Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mutagenezy transkrypcyjnej, takie jak to, które podjednostki polimerazy RNA lub procesy biologiczne kontrolują wierność transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na pomiar endogennych błędów transkrypcji w transkryptomach organizmów eukariotycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tym protokole, będą miały trudności ze względu na długość i złożoność testu oraz potrzebę zaawansowanej bioinformatyki w celu interpretacji danych.

Aby rozpocząć protokół, należy cyrkularyzować fragmenty RNA poprzez denaturację termiczną 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Po jednej minucie natychmiast umieścić próbkę na lodzie na dwie minuty. Następnie dodaj cztery mikrolitry 10x buforu ligazy RNA T4, cztery mikrolitry 10 milimolowych ATP, jeden mikrolitr inhibitora RNazy, jeden mikrolitr wody wolnej od nukleaz i osiem mikrolitrów 50% glikolu polietylenowego lub PEG.

Następnie dokładnie wymieszaj próbkę przez wirowanie. Następnie dodaj dwa mikrolitry po 10 jednostek na mikrolitr ligazy RNA T4 jeden. Ponownie wymieszać próbkę pipetując i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny w termocyklerze z temperaturą pokrywki ustawioną na 30 stopni Celsjusza.

Po dwugodzinnej inkubacji dodać do próbki 10 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i oczyścić próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania i zatężania oligo. Eluować próbkę w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Aby odwrócić transkrypcję kolistych cząsteczek RNA, dodaj cztery mikrolitry 10-milimolowych dNTP, cztery mikrolitry 50 nanogramów na mikrolitr losowych heksamerów i dziewięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do dziewięciu mikrolitrów RNA.

Dokładnie wymieszać pipetując i denaturować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Po denaturacji próbkę należy umieścić na lodzie na dwie minuty. Dodać do próbki osiem mikrolitrów 5x buforu do syntezy pierwszej nici, dwa mikrolitry 0,1 milimolowej DTT i cztery mikrolitry 200 jednostek na mikrolitr odwrotnej transkryptazy i wymieszać pipetując.

Inkubować próbkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut z pokrywką ustawioną o pięć stopni Celsjusza powyżej temperatury inkubacji. Następnie inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza pod pokrywką ustawioną na 47 stopni Celsjusza. Eluować próbkę w 42 mikrolitrach roztworu elucyjnego po oczyszczeniu za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratora.

Użyj zestawu do syntezy drugiej nici, aby wygenerować dwuniciową bibliotekę cDNA. Umieść próbki na lodzie i dodaj 30 mikrolitrów wody NF do 38 mikrolitrów próbki. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 10-krotnego buforu drugiej nici i cztery mikrolitry enzymu drugiej nici i wymieszaj próbkę przez delikatne pipetowanie przed inkubacją w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwie i pół godziny.

Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i zagęszczania oligonugody, aby uzyskać 100 mikrolitrów reakcji i eluuj próbki w 38 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Wymieszaj końcową reakcję naprawy przez pipetowanie i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Postępuj zgodnie z inkubacją w temperaturze 20 stopni Celsjusza z 30-minutową inkubacją w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Najpierw rozcieńczyć adaptery do sekwencjonowania nowej generacji dziesięciokrotnie w 10 milimolowym tris HCl do końcowego stężenia 1,5 mikromolowego. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera i jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji do każdej próbki i wymieszaj je przez wirowanie. Następnie dodaj 15 mikrolitrów mieszanki głównej ligazy TA.

Pipetować próbkę w górę i w dół, aby wymieszać i inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj trzy mikrolitry enzymu odczynnika do wycinania swoistego dla uracylu i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu ligacji dodaj do próbki 13,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 100 mikrolitrów i przystąp do wyboru wielkości.

Przyzwyczaj kulki magnetyczne do temperatury pokojowej. Do każdej próbki dodać 30 mikrolitrów zaaklimatyzowanych, ponownie zawieszonych kulek magnetycznych i wymieszać przez pipetowanie. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym na pięć minut, aby oddzielić kulki od supernatantu. Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wyrzuć kulki magnetyczne. Do każdej próbki dodać świeżą porcję 15 mikrolitrów kulek magnetycznych.

Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść próbki na stojaku magnetycznym i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć kulek.

Dodaj 200 mikrolitrów 80% świeżo przygotowanego etanolu do każdej z próbek, nie naruszając granulowanych kulek magnetycznych i inkubuj przez 30 sekund. Następnie całkowicie usuń wszelkie ślady etanolu z próbek i wysusz kulki na powietrzu przez pięć minut, ale należy uważać, aby nie przesuszyć kulek. Aby wymyć próbki z kulek, wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego.

Dodać 19 mikrolitrów 10-milimolowego tris HCl. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, aby ponownie zawiesić kulki i inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść próbki z powrotem na stojaku magnetycznym i inkubuj je przez pięć minut, aby oddzielić kulki od supernatantu.

Ostrożnie wyjmij 15 mikrolitrów supernatantu zawierającego oczyszczone, wybrane pod względem wielkości biblioteki cDNA z probówek i przenieś je do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj pięć mikrolitrów uniwersalnego startera i pięć mikrolitrów unikalnego startera indeksowego do każdej oczyszczonej biblioteki cDNA i dokładnie wymieszaj je przez pipetowanie. Dokładnie sprawdzić mieszaninę wzorcową polimerazy pod kątem kryształów i innych osadów i ręcznie ogrzać mieszaninę główną, aż osady się rozpuszczą.

Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszanki polimerazy do próbki. Wymieszać próbkę przez pipetowanie i postępować zgodnie z warunkami cykliczności wymienionymi w dołączonym protokole tekstowym dla amplifikacji PCR. Oczyść końcowe biblioteki, dodając 45 mikrolitrów zawieszonych kulek magnetycznych bezpośrednio do reakcji PCR.

Wymieszać je pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść ją w stojaku magnetycznym na pięć minut. Po inkubacji wyrzucić supernatant i przemywać go dwukrotnie świeżo przygotowanym 80% etanolem przez 30 sekund.

Po drugim płukaniu całkowicie usunąć etanol z próbki i wysuszyć granulkę na powietrzu przez pięć minut. Następnie eluuj go w 35 mikrolitrach 0,1x TE. Zawiesić kulki przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym przez pięć minut, przenieś 30 mikrolitrów supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Przechowuj biblioteki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po wyizolowaniu RNA na elektroforetogramie widoczne są dwa wyraźne piki rRNA. Fragmentacja RNA spowoduje powstanie od 50 do 70 fragmentów RNA par zasad.

Odwrotna transkrypcja w toczeniu się została wykorzystana do wygenerowania cząsteczek cDNA, które składają się z co najmniej trzech tandemowych powtórzeń kolistych matryc RNA. Wybór rozmiaru za pomocą kulek magnetycznych pozwala na oczyszczenie bibliotek o odpowiedniej wielkości. Informacje o sekwencjonowaniu pojedynczej biblioteki C-seq pokazują, że większość powtórzeń ma zwykle długość od 45 do 80 zasad.

Około 50% zasad, które zostały zsekwencjonowane, jest częścią tych powtórzeń. Ponieważ większość tych zasad jest obecna w szybkościach, które zawierają trzy powtórzenia lub więcej, liczba unikalnych zasad, które są sekwencjonowane, wynosi około jednej trzeciej całkowitej liczby sekwencjonowanych zasad. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze utrzymywać sterylne środowisko pracy, wolne od RNA, które mogłyby zakłócać pracę. Ważne jest również, aby dokładnie śledzić każdy krok, aby upewnić się, że podczas zabiegu nie zostaną popełnione żadne błędy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć błędy transkrypcji u eukariontów za pomocą testu C-seq.