Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, w tym rozwikłać szlaki sygnalizacji komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona żadnych wyrafinowanych, mikroskopijnych podejść. Jest również bardzo szybki, a zatem można go używać do obserwacji dystrybucji białek w komórkach w czasie rzeczywistym.

Ocena i kwantyfikacja partycjonowania błony białka związanego obwodowo jest skomplikowana ze względu na dyfrakcję światła, która powoduje mieszanie się błony plazmatycznej i fluorescencji cytoplazmatycznej pod mikroskopem. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania materiału biologicznego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotowany materiał należy zabarwić barwnikiem FM 4-64 stosując protokół barwienia odpowiedni dla badanego materiału.

W przypadku komórek tytoniowych BY-2 zabarwić 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej 0,2 mikrolitra 10-milimolowego roztworu FM 4-64 w dimetylosulfotlenku. Aby uchwycić jeden równikowy przekrój konfokalny na jedną komórkę, ustaw sekwencyjne skanowanie dwukanałowe dla chromoforu używanego jako znacznik białka i dla FM 4-64. Ustaw także wyższą rozdzielczość optyczną.

Przykładowa konfiguracja to 63-krotny obiektyw zanurzeniowy z olejkiem o aperturze numerycznej 1,3 i rozmiarze obrazu 1 024 na 1 024 piksele. Zainstaluj Fiji ImageJ Distribution i wymagane urządzenie peryferyjne makr. Na Fidżi wybierz wtyczki, następnie makra, a następnie zainstaluj w menu głównym i określ ścieżkę do pobranego pliku za pomocą urządzenia peryferyjnego makr ImageJ.

Zainstaluj oprogramowanie R Project i wymagane pakiety. Uruchom graficzny interfejs użytkownika języka R, wybierz pakiety, a następnie zainstaluj pakiety w menu głównym i określ najbliższe repozytorium oraz pakiet ggplot2 do instalacji. Pobierz urządzenie peryferyjne pakietu języka R.

Zainstaluj je, wybierając pakiety, a następnie zainstaluj pakiety z plików lokalnych. Przetwarzaj obrazy konfokalne markera cytoplazmatycznego. Aby to zrobić, zaimportuj obrazy na Fidżi za pomocą wtyczek, następnie bioformatów, a następnie importera bioformatów z menu Fidżi z ustawieniami domyślnymi.

Uruchom makro opcji importu dla konfiguracji analizy. Aktywuj makro, wybierając ten sam element po kliknięciu menu menu z białkiem peryferyjnym. Zdefiniuj odpowiednią wartość w polu Piksel promienia rozmycia gaussa.

Wpływa to na wygładzenie obrazu i redukcję szumów. Niska wartość jest wystarczająca i nie powoduje utraty informacji o obrazie. Teraz ustaw wartość w pikselu szerokości linii profilu pola.

Grubsza linia powoduje większe wygładzenie krzywych profilu. Zalecana jest wartość domyślna 10 pikseli. Ustaw tytuł obrazu, analizując według definicji przykładowych ograniczników i wyeksportowanych elementów.

Kliknij przycisk OK. Sprawdź analizowanie tytułu w następnym oknie dialogowym i kliknij OK lub wróć, aby zresetować. Następnie wykonaj selekcję liniową w poprzek obszaru błony plazmatycznej w przetwarzanych obrazach i zmierz profile fluorescencji. Aby to zrobić, wybierz linię prostą narzędzia Fidżi z paska narzędzi Fidżi.

Kliknij obraz i przeciągnij linię w poprzek obszaru błony plazmatycznej. Linia musi zaczynać się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej i powinna być prostopadła do błony plazmatycznej. Wybierz regiony z grubszą i bardziej jednorodną warstwą cytoplazmy korowej.

Optymalna długość selekcji liniowej wynosi od pięciu do 10 mikronów. Uruchom makro profilu pobierania, klikając narzędzie do pobierania profilu na pasku narzędzi Fidżi. Zostanie wykonany automatyczny pomiar profili fluorescencji w obu kanałach, a dane zostaną wyświetlone w oknie wyników.

W zależności od indywidualnej zmienności sygnału, należy przyjąć reprezentatywne numery profili dla każdej komórki. Uruchom makro danych profilu wykresu w celu graficznej wizualizacji zmierzonych profili. Ustaw parametr w oknie dialogowym wywoływanego makra.

Pozostaw niezaznaczone pole wyboru Użyj filtrowania dla danych wejściowych. Określ, czy wykres ma być tworzony na podstawie ostatnich danych w oknie wyników z pojedynczego pliku CSV, czy ze wszystkich plików CSV w określonym katalogu, klikając odpowiedni przycisk radiowy. Określ, które współczynniki grupowania będą używane do drukowania, zaznaczając odpowiednie pola wyboru.

Wybierz współczynnik I, jeśli wszystkie profile mają być wyświetlane na unikalnych wykresach. Pola wyboru powinny pozostać niezaznaczone, jeśli wszystkie dane mają być wykreślane na jednym wykresie. Kliknij przycisk OK. Określ ścieżkę i nazwę pliku do zapisania wyników lub ewentualnego importu danych w następnym oknie dialogowym.

Potwierdź analizę, klikając OK w oknach dialogowych, pokazując wykonany kod R. Uruchom makro konfiguracji filtrowania profili, jeśli niektóre wykreślone profile mają nadmierne sygnały w przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub wewnątrzkomórkowej. Następnie ustaw parametry w oknie dialogowym wywoływanego makra.

Dla każdego kanału ustaw odpowiedni próg intensywności w pliku, usuń pomiary z nadmiarem sygnału zewnątrzkomórkowego lub wewnątrzkomórkowego. Określ obszar, w którym zostanie zastosowany próg intensywności w polu o współrzędnych X mniejszych lub większych niż, a następnie kliknij przycisk OK. Uruchom ponownie makro danych profilu wydruku z zaznaczonym polem wyboru Użyj filtrowania dla wprowadzania danych. Teraz dodaj dane z wcześniej zapisanego pliku.

Upewnij się, że wszystkie nieprawidłowe profile zostały pomyślnie usunięte, w przeciwnym razie popraw parametry filtrowania. Uruchom makro tworzenia modelu, aby utworzyć model błony plazmatycznej i rozkładu fluorescencji cytoplazmy na podstawie danych kalibracyjnych. Po ustawieniu parametrów w oknie dialogowym wywoływanego makra zgodnie z opisem w protokole tekstowym kliknij przycisk OK. Określ ścieżkę i nazwę pliku wejściowego w kolejnych oknach dialogowych i potwierdź analizę, klikając OK w oknie dialogowym pokazującym wykonany kod R.

Następnie przetwórz obrazy komórek wyrażających interesujące Cię białko. Zaimportuj obrazy i skonfiguruj analizę jak poprzednio. Wygładzanie i szerokość linii powinny być identyczne.

Przejdź do pomiaru profili. Sprawdź dokładność profili, kreśląc, i w razie potrzeby ustaw filtrowanie, jak opisano wcześniej. Uruchom makro obliczania rozkładu, aby obliczyć podział białka między błoną plazmatyczną a cytoplazmą.

Określ dane wejściowe i źródła modelu, a następnie ustaw filtrowanie danych. Pozostaw to pole wyboru aktywne, aby usunąć wyniki ze zmiennością resztkową większą niż w przypadku, gdy pożądane jest filtrowanie wyników. Określ próg maksymalnej dopuszczalnej zmienności resztkowej, która może być niewyjaśniona przez dekompozycję sygnału pojedynczego pomiaru profilu.

Wybierz przykładowe współczynniki grupowania, które mogą być używane do tworzenia wykresu pudełkowego. Kliknij przycisk OK, określ ścieżki wejściowe lub wyjściowe i potwierdź analizę, klikając przycisk OK w oknie dialogowym wyświetlającym wykonany kod języka R. Pokazano tutaj obraz wybarwionej komórką FM 4-64 wyrażającą białko roślinne, które jest związane z błoną plazmatyczną poprzez N-mirystoylację i oddziaływanie elektrostatyczne z fosfoinozytydami.

Interakcje te zostały eksperymentalnie zaburzone przez wortmanninę. Znaczenie N-mirystoylacji badano poprzez mutację glicyny na drugiej pozycji aminokwasu, która służy jako miejsce N-mirystoylacji. Efekt usunięcia obu zdolności wiązania błony plazmatycznej badano poprzez skrócenie domeny N-końcowej białka.

Otrzymany wykres pudełkowy pokazuje spadek powinowactwa błony komórkowej po mutacji miejsca N-mirystoylacji i po leczeniu farmakologicznym. Ich wzajemne działanie jest porównywalne do efektu usunięcia domeny N-końcowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić główne kroki analizy w odpowiedniej kolejności i jak ustawić ich parametry.

Po tej analizie można zastosować metodę statystyczną, taką jak ANOVA, w celu statystycznej oceny uzyskanych danych. Chociaż metoda ta została opracowana dla komórek zawiesiny roślinnej, można ją również zastosować do innych komórek lub tkanek z gładkimi i wyraźnie rozróżnialnymi błonami plazmatycznymi.