Name: Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę C-seq do pomiaru endogennych błędów transkrypcji w organizmach eukariotycznych. Technika ta wykorzystuje cyrkularyzację RNA i zaawansowaną bioinformatykę do analizy wierności transkrypcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja była możliwa dzięki finansowaniu z grantu T32ES019851 (dla C. Fritscha), R01AG054641, oraz grantu dla młodych badaczy AFAR (dla M. Vermulsta).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół przygotowania bibliotek C-seq do wykrywania błędów transkrypcji u Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans. Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z istniejącymi protokołami, a także alternatywne techniki.
W ciągu ostatnich 15 lat opracowano liczne systemy reporterowe, które opierają się na lucyferazy 7,8 lub rekombinacji Cre...

Genom dostarcza precyzyjnego biologicznego planu życia. Aby prawidłowo wdrożyć ten plan, ważne jest, aby genom został przepisany z dużą precyzją. Jednak jest mało prawdopodobne, aby transkrypcja była wolna od błędów. Na przykład, polimerazy RNA od dawna są znane z podatności na błędy in vitro1,2, a ostatnio wykazano, że popełniają błędy również in vivo3,5,6, szczególnie w przypadku uszkodzenia DNA7,8,9,10. Podsumowując, obserwacje te wskazują, że błędy transkrypcji występują w sposób ciągły we wszystkich żywych komórkach, co sugeruje, że mogą one być silnym źródłem zmutowanych białek.
Ten proces, określany jako mutageneza transkrypcyjna, różni się od klasycznej mutagenezy na dwa sposoby. Po pierwsze, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, błędy transkrypcji dotyczą zarówno komórek mitotycznych, jak i postmitotycznych, ponieważ nie zależą od replikacji DNA. Badanie mechanizmów wpływających na wierność transkrypcji dostarczy zatem cennych informacji na temat obciążenia mutacjami zarówno komórek mitotycznych, jak i postmitotycznych. Co ciekawe, błędy w transkrypcji zostały ostatnio powiązane z promowaniem agregacji białek11,12,13 i przypuszcza się, że przyczyniają się zarówno do kancerogenezy10, jak i do rozwoju oporności bakterii na antybiotyki14.
Po drugie, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, błędy w transkrypcji są z natury przejściowe. Ich tymczasowe istnienie jest szczególnie trudne, ponieważ sprawia, że błędy transkrypcji są niezwykle trudne do wykrycia. Na przykład, podczas gdy kilka laboratoriów opracowało cenne testy reporterowe do badania mutagenezy transkrypcyjnej, testy te są w stanie zmierzyć błędy transkrypcji tylko w ograniczonej liczbie kontekstów i organizmów modelowych4,15. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wielu badaczy zwróciło się ku technologii sekwencjonowania RNA (RNA-seq), która teoretycznie umożliwia rejestrowanie błędów transkrypcji w całym transkryptomie dowolnego gatunku. Jednak badania te można łatwo zmylić artefaktami konstrukcyjnymi biblioteki, takimi jak błędy odwrotnej transkrypcji, błędy amplifikacji PCR i podatny na błędy charakter samego sekwencjonowania. Na przykład odwrotne transkryptazy popełniają w przybliżeniu jeden błąd co ~20 000 zasad, podczas gdy polimerazy RNA (RNAP) powinny popełniać tylko jeden błąd co 300 000 zasad5,6. Ponieważ wskaźnik błędów samej odwrotnej transkrypcji przyćmiewa wskaźnik błędów polimeraz RNA wewnątrz komórek, praktycznie niemożliwe jest odróżnienie prawdziwych błędów transkrypcji od artefaktów spowodowanych przygotowaniem biblioteki w tradycyjnych danych sekwencyjnych RNA-Seq (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1a).
Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zoptymalizowaną wersję testu sekwencjonowania okręgowego (Cirseq lub C-seq dalej)5,16. Ten test pozwala użytkownikowi wykryć błędy transkrypcji i inne rzadkie warianty RNA w całym transkryptomie5. Test sekwencjonowania kołowego nosi tę nazwę, ponieważ kluczowy krok w tym teście obraca się wokół krążenia RNA. Gdy cele RNA zostaną zamknięte, są one transkrybowane wstecznie w sposób toczącego się koła, w celu wytworzenia liniowych cząsteczek cDNA, które zawierają wiele kopii tej samej matrycy RNA. Gdyby błąd był obecny w jednej z tych matryc, błąd ten byłby również obecny w każdym pojedynczym powtórzeniu zawartym w cząsteczce cDNA. W przeciwieństwie do tego, błędy wprowadzone przez odwrotną transkrypcję, amplifikację PCR lub sekwencjonowanie mają tendencję do pojawiania się losowo, a zatem będą obecne tylko w jednym lub dwóch powtórzeniach. W ten sposób, generując sekwencję konsensusu dla każdej cząsteczki cDNA i odróżniając błędy losowe od błędów występujących we wszystkich powtórzeniach, artefakty konstrukcji biblioteki można skutecznie oddzielić od prawdziwych błędów transkrypcji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1b).
Jeśli zostanie prawidłowo użyty, test C-seq może być użyty do dokładnego wykrycia szybkości podstawień, insercji i delecji zasad w RNA w transkryptomie dowolnego gatunku (na przykład, zobacz Traverse i Ochman17). Na przykład użyliśmy testu C-seq, aby zapewnić pomiary całego genomu poziomu błędu transkrypcji u Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans z pojedynczą rozdzielczością podstawową5 (obserwacje niepublikowane). Ta zoptymalizowana wersja testu C-seq, pierwotnie używana do dokładnego sekwencjonowania populacji wirusów RNA, została usprawniona w celu zminimalizowania trudnych warunków podczas przygotowywania biblioteki, które przyczyniają się do tworzenia artefaktów związanych z budową biblioteki. Ponadto, dzięki zastosowaniu szeregu dostępnych na rynku zestawów, wydajność testu jest znacznie poprawiona, a także jego przyjazność dla użytkownika. Przy prawidłowym zastosowaniu, test ten może dokładnie wykryć tysiące błędów transkrypcji na powtórzenie, co znacznie poprawia wyniki w porównaniu z poprzednimi badaniami6. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania mutagenezy transkrypcyjnej i pozwoli użytkownikowi uzyskać nowy wgląd w mechanizmy kontrolujące wierność transkrypcji w szerokim zakresie organizmów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oczyszczania RiboPure RNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td> Całkowite <td>oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania mRNA Genelute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>Oczyszczanie mRNA</td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Elucja i rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Ambion RNaza III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>Fragmentacja RNA</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaza 1 (ssRNA Ligaza)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>Cyrkularyzacja RNA</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>Inhibitor RNazy</td></tr><tr><td>SuperScript III Odwrotna transkryptaza ThermoFisher</td><td></td><td>18080044</td><td>Odwrotna transkrypcja w toczeniu</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Odwrotna transkrypcja w kształcie koła</td></tr><tr><td>Losowe heksamery (50 ng / & micro; L)</td> <td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Rolling circle Odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>Moduł syntezy drugiej nici NEB New</td><td>England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Synteza drugiej nici</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>cDNA NEB Next Startery indeksu NEB</td><td></td><td>E7335S</td><td>Multipleksowe startery</td></tr> <tr><td>PCROligo Czysty & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Oczyszczanie próbek RNA i DNA</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Magnetyczne oczyszczanie kulek</td></tr><tr><td>Kulki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Magnetyczne oczyszczanie kulek</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424</td><td>Wirówka FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Warunki cykliczne średniej i wysokiej temperatury</td></tr><tr><td>Termocykler PTC-200</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>Warunki cykliczne w niskiej temperaturze</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Sterylizacja</td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430290</td> Probówka wirówkowa <td>15 ml bez nukleaz</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>430052</td> Probówki Eppendorf <td>bez nukleaz</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>System taśm 4200 bez nukleaz</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Przyrząd do analizy nukleotydów do kontroli jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA</td></tr><tr><td>Taśma sitowa RNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA</td></tr><tr><td>Bufor do próbek RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA</td></tr><tr><td>Drabinka RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA</td></tr><tr><td>2100 Instrument do bioanalizacji</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Kontrola jakości dwuniciowego DNA</td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Kontrola jakości dwuniciowych próbek cDNA</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Inkubacja</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000/2000C</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>Oznaczanie stężenia RNA</td></tr></tbody></table>

nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Dokładna transkrypcja jest wymagana dla wiernego wyrażenia informacji genetycznej. Co zaskakujące, niewiele wiadomo o mechanizmach kontrolujących wierność transkrypcji. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy naukowej, niedawno zoptymalizowaliśmy test sekwencjonowania kołowego w celu wykrycia błędów transkrypcji w całym transkryptomie Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans. Protokół ten zapewni naukowcom nowe, potężne narzędzie do mapowania krajobrazu błędów transkrypcji w komórkach eukariotycznych, dzięki czemu mechanizmy kontrolujące wierność transkrypcji będą mogły zostać wyjaśnione w niespotykanych dotąd szczegółach.

Podobnie jak w przypadku wszystkich metod sekwencjonowania masowo równoległego, każdy eksperyment C-seq generuje nieporęczny, obszerny zbiór danych. Dla osób korzystających z tej metody po raz pierwszy obsługa tych zbiorów danych może być trudna; dlatego zaleca się, aby wszyscy użytkownicy skontaktowali się z doświadczonym bioinformatykiem przed rozpoczęciem eksperymentów. Przewiduje się, że przeciętnie użytkownicy wygenerują około 55–70 Giga bases (Gbases) na jeden przebieg na większości...

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mutagenezy transkrypcyjnej, takie jak to, które podjednostki polimerazy RNA lub procesy biologiczne kontrolują wierność transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na pomiar endogennych błędów transkrypcji w transkryptomach organizmów eukariotycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tym protokole, będą miały trudności ze względu na długość i złożoność testu oraz potrzebę zaawansowanej bioinformatyki w celu interpretacji danych.Aby rozpocząć protokół, należy cyrkularyzować fragmenty RNA poprzez denaturację termiczną 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Po jednej minucie natychmiast umieścić próbkę na lodzie na dwie minuty. Następnie dodaj cztery mikrolitry 10x buforu ligazy RNA T4, cztery mikrolitry 10 milimolowych ATP, jeden mikrolitr inhibitora RNazy, jeden mikrolitr wody wolnej od nukleaz i osiem mikrolitrów 50% glikolu polietylenowego lub PEG.Następnie dokładnie wymieszaj próbkę przez wirowanie. Następnie dodaj dwa mikrolitry po 10 jednostek na mikrolitr ligazy RNA T4 jeden. Ponownie wymieszać próbkę pipetując i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny w termocyklerze z temperaturą pokrywki ustawioną na 30 stopni Celsjusza.Po dwugodzinnej inkubacji dodać do próbki 10 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i oczyścić próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania i zatężania oligo. Eluować próbkę w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Aby odwrócić transkrypcję kolistych cząsteczek RNA, dodaj cztery mikrolitry 10-milimolowych dNTP, cztery mikrolitry 50 nanogramów na mikrolitr losowych heksamerów i dziewięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do dziewięciu mikrolitrów RNA.Dokładnie wymieszać pipetując i denaturować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Po denaturacji próbkę należy umieścić na lodzie na dwie minuty. Dodać do próbki osiem mikrolitrów 5x buforu do syntezy pierwszej nici, dwa mikrolitry 0,1 milimolowej DTT i cztery mikrolitry 200 jednostek na mikrolitr odwrotnej transkryptazy i wymieszać pipetując.Inkubować próbkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut z pokrywką ustawioną o pięć stopni Celsjusza powyżej temperatury inkubacji. Następnie inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza pod pokrywką ustawioną na 47 stopni Celsjusza. Eluować próbkę w 42 mikrolitrach roztworu elucyjnego po oczyszczeniu za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratora.Użyj zestawu do syntezy drugiej nici, aby wygenerować dwuniciową bibliotekę cDNA. Umieść próbki na lodzie i dodaj 30 mikrolitrów wody NF do 38 mikrolitrów próbki. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 10-krotnego buforu drugiej nici i cztery mikrolitry enzymu drugiej nici i wymieszaj próbkę przez delikatne pipetowanie przed inkubacją w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwie i pół godziny.Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i zagęszczania oligonugody, aby uzyskać 100 mikrolitrów reakcji i eluuj próbki w 38 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Wymieszaj końcową reakcję naprawy przez pipetowanie i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Postępuj zgodnie z inkubacją w temperaturze 20 stopni Celsjusza z 30-minutową inkubacją w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Najpierw rozcieńczyć adaptery do sekwencjonowania nowej generacji dziesięciokrotnie w 10 milimolowym tris HCl do końcowego stężenia 1,5 mikromolowego. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera i jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji do każdej próbki i wymieszaj je przez wirowanie. Następnie dodaj 15 mikrolitrów mieszanki głównej ligazy TA.Pipetować próbkę w górę i w dół, aby wymieszać i inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj trzy mikrolitry enzymu odczynnika do wycinania swoistego dla uracylu i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu ligacji dodaj do próbki 13,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 100 mikrolitrów i przystąp do wyboru wielkości.Przyzwyczaj kulki magnetyczne do temperatury pokojowej. Do każdej próbki dodać 30 mikrolitrów zaaklimatyzowanych, ponownie zawieszonych kulek magnetycznych i wymieszać przez pipetowanie. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym na pięć minut, aby oddzielić kulki od supernatantu. Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wyrzuć kulki magnetyczne. Do każdej próbki dodać świeżą porcję 15 mikrolitrów kulek magnetycznych.Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść próbki na stojaku magnetycznym i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć kulek.Dodaj 200 mikrolitrów 80% świeżo przygotowanego etanolu do każdej z próbek, nie naruszając granulowanych kulek magnetycznych i inkubuj przez 30 sekund. Następnie całkowicie usuń wszelkie ślady etanolu z próbek i wysusz kulki na powietrzu przez pięć minut, ale należy uważać, aby nie przesuszyć kulek. Aby wymyć próbki z kulek, wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego.Dodać 19 mikrolitrów 10-milimolowego tris HCl. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, aby ponownie zawiesić kulki i inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść próbki z powrotem na stojaku magnetycznym i inkubuj je przez pięć minut, aby oddzielić kulki od supernatantu.Ostrożnie wyjmij 15 mikrolitrów supernatantu zawierającego oczyszczone, wybrane pod względem wielkości biblioteki cDNA z probówek i przenieś je do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj pięć mikrolitrów uniwersalnego startera i pięć mikrolitrów unikalnego startera indeksowego do każdej oczyszczonej biblioteki cDNA i dokładnie wymieszaj je przez pipetowanie. Dokładnie sprawdzić mieszaninę wzorcową polimerazy pod kątem kryształów i innych osadów i ręcznie ogrzać mieszaninę główną, aż osady się rozpuszczą.Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszanki polimerazy do próbki. Wymieszać próbkę przez pipetowanie i postępować zgodnie z warunkami cykliczności wymienionymi w dołączonym protokole tekstowym dla amplifikacji PCR. Oczyść końcowe biblioteki, dodając 45 mikrolitrów zawieszonych kulek magnetycznych bezpośrednio do reakcji PCR.Wymieszać je pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść ją w stojaku magnetycznym na pięć minut. Po inkubacji wyrzucić supernatant i przemywać go dwukrotnie świeżo przygotowanym 80% etanolem przez 30 sekund.Po drugim płukaniu całkowicie usunąć etanol z próbki i wysuszyć granulkę na powietrzu przez pięć minut. Następnie eluuj go w 35 mikrolitrach 0,1x TE. Zawiesić kulki przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym przez pięć minut, przenieś 30 mikrolitrów supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Przechowuj biblioteki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po wyizolowaniu RNA na elektroforetogramie widoczne są dwa wyraźne piki rRNA. Fragmentacja RNA spowoduje powstanie od 50 do 70 fragmentów RNA par zasad.Odwrotna transkrypcja w toczeniu się została wykorzystana do wygenerowania cząsteczek cDNA, które składają się z co najmniej trzech tandemowych powtórzeń kolistych matryc RNA. Wybór rozmiaru za pomocą kulek magnetycznych pozwala na oczyszczenie bibliotek o odpowiedniej wielkości. Informacje o sekwencjonowaniu pojedynczej biblioteki C-seq pokazują, że większość powtórzeń ma zwykle długość od 45 do 80 zasad.Około 50% zasad, które zostały zsekwencjonowane, jest częścią tych powtórzeń. Ponieważ większość tych zasad jest obecna w szybkościach, które zawierają trzy powtórzenia lub więcej, liczba unikalnych zasad, które są sekwencjonowane, wynosi około jednej trzeciej całkowitej liczby sekwencjonowanych zasad. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze utrzymywać sterylne środowisko pracy, wolne od RNA, które mogłyby zakłócać pracę. Ważne jest również, aby dokładnie śledzić każdy krok, aby upewnić się, że podczas zabiegu nie zostaną popełnione żadne błędy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć błędy transkrypcji u eukariontów za pomocą testu C-seq.

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Opisujemy podstawowe eksperymentalne podejście do analizy zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo przy użyciu BrUTP metodą TRO (swoistą dla nici) w pączkujących drożdżach. Protokół ten można rozszerzyć o badanie terminacji transkrypcji przez inne polimerazy RNA zarówno u drożdży, jak i wyższych eukariontów.

Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Przedstawiamy szybką i skuteczną metodę wykrywania powszechnych delikatnych pęknięć w miejscu przez natywne γH2A. Immunoprecypitacja chromatyny X (ChIP). Takie podejście znacznie skraca zarówno czas, jak i nakład pracy związany z tradycyjnym γH2A. Testy X ChIP przy zachowaniu wysokiej odtwarzalności i wiarygodności wyników.

Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Poznaj metodę C-seq do pomiaru endogennych błędów transkrypcji w organizmach eukariotycznych. Technika ta wykorzystuje cyrkularyzację RNA i zaawansowaną bioinformatykę do analizy wierności transkrypcji.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Przeglądaj więcej filmów