Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu ^{metabolicznym 15}N i ilościowej spektrometrii mas

Ogólnym celem tej procedury jest porównawcza analiza składu kompleksów MultiPro w błonach sznurowych w różnych warunkach. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie błon talowych z komórek lamony wystawionych na warunki beztlenowe. Następnie błony th cord są rozpuszczane i frakcjonowane na gradiencie gęstości sacharozy.

Następnie równe objętości żądanych frakcji są mieszane i rozdzielane na stronie SDS. Na koniec poplamione pasmami kumasi są trawione trypsyną. Ostatecznie próbki są analizowane za pomocą ilościowej spektrometrii mas w celu zaobserwowania zmian w obfitości białek pomiędzy badanymi frakcjami.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe badania proteomiczne porównujące określoną ilość białka, jest to, że w naszym podejściu równe objętości frakcjonowanych próbek są łączone i analizowane. Pozwala to na badanie zachowań migracyjnych białek w obrębie gradientu, a ponadto na analizę składu różnych kompleksów niebiałkowych w błonie trzeciej grupy. W odniesieniu do zastosowanych szczepów Po wyhodowaniu chlamydomonas powstrzymać odporne szczepy, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć roztworów podstawowych dwóch molowych sacharozy, 10% beta DM w wodzie i 0,5 molowej o pH 8,0.

Aby przygotować następujące roztwory dla gradientów gęstości sacharozy, aby ustawić gradienty za pomocą probówek wirówkowych o wymiarach 14 na 89 milimetrów, zacznij od powolnego wlewania jednego mililitra roztworu o stężeniu 1,3 molowym, a następnie jednego mililitra roztworu o stężeniu 1,0 molowym. Następnie wlej po dwa mililitry z 0,85, 0,7 0,65 i na końcu 0,4 molowca. Przechowuj gradienty przez noc w chłodni w celu wywołania warunków beztlenowych.

W kulturach chlamydomonas włożyć szklaną pipetę do kolb hodowlanych i bańkować z argonnem przez cztery godziny z ciągłym mieszaniem i oświetleniem w celu wyizolowania błon pępowinowych. Po inkubacji zacznij od granulowania komórek przez pięć minut w temperaturze 2 500 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza. Następnie zawiesić granulki komórek w 30 mililitrach H jednego buforu.

Powtórz wirowanie i ponownie zreusuj. Zawieś komórki w H jednym buforze, aby rozbić komórki, przepuść je przez nebulizator o ciśnieniu azotu 1 500 paskali. Upewnij się, że odległość między kulką ceramiczną a metalem jest wystarczająco mała, aby komórki mogły pęknąć.

Następnie obracaj komórki przez siedem minut w temperaturze 2500 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza. Supernatant powinien być koloru jasnozielonego. Jeśli pęknięcie ogniwa się powiodło, resus zawiesić komórki w 50 mililitrach buforu H dwa i granulować je przez 10 minut przy 32, 800 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie, po zawieszeniu komórek przez Resus w 10 mililitrach buforu H trzy, użyj garncarza do homogenizacji zawieszonego podniebienia. Następnie należy przygotować gradienty gęstości sacharozy w kordzie thal. Zacznij od 12 mililitrów komórek w buforze H trzy.

Następnie powoli wlej warstwę 12 mililitrów buforu H cztery i zakończ 12 mililitrami buforu H pięć. Użyj H pięć, aby zrównoważyć wirnik i odwirować gradienty przez jedną godzinę przy 70, 700-krotności grawitacji. Usunąć pasma TH z gradientów i użyć odpowiedniej objętości buforu H sześć do ich rozcieńczenia.

Obracaj komórki pod ciśnieniem 37 900 razy większym niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli osad nie jest szczelny, dodaj więcej buforu H sześć do etapu wirowania. Następnie resus.

Zawieś sznury thal w małej objętości bufora H six, aby załadować gradient gęstości sacharozy systemu fotograficznego. Najpierw oblicz ilości kordów tal, beta DM i bufora H sześć potrzebnych dla każdego gradientu. Zgodnie z tymi wytycznymi, każdy gradient będzie zawierał 0,8 miligrama na mililitr chlorofilu w 0,9% beta DM, a bufor H six zwiększy ostateczną objętość do 700 mikrolitrów.

Aby rozpuścić thys, przygotuj oddzielny Eloqua z tylakoidami beta DM i buforem H sześć dla każdego gradientu. Próbki należy inkubować na lodzie przez 20 minut i odwracać co kilka minut w celu wymieszania. Po odwirowaniu próbek w temperaturze 14 000 razy większej niż grawitacja przez 10 minut i w czterech stopniach Celsjusza.

Osad powinien być mały i białawy, a supernatant będzie ciemnozielony. Załaduj supernatant na równowagę gradientową za pomocą bufora H six i ultrawirówki pod ciśnieniem 134, 470 razy większym niż grawitacja przez 14 godzin i cztery stopnie Celsjusza. Po wirowaniu zrób zdjęcia gradientów, a następnie frakcjonuj.

Za pomocą igły przebij otwór na dnie probówki i zbierz frakcje w probówkach o pojemności 500 mikrolitrów. Lub proces z 96-dołkową płytką. Strona próbek do SDS w trawieniu żelowym i spektrometrii mas zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, przy użyciu wyników analizy immunologicznej krwi frakcji szóstej z typu dzikiego i frakcji 13 z delta PS jeden.

Frakcje pikowe A i R zostały wybrane do analizy cyklicznych składników nadzłożonych przepływu elektronów na tym rysunku. Pokazano względne proporcje białek przedstawione jako dzikie nad delta PS jeden 14 N ponad 15 N dla kilku PS jeden rdzeń i białka zbierające światło PS jeden, a także dla białek przypisanych do cyklicznego superkompleksu przepływu elektronów, różnice w obfitości NR jeden i CAS we frakcji szóstej i 13 typu dzikiego i delta PS jeden sugerują, że są to nowe składniki tego kompleksu, pokazane oto wyniki porównania ilościowego tego cyklicznego super kompleksu przepływu elektronów między typem dzikim a szczepem nokautującym PG L one. Co ciekawe, HCF 1 36, cytochrom B sześć, cytochrom B sześć podjednostka F czwarta i PET C wydają się być wzbogacone w typ dziki, podczas gdy FTSH 2, cytochrom F i PET O wydają się być wzbogacone w PG L jeden.

Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak porównać skład kompleksów MultiPro w płynnych membranach w różnych warunkach. Należy pamiętać, że dla pomyślnego przygotowania ciekłych błon i izolacji cyklicznego przepływu elektronów, super złożone rozerwanie komórek, garncarowanie komórek i izacja ciekłych błon są krytycznymi krokami. Ponadto gradienty gęstości sacharozy muszą być odwirowywane przez co najmniej 12 godzin, aby uzyskać pełne oddzielenie kompleksów fotosyntetycznych.