuje izolację błon tylakoidów z kultur hodowanych beztlenowo, a następnie solubilizację detergentem. Następnie próbki są nanoszone na gradient gęstości sacharozy w oparciu...

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza porównawcza składu kompleksów MultiPro w błonach thal cord w różnych warunkach. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację błon thal z komórek lamona poddanych warunkom beztlenowym. Następnie błony th cord są solubilizowane i frakcjonowane w gradiencie gęstości sacharozy.Następnie miesza się równe objętości wybranych frakcji i rozdziela je za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. W dalszej kolejności prążki barwione Coomassie Blue poddaje się trawieniu trypsyną. Ostatecznie próbki analizuje się metodą ilościowej spektrometrii mas w celu zaobserwowania zmian w zawartości białek pomiędzy badanymi frakcjami.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe badania proteomiczne porównujące określoną ilość białka, jest to, że w naszym podejściu analizowane są połączone równe objętości frakcjonowanych próbek. Pozwala to na badanie zachowania migracji białek w gradiencie, a ponadto na analizę składu różnych kompleksów niebiałkowych w trzeciej grupie membran. W odniesieniu do zastosowanych szczepów, po hodowli szczepów Chlamydomonas reinhardtii zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć roztworów zapasowych: 2

a-new-approach-for-comparative-analysis-multiprotein-complexes-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nowe podejście do porównawczej analizy kompleksów wielobiałkowych oparte na 15N metodą metylowań metabolicznego i ilościowej spektometrii masowej

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Poznaj metodę analizy kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidowych Chlamydomonas reinhardtii przy użyciu spektrometrii masowej. Technika ta pozwala badać zmiany w składzie białkowym pod wpływem warunków beztlenowych.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu ^{metabolicznym 15}N i ilościowej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów