Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii mRNA, takie jak, czy przewidywany in silico cel mRNA może bezpośrednio oddziaływać z określonym mikroRNA komórkowym. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje biotynylowane mimiki do ściągania docelowego mRNA. A te biotynylowane mimiki mają zablokowane kwasy nukleinowe lub chemię mimiczną opartą na LNA, która pomaga w tworzeniu bardzo stabilnych oligonukleotydów o bardzo wysokim powinowactwie, które mogą zwiększyć specyficzność reakcji.

Implikacją tej metodologii jest to, że może ona obejmować zarówno zrozumienie biologii mikroRNA, jak i terapie oparte na mikroRNA. Dzieje się tak głównie dlatego, że wszyscy wiemy, że mikroRNA odgrywają kluczową rolę w każdym aspekcie biologii komórkowej. Tak więc, identyfikując cele mikroRNA, czyli mRNA, z pewnością możemy dostarczyć krytycznej wiedzy, która byłaby ważna dla odkryć i terapii.

Protokół zademonstruje Sabyasachi Dash, doktorant z naszego laboratorium. Aby pokryć kulki magnetyczne streptawidyną, najpierw dokładnie wymieszaj koraliki, aby ponownie zawiesić. Następnie przenieś 30 mikrolitrów zawieszonych kulek do dwumilimetrowej probówki do mikrofugi bez nukleazy.

Pozostaw rurkę wypełnioną magnetycznym zawieszeniem kulki na magnesie na dwie minuty. Po dwóch minutach usuń supernatant za pomocą mikropipety, gdy kulki zostaną przyciągnięte do boku rurki stykającej się z magnesem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania do kulek.

Po dodaniu buforu płuczącego wyjmij rurkę z magnesu. Następnie wiruj koraliki przez 15 sekund, aby je umyć. Następnie przenieś rurkę zawierającą koraliki magnetyczne na magnes na dwie minuty.

Po zakończeniu inkubacji odpipetować supernatant i wyrzucić go. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu uwalniającego RNazę do kulek. Wiruj kulki przez 15 sekund, aby wymieszać roztwór RNazy.

Następnie inkubuj koraliki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach inkubacji przenieś probówkę zawierającą kulki magnetyczne na magnes na dwie minuty. Po inkubacji odpipetować supernatant i wyrzucić go.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu do reprodukcji do kulek i wiruj przez 15 sekund. Po wirowaniu inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach przenieś rurkę z koralikami magnetycznymi na magnes przez dwie minuty.

Po dwóch minutach odpipetować supernatant i wyrzucić go. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego koraliki do koralików. Aby ponownie zawiesić kulki w roztworze blokującym, należy je dokładnie wirować w temperaturze pokojowej przez 15 sekund.

Następnie pozostaw rurkę na rotatorze wielorurowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 16 godzin. Aby przygotować lizat, użyj skrobaka do komórek i zeskrob transfekowane HEK293T komórki pod maską laminarną. Następnie przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki do mikrofuge.

Następnie zawiesinę komórkową należy poddać odwirowaniu w stężeniu 1,500 g przez pięć minut. Po odwirowaniu rozpuść osad komórkowy w 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej utrzymywanym na pH 7,2. Powtórz proces wirowania, aby uzyskać resztkowy granulat wolny od podłoża.

Po zakończeniu wirowania szybko przenieś granulki na lód. Następnie przygotuj świeży bufor do lizy komórek. Po przygotowaniu buforu dodać 260 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy komórek do próbki w probówce do mikrofuge.

Kilkakrotnie odpipetować osad komórkowy do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Aby zlizować komórki, inkubuj probówki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Następnie pozostaw komórki na lodzie.

Powtórz proces wirowania przy 16 000 g przez pięć minut w wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieść supernatant zawierający lizat do sterylnej 1,7 mililitrowej probówki do mikrofuge na lodzie i usunąć osad. Do supernatantu dodać pięć molowych roztworów chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie jednego molowca.

Najpierw przygotuj wysuwany bufor do mycia. Po całonocnej inkubacji po zablokowaniu koralików, przenieś rurkę zawierającą kulki magnetyczne na magnes na dwie minuty. Po okresie inkubacji odrzucić supernatant.

Do kulek dodaj 150 mikrolitrów lodowatego bufora do mycia. Następnie wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 15 sekund. I natychmiast inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 sekund.

Po minucie przenieś rurkę zawierającą kulki magnetyczne na magnes przez dwie minuty. Po okresie inkubacji odrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach kompletnego bufora do płukania.

Po dodaniu chlorku sodu przenieś 300 mikrolitrów lizatu komórkowego do probówki do mikrofugi wypełnionej 300 mikrolitrami kulek. Następnie pozostaw mieszaninę na mieszadle nutacyjnym na godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie przenieś rurkę na magnes na pięć minut.

Po okresie inkubacji odrzucić supernatant. Następnie dodaj 300 mikrolitrów lodowatego kompletnego buforu do płukania w dół do kulek. Po dodaniu buforu wiruj kulki przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść rurkę na magnesie na pięć minut. Po okresie inkubacji odrzucić supernatant. Następnie rozpuść kulki w 100 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i przechowuj na lodzie.

Wyizoluj całkowite RNA z kulek. Następnie rozpuść wyizolowane RNA w 25 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Następnie zmierz stężenie RNA w spektrofotometrze.

Na koniec przygotuj roboczy roztwór podstawowy RNA w stężeniu 50 nanogramów na mikrolitr. Następnie użyj 50 nanogramów całkowitego wyizolowanego RNA do syntezy uzupełniającego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj oligoprimery do końcowej objętości 20 mikrolitrów.

Umieść probówkę PCR na termocyklerze i rozpocznij bieg. Po zakończeniu qPCR przenieś dziewięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej PCR do każdej studzienki płytki. Do każdej studzienki dodaj jeden mikrolitr uzupełniającego DNA, aby uzyskać końcową objętość 10 mikrolitrów.

Następnie użyj żaroodpornej zgrzewarki do płytek PCR, aby uszczelnić płytkę PCR i załadować na termocykler. Następnie uruchom program na termocyklerze. W celu walidacji celów miR-125b bada się poziomy ekspresji docelowych mRNA PARP-1 i p53.

Co ciekawe, poziomy ekspresji mRNA PARP-1 i p53 są stosunkowo wyższe niż mRNA aktyny, która jest kontrolą negatywną. Inne kontrole ujemne użyte w eksperymencie to brak matrycy i trzy podstawowe biotynylowane sekwencje zaszyfrowane. Dodatkowo, trzy główne nieulegające translacji regiony PARP-1 i p53 określone ilościowo, również wykazują różne poziomy amplifikacji.

Jest to w porównaniu z kontrolami negatywnymi, takimi jak aktyna, brak matrycy i trzy podstawowe biotynylowane sekwencje zaszyfrowane. Ta amplifikacja PARP-1 i p53 wskazuje, że są to silne cele komórkowego miR-125b. Po opanowaniu, technika ta, począwszy od posiewu komórek, poprzez transfekcję naśladowców LNA znakowanych biotyną, a skończywszy na analizie PCR, może zostać wykonana w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zweryfikować domniemane cele mRNA w komórkach ssaków. Można to osiągnąć dzięki wysokiemu stosunkowi swoistości do niskiego poziomu szumów poprzez wprowadzenie trzech głównych, znakowanych biotyną, zablokowanych kwasów nukleinowych naśladujących transfekcję w komórkach ssaków. Nie zapominaj, że praca z RNA, zwłaszcza małymi RNA, takimi jak mikro RNA, może być bardzo wrażliwa i podatna na degradację.

Dlatego podczas wykonywania tego testu należy podjąć niezbędne środki ostrożności, takie jak użycie wody wolnej od nukleaz, probówek do mikrofug bez nukleaz i sterylnych, a podczas wykonywania tego testu należy wziąć pod uwagę świeżo przygotowane i odczynniki, aby uzyskać lepszą czułość i lepsze wyniki.