Name: Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę obliczeniową do analizy lokalizacji białek związanych obwodowo z błoną plazmatyczną przy użyciu barwnika FM 4-64 i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia szybką, ilościową ocenę w czasie rzeczywistym bez zaawansowanej mikroskopii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt był wspierany przez NPU I, LO1417 (Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej).

1. Przygotowanie materiału biologicznego
<ol>
	<li>Przygotuj materiał biologiczny wyrażający fluorescencyjnie znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania, a także marker cytoplazmatyczny. Postępuj zgodnie z procedurami wymienionymi we wprowadzeniu.</li>
</ol>
2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa
<ol>
	<li>Materiał przygotowany w sekcji 1 zabarwić barwnikiem FM 4-64 dye7.
	<ol>
		<li>Zastosuj protokół barwienia, który jest odpowiedni dla badanego materiału. W przypadku komórek tytoniowych BY-2 zabarwić 200 μl zawiesiny komórkowej 0,2 μl 10 mM roztworu FM 4-64 w dimetylosulfotlenku. 
		Uwaga: Typowe stężenie barwienia barwnika FM 4-64 wynosi około 10 μM przy użyciu 10 mM roztworu podstawowego w dimetylosulfotlenku. Do prawidłowego barwienia należy stosować najniższe możliwe stężenie FM 4-64 i nie inkubować komórek na lodzie (FM 4-64 i niska temperatura mogą wpływać na właściwości błony plazmatycznej). Natychmiast kontynuuj obserwację za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przerwa między barwieniem a akwizycją obrazu nie powinna być dłuższa niż 10 minut; w przeciwnym razie endocytoza barwnika wpłynie na barwienie FM 4-64.</li>
		<li>Przetwarzaj wiele próbek po kolei i nie plam wszystkich próbek na początku eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uchwyć jeden równikowy przekrój konfokalny na jedną komórkę.
	<ol>
		<li>Ustaw sekwencyjne skanowanie dwukanałowe dla chromoforu używanego jako znacznik białka (musi znajdować się w pierwszym kanale) i FM 4-64 (musi być w drugim kanale). Ustaw wyższą rozdzielczość optyczną (10–20 px/μm). Przykładowa konfiguracja: obiektyw zanurzeniowy 63X, NA 1.3, rozmiar obrazu 1,024 x 1,024 px. Upewnij się, że płaszczyzna błony plazmatycznej jest prostopadła do płaszczyzny przekroju konfokalnego na uzyskanych obrazach.</li>
		<li>Weź co najmniej 20 komórek na próbkę, aby mieć wystarczającą ilość danych do oceny statystycznej (w zależności od zmienności sygnału w przetworzonym materiale).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wymagana instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Zainstaluj Fiji ImageJ distribution8 i wymagane urządzenie peryferyjne makr.
	<ol>
		<li>Pobierz oprogramowanie z witryny https://fiji.sc/#download i zainstaluj je, rozpakowując.</li>
		<li>Uruchom Fiji, klikając dwukrotnie plik "ImageJ(.exe)" w rozpakowanym katalogu "Fiji.app".</li>
		<li>Pobierz urządzenie peryferyjne makra z następującej witryny: 
		http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm.</li>
		<li>Na Fidżi wybierz Wtyczki | Makra | Instalować... w menu głównym i określ ścieżkę do pobranego pliku "Peripheral_.ijm." 
		Uwaga: Na pasku narzędzi Fidżi pojawią się dwa nowe narzędzia zainstalowanego makra "peryferyjnego": "Pobierz narzędzie profilu" i "Menu białek peryferyjnych".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj oprogramowanie R-project 9 i wymagane pakiety.
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami na stronie https://cloud.r-project.org/ instalacji R-project. 
		Uwaga: Ogólna analiza zostanie przeprowadzona na Fidżi. Oprogramowanie R będzie wywoływane tylko wewnętrznie przez makro Fidżi "peryferyjne" podczas obliczeń.</li>
		<li>Uruchom graficzny interfejs użytkownika języka R, wybierz pozycję Pakiety | Zainstaluj pakiet(y)... w menu głównym i określ najbliższe repozytorium i pakiet "ggplot2" do instalacji. 
		Uwaga: Alternatywnie wpisz w wierszu polecenia języka R: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Pobierz urządzenie peryferyjne pakietu języka R z miejsca docelowego: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Zainstaluj je, wybierając pozycję Pakiety | Zainstaluj pakiet(y) z plików lokalnych.... 
		Uwaga: Alternatywnie wpisz w wierszu polecenia języka R tylko to polecenie: 
		install.packages("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo=NULL, type="źródło").</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu na Fidżi
<ol>
	<li>Przetwarzaj obrazy konfokalne markera cytoplazmatycznego.
	<ol>
		<li>Importuj obrazy na Fidżi za pomocą wtyczek | Formaty biologiczne | Importer formatów biologicznych z menu Fidżi z ustawieniami domyślnymi.</li>
		<li>Sprawdź, czy importer formatów biologicznych prawidłowo rozpoznał kalibrację obrazu. Wymiar obrazu wyświetlany w lewym górnym oknie obrazu pola informacyjnego musi być równy oryginalnym wymiarom obrazu.</li>
		<li>Nieprawidłowo skalibrowane obrazy o nieprawidłowych wymiarach należy traktować indywidualnie, np. ustawiając prawidłowe parametry w oknie dialogowym Analizuj | Ustaw skalę... z menu Fidżi: wpisz szerokość obrazu w pikselach w polu Odległość w pikselach, a rzeczywistą szerokość w odpowiedniej jednostce długości w polu Znana odległość). 
		Uwaga: Jeśli pliki LEI Leica LCS są nieprawidłowo skalibrowane, wykonaj krok 4.2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom makro Opcje importu dla konfiguracji analizy. Aktywuj makro na jeden z trzech różnych sposobów: wybierz Wtyczki | Makra | Opcje importu [f1] w głównym menu Fidżi wybierz tę samą pozycję po kliknięciu narzędzia menu Menu białek peryferyjnych lub naciśnij skrót klawiaturowy F1. Ustaw parametr w oknie dialogowym wywoływanego makra.
	<ol>
		<li>W przypadku formatu LEI Leica LCS, nieprawidłową kalibrację należy rozwiązać, aktywując pole wyboru obrazów Leica.lei. Ta opcja poprawnie importuje wymiary obrazu z pliku z rozszerzeniem "lei".</li>
		<li>Zdefiniuj odpowiednią wartość w polu Promień rozmycia gaussowskiego (px). Wpływa to na wygładzenie obrazu i redukcję szumów. Niska wartość (1 px) jest wystarczająca i nie powoduje utraty informacji o obrazie.</li>
		<li>Ustaw wartość w polu Szerokość linii profilu (px). Grubsza linia powoduje większe wygładzenie krzywych profilu. Zalecana jest wartość domyślna 10 pikseli.</li>
		<li>Ustaw analizowanie tytułu obrazu według definicji "Ograniczniki próbki" i "Wyeksportowane elementy"<br />
		Uwaga: Tytuł obrazu (nazwa pliku bez rozszerzenia, np.: "Experiment-1_line-02_cell-11") zostanie podzielony wokół wszystkich znaków wymienionych w polu "Ograniczniki próbki" (np.: "-_") na zestaw elementów ("Eksperyment", "1", "linia", "02", "komórka" i "11"), które mogą być używane jako czynniki grupujące (tożsamość próbki, komórki, linii lub leczenia) w poniższej analizie. Określ, które elementy będą używane, wpisując ich numer sekwencyjny ("0" dla pierwszego elementu) w polu "Wyeksportowane elementy". Użyj formatu rozdzielanego spacjami, np. "3 5". W tym przykładzie elementy "02" i "11" będą określane jako czynniki grupujące o nazwach "Fac_0" i "Fac_1". Dodatkowo, Tożsamość każdego pomiaru będzie określana jako współczynnik "I".</li>
		<li>Alternatywnie pozostaw puste ograniczniki próbki i wprowadź wartość 0 w wyeksportowanych elementach, jeśli pełny tytuł obrazu może zostać zachowany.</li>
		<li>W systemie operacyjnym Windows sprawdź, czy ścieżka do oprogramowania R zostanie poprawnie automatycznie wykryta w polu Ścieżka do R.exe. W przeciwnym razie określ pełną ścieżkę do pliku R.exe w systemie (np. "C:\Program Files\R\bin\R.exe").</li>
		<li>Kliknij przycisk OK. Sprawdź parsowanie tytułu w następnym oknie dialogowym i kliknij OK lub Wróć do resetowania. 
		Uwaga: Wszystkie zdjęcia zostaną automatycznie wygładzone i ostatecznie ponownie skalibrowane. Lista wszystkich wyeksportowanych współczynników grupowania zostanie wyświetlona w oknie Wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj liniową selekcję w poprzek obszaru błony plazmatycznej w przetwarzanych obrazach i zmierz profile fluorescencji.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Fidżi Linia prosta z paska narzędzi Fidżi. Kliknij obraz i przeciągnij linię w poprzek obszaru błony plazmatycznej. Linia musi zaczynać się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej i powinna być prostopadła do błony plazmatycznej. Wybierz regiony z grubszą i bardziej jednorodną warstwą cytoplazmy korowej. Optymalna długość selekcji liniowej wynosi 5 - 10 μm.</li>
		<li>Uruchom makro Pobierz profil analogicznie, jak w kroku 4.2 (skrót "x") lub klikając przycisk Weź profil Tool na pasku narzędzi Fidżi. Zostanie wykonany automatyczny pomiar profili fluorescencji w obu kanałach, a dane zostaną wyświetlone w oknie Wyniki.</li>
		<li>Jeśli użycie "x" jest uważane za nieprzyjazne dla użytkownika, otwórz plik źródłowy makra Peripheral_.ijm w edytorze tekstu, zastąp symbol "x" w wierszu "makro "Weź profil [x]" {' na bardziej korzystny symbol (który nie jest używany w środowisku Fidżi jako aktywny skrót klawiaturowy) i zapisz plik. Zainstaluj ponownie makro (krok 3.1.4) i rozpocznij analizę od importu obrazu.</li>
		<li>W zależności od indywidualnej zmienności sygnału, należy przyjąć reprezentatywne numery profili dla każdej komórki.</li>
		<li>Zapisz dane za pomocą punktu menu Plik | Zapisz jako.... Zawsze używaj rozszerzenia "csv"; Jest to niezbędne do prawidłowego formatowania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom makro Drukuj dane profilu (skrót F5) w celu graficznej wizualizacji mierzonych profili. Ustaw parametr w oknie dialogowym wywoływanego makra.
	<ol>
		<li>Pozostaw pole wyboru Użyj filtrowania dla danych wejściowych? niezaznaczone.</li>
		<li>Określ, czy wykres ma zostać utworzony na podstawie ostatnich danych w oknie Wynik, z pojedynczego pliku CSV czy ze wszystkich plików CSV w określonym katalogu, klikając odpowiedni przycisk radiowy. 
		Uwaga: Jeśli wykres jest tworzony na podstawie ostatnich wyników, dane zostaną najpierw zapisane (okno dialogowe Zapisz jako... zostanie automatycznie aktywowane).</li>
		<li>Określ, które współczynniki grupowania będą używane do kreślenia, zaznaczając odpowiednie pola wyboru. Wybierz współczynnik "i.", jeśli wszystkie profile mają być wyświetlane na unikalnych wykresach. Pola wyboru nie powinny być zaznaczone, jeśli wszystkie dane powinny być wykreślone na jednym wykresie. 
		UWAGA: Wybranie współczynnika grupowania, który nie występuje w przetwarzanych wynikach, powoduje błąd podczas tworzenia wykresu.</li>
		<li>Określ nazwę pliku podczas zapisywania wykresu w polu Przedrostek pliku wyjściowego i zdefiniuj wymiary obrazu wydruku w plikach Wysokość wydruku i Szerokość wydruku. 
		Uwaga: Wynikowy wykres zostanie zapisany w katalogu danych źródłowych jako plik PNG.</li>
		<li>Zaznacz pole wyboru Wyjście PDF?, jeśli może zostać wygenerowany dodatkowy plik wyjściowy PDF.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK. Określ ścieżkę do zapisania wyników lub ewentualnie do importu danych w następnym oknie dialogowym. Potwierdź analizę, klikając OK w oknach dialogowych pokazujących wykonany kod R. 
		Uwaga: Wykres zostanie otwarty w nowym oknie obrazu, a dane wyjściowe analizy R zostaną wyświetlone w oknie tekstowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom makro konfiguracji filtrowania profili (skrót F2), jeśli niektóre wykreślone profile mają nadmierne sygnały w przestrzeni zewnątrzkomórkowej (dla oznakowanego białka) lub w przestrzeni wewnątrzkomórkowej (dla sygnału FM 4-64). Następnie ustaw parametry w oknie dialogowym wywoływanego makra. 
	Uwaga: Filtrowanie umożliwia usuwanie słabych profili zgodnie z maksymalnym dozwolonym progiem intensywności na określonych współrzędnych x.
	<ol>
		<li>Dla każdego kanału ustaw odpowiedni próg intensywności w pliku Usuń pomiary z nadmiarem sygnału zewnątrzkomórkowego (wewnątrzkomórkowego). Określ obszar, w którym zostanie zastosowany próg intensywności w polu o współrzędnych x niższych (większych) niż.</li>
		<li>Uruchom ponownie makro Drukuj dane profilu (krok 4.4) z zaznaczonym polem wyboru Użyj filtrowania dla danych wejściowych?; Upewnij się, że wszystkie nieprawidłowe profile zostały pomyślnie usunięte. W przeciwnym razie popraw parametry filtrowania (krok 4.5.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom makro Utwórz model (skrót F3), aby utworzyć model błony plazmatycznej i rozkładu fluorescencji cytoplazmy na podstawie danych kalibracyjnych. Następnie ustaw parametry w oknie dialogowym wywoływanego makra.
	<ol>
		<li>Określ, czy dane wejściowe mają być filtrowane (krok 4.5), zaznaczając pole wyboru Użyj filtrowania dla danych wejściowych?.</li>
		<li>Określ dane źródłowe analogicznie, jak w kroku 4.4.2.</li>
		<li>Określ interwał, w którym model będzie przewidywany na podstawie definicji wartości "początek", "koniec" i "krok" w μm. 
		Uwaga: Wszystkie pomiary profilu powinny być dłuższe niż określony interwał.</li>
		<li>Określić długości fal maksymalnych wzbudzeń fluorescencji i emisji użytych chromoforów, w odpowiednich polach. Ustaw domyślne ustawienia dla kombinacji GFP i FM 4-64. 
		Uwaga: "GFP" oznacza chromofor używany do znakowania białek (GFP, CFP, YFP itp.), a "FM4" oznacza chromofor używany do barwienia błony plazmatycznej (zwykle FM 4-64).</li>
		<li>Określ pole Prefiks pliku wyjściowego. Prefiks będzie używany do zapisywania wynikowego modelu jako pliku RData w katalogu danych źródłowych.</li>
		<li>Zaznaczyć pole wyboru Drukuj model? Jeśli wymagane jest wyjście graficzne. Wykres zostanie zapisany jako PNG, a także jako plik PDF, jeśli zaznaczone jest pole wyboru Wyjście PDF?.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK. Określ ścieżki wejściowe lub wyjściowe w kolejnych oknach dialogowych i potwierdź analizę, klikając OK w oknie dialogowym pokazującym wykonany kod R. 
		Uwaga: Wykres modelowanego związku cytoplazmatycznego i błonowego fluorescencji białka związanego obwodowo zostanie pokazany w nowym oknie obrazu, a dane wyjściowe analizy R zostaną wyświetlone w oknie tekstowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy komórek wyrażających białko będące przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Zaimportuj obrazy analogicznie, jak w kroku 4.1.</li>
		<li>Skonfiguruj analizę analogicznie, jak w kroku 4.2. Wygładzanie i szerokość linii powinny być identyczne.</li>
		<li>Zmierz profile analogicznie, jak w kroku 4.3.</li>
		<li>Sprawdź dokładność profili, kreśląc (krok 4.4) i w razie potrzeby ustaw filtrowanie (krok 4.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom makro Oblicz rozkład (skrót F4) w celu obliczenia podziału białka między błoną plazmatyczną a cytoplazmą. Postępuj zgodnie z ustawieniem parametrów w oknie dialogowym wywoływanego makra.
	<ol>
		<li>Analogicznie do poprzedniego kroku (krok 4.4) określ źródło danych, filtrowanie i prefiks nazwy pliku.</li>
		<li>Określ, czy model do obliczania rozkładu białek zostanie załadowany z ostatniego obliczenia modelu w ostatnim wystąpieniu makra "Peripheral" na Fidżi (zaznacz pole wyboru Ostatnie wyniki), czy z pliku RData (zaznacz pole wyboru "Z pliku").</li>
		<li>Zachowaj pole wyboru Usuń wyniki ze zmiennością resztkową większą niż aktywna, jeśli wymagane jest filtrowanie wyników. Określ próg maksymalnej dopuszczalnej zmienności resztkowej, która może być niewyjaśniona przez dekompozycję sygnału pojedynczego pomiaru profilu. Na przykład: Wartość 0,200 oznacza, że wszystkie pomiary z niewyjaśnioną zmiennością większą niż 20% całkowitej zmienności intensywności fluorescencji w profilu zostaną odrzucone.</li>
		<li>Wybierz czynniki grupowania próbek, które mogą być używane do tworzenia wykresu skrzynkowego (krok 4.4).</li>
		<li>Aktywuj pole wyboru Wyjście PDF?, aby zapisać wykres skrzynkowy jako plik PDF.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK, określ ścieżki wejściowe lub wyjściowe i potwierdź analizę, klikając przycisk OK w oknie dialogowym pokazującym wykonany kod R. 
		Uwaga: Wykres pudełkowy partycjonowania białek związanych obwodowo między błoną plazmatyczną a cytoplazmą zostanie pokazany w nowym oknie obrazu, a dane wyjściowe analizy R zostaną wyświetlone w oknie tekstowym.</li>
		<li>W celu przetwarzania zewnętrznego zapisz wyniki wyświetlane w oknie Wyniki za pomocą punktu menu Plik | Zapisz jako... w menu okna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li>
<li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23445487">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li>
<li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubitscheck%2C+U+%22Fluorescence+Microscopy%3A+From+Principles+to+Biological+Applications%22">Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2013).</li>
<li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na%2FH+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+%28GFP%29+in+living+PS120+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li>
<li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles%3A+pertinence+to+myristoylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li>
<li>Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li>
<li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).</li>
<li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li>
<li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+a+novel%2C+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li>
<li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDP25%2C+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein%2C+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li>
<li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0074769608624523">Tobacco BY-2 Cell Line as the &#34;HeLa&#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li>
<li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li>
<li>Laňková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda generuje dokładniejsze oszacowanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo w porównaniu z innymi podejściami opartymi na pomiarze intensywności fluorescencji5. Głównym ulepszeniem tej metody jest to, że uwzględnia ona dyfrakcję światła i superpozycję błony plazmatycznej oraz sygnały cytoplazmatyczne. Chociaż wyniki tej metody są skorelowane z wynikami prostej metody opartej na porównaniu intensywności fluorescencji w pozycji błony ze średnim sygnałem...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Białka błony plazmatycznej związane z obwodami są kluczowymi składnikami szlaków sygnalizacji komórkowej. Jedną z ich podstawowych ról jest przejściowa asocjacja i dysocjacja błony plazmatycznej, co jest ważne dla transdukcji sygnału między błoną plazmatyczną a cytoplazmą. Białka błony plazmatycznej związane z obwodem mogą być przyłączone do błony plazmatycznej za pomocą kotwic lipidowych (N-mirystoylacja, S-acylacja lub prenylacja) lub przez domeny wiążące lipidy (oddziałujące z fosforanami fosfatydyloinozytolu, kwasem fosfatydowym itp.).
Właściwości tych białek do wiązania błony plazmatycznej mogą być badane in vivo, np. gdy białko znakowane fluorescencyjnie jest modyfikowane przez mutagenezę kluczowych aminokwasów skierowaną do miejsca, lub gdy jest traktowane różnymi inhibitorami wpływającymi na sygnalizację lipidową. Rozkłady białek błony komórkowej obwodowej są w większości oceniane jakościowo, zwłaszcza w przypadkach, gdy redystrybucja białek jest oczywista. Przedstawiona metoda jest optymalna w sytuacjach, gdy redystrybucja białek jest tylko częściowa i konieczna jest ocena ilościowa. Często stosowane podejście, gdy asocjacja błony plazmatycznej jest szacowana na podstawie obrazów z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej jako stosunek intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej i w cytoplazmie1,2, jest proste, ale nie dokładne. Intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej odzwierciedlają superpozycję sygnału błony plazmatycznej i cytoplazmy spowodowaną dyfrakcją światła charakterystyczną dla danej techniki mikroskopii fluorescencyjnej i zastosowanych elementów optycznych3. W związku z tym sygnał cytoplazmatyczny jest również zawarty w obszarze błony. Z tego powodu wzór barwienia FM 4-64 nie może być używany jako maska do wyboru sygnału membranowego4. Co więcej, proste pomiary sygnału błonowego w pozycji zdefiniowanej przez maksimum barwienia FM 4-64 zawsze systematycznie zawyżają rzeczywisty sygnał plazmato-błonowy obwodowo związanego białka błony plazmatycznej z powodu superpozycji błony i związku cytoplazmatycznego. Maksimum obserwowanych sygnałów dla znakowanych fluorescencyjnie białek związanych obwodowo również nie kolokalizuje się z maksimum markera błony plazmatycznej (tj. barwnika styrylowego FM 4-64), ale jest przesunięte w kierunku cytoplazmy. Kolejne ograniczenie opiera się na fakcie, że pik emisji FM 4-64 jest szerszy w porównaniu z pikami emisji dla białek zielonej fluorescencji, takich jak GFP, ze względu na zależność dyfrakcji światła od długości fali3.
W opisanej tutaj metodzie, sygnał oznaczonego białka jest wyposażony w dwie empiryczne funkcje opisujące hipotetyczny rozkład odpowiednio błony plazmatycznej i sygnału cytoplazmy. Ta dekompozycja sygnału jest stosowana do liniowych profili fluorescencji, które są nakładane na powierzchnię komórki prostopadle do błony plazmatycznej na obrazach źródłowych, które są regularnymi, dwukanałowymi konfokalnymi sekcjami komórek eksprymujących białka znakowane fluorescencyjnie znakowane barwnikiem FM 4-64.
Pierwsza funkcja używana do dopasowania opisuje dyfrakcję sygnału cytoplazmy na krawędzi komórki. Uzyskuje się go z wcześniej nabytych profili fluorescencyjnych, które mierzono w komórkach wyrażających marker białka cytoplazmy znakowany tym samym chromoforem, co białko związane obwodowo z błoną plazmatyczną. Druga funkcja opisująca dyfrakcję sygnału błony plazmatycznej wywodzi się z fluorescencji FM 4-64. Sygnał ten jest najpierw aproksymowany przez funkcję Gaussa, która jest używana do przybliżonego modelowania dyfrakcji światła źródła punktowego. Po drugie, model ten, ważny dla czerwonej emisji FM 4-64, jest matematycznie przekształcany do postaci, która jest istotna dla długości fali emisji chromoforu używanego do znakowania obwodowo związanych białek będących przedmiotem zainteresowania na błonie plazmatycznej. Obie funkcje są znormalizowane przez maksymalne natężenie i średnią od 10% najwyższych wartości odpowiednio dla sygnału FM 4-64 i sygnału białka cytoplazmatycznego. Dzięki tej dekompozycji sygnału (nieliniowej metodzie dopasowania metodą najmniejszych kwadratów) można łatwo i dokładnie oszacować stosunek błony plazmatycznej do frakcji cytoplazmy badanego białka. Rzeczywisty wymiar fizyczny obliczonego współczynnika podziału mieści się w zakresie mikrometrów, ponieważ stężenie objętościowe cytoplazmy jest porównywane ze stężeniem powierzchniowym na błonie plazmatycznej. Określa odległość od błony plazmatycznej do cytoplazmy, w obrębie której zlokalizowana jest taka sama ilość białek, jak w sąsiednim obszarze błony plazmatycznej. Wartość ta jest równoważna współczynnikowi podziału K2 wprowadzonemu wcześniej5. Metoda jest bardzo szybka, wymaga jedynie pojedynczych odcinków konfokalnych uzyskanych za pomocą rutynowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i nie jest wymagająca obliczeniowo. Rdzeń analizy został zaimplementowany w przenośnym pakiecie R, a dodatkowe makro ImageJ zostało napisane w celu zapewnienia graficznego interfejsu użytkownika do uruchamiania analizy z intuicyjnych okien dialogowych. Oprogramowanie i bardziej szczegółowy opis metody (opublikowany wcześniej6) można znaleźć na stronie http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Metoda jest odpowiednia dla izolowanych komórek, protoplastów i tkanek, gdzie błona plazmatyczna poszczególnych komórek jest wyraźnie rozróżnialna, wyrażając fluorescencyjnie oznakowany konstrukt badanego białka związanego obwodowo. Należy użyć chromoforu kompatybilnego z barwieniem FM 4-64. FM 4-64 emituje czerwoną fluorescencję; W związku z tym badane białko może być znakowane białkiem fluorescencyjnym o emisji niebieskiej, zielonej lub żółtej (np. GFP, CFP, YFP). Stabilna transformacja materiału biologicznego jest zalecana, ponieważ umożliwia mniej sztuczne i bardziej powtarzalne obserwacje rozmieszczenia białek. Konieczne jest, aby badane białko miało w miarę jednorodny rozkład cytoplazmatyczny. Lokalizacja białka w retikulum endoplazmatycznym lub innym przedziale błony wewnątrzkomórkowej może dawać sztuczne wyniki.
Dodatkowo, do porównania należy użyć tego samego materiału biologicznego, który wyraża marker cytoplazmatyczny. Komórki mogą być przekształcane przez wolny homofor (ten sam, który jest używany do znakowania białek obwodowych, np. wolnego GFP) lub przez znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania ze zniesioną zdolnością wiązania błony. Zdolność wiązania błony można znieść, na przykład poprzez odcięcie domeny wiążącej błonę lub przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce kluczowych pozostałości aminokwasów (np. miejsc N-mirystoylacji, S-acylacji lub prenylacji itp.).
Dla konfokalnej mikroskopii skaningowej, komórki muszą być oznaczone markerem błonowym, takim jak barwnik FM 4-64. Jeśli barwienie FM 4-64 nie jest odpowiednie dla badanego materiału (ze względu na interferencyjną autofluorescencję, słabą penetrację barwnika itp.), błonę plazmatyczną można znakować np. integralnym białkiem błony plazmatycznej oznaczonym odpowiednim chomoforem (mCherry, RFP itp.). Istotne jest, aby marker miał znikomą lokalizację w przedziałach błony wewnątrzkomórkowej (endomembranach).
Jeśli pracujesz z ustalonymi próbkami i przeciwciałami, można użyć naprawialnego analogu FM 4-64FX lub znakowania błony plazmatycznej przeciwciałem przeciwko odpowiedniemu celowi. W takim przypadku konieczna jest bardzo dokładna ocena wyników, ponieważ procedury utrwalania mogą prowadzić do selektywnej utraty białek zarówno z cytoplazmy, jak i błony komórkowej.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Barwnik błonowy do plazmy</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Rozpuszczalnik barwnikowy</td></tr><tr><td>Zwykły sprzęt (szkiełka mikroskopowe, pipety, końcówki, probówki)</td><td></td><td></td><td>Sprzęt do znakowania komórek i mikroskopii</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>skaningowy</tr><tr><td>Zwykły komputer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Ta metoda zapewnia szybkie podejście do określenia podziału błony plazmatycznej dowolnego fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo za pomocą profili intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej. Zmierzone profile fluorescencji są dopasowywane za pomocą modelu rozkładu fluorescencji błonowej i cytoplazmy wzdłuż linii nałożonej prostopadle do obwodu komórki. Model ten jest zbudowany z wartości intensywności fluorescencji w komórkach referencyjnych wyrażających znakowany fluorescencyjnie marker cytoplazmy i błonie plazmatycznej znakowanej FM 4-64. Metoda może być stosowana do różnych typów komórek i organizmów; Jednak tylko błony plazmatyczne komórek niesąsiadujących ze sobą mogą być oceniane. Ta szybka metoda oparta na mikroskopii nadaje się do eksperymentów, w których oczekuje się subtelnych i dynamicznych zmian markerów związanych z błoną plazmatyczną i należy je określić ilościowo, np. w analizie zmutowanych wersji białek, leczeniu inhibitorami i obserwacjach transdukcji sygnału. Metoda jest zaimplementowana w wieloplatformowym pakiecie R, który jest sprzężony z makrem ImageJ, które służy jako przyjazny dla użytkownika interfejs.

DREPP10 jest specyficznym dla roślin białkiem peryferyjnie związanym z błoną plazmatyczną, które wiąże się z błoną plazmatyczną poprzez N-mirystoilację oraz oddziaływanie elektrostatyczne z fosfatydyloinozytolefosforanami11,12. DREPP został opisany jako komponent mechanizmu sygnalizacji wapniowej w komórce roślinnej, a ponadto oddziałuje z cytoszkieletem13,<sup class="xref...

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, w tym rozwikłać szlaki sygnalizacji komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona żadnych wyrafinowanych, mikroskopijnych podejść. Jest również bardzo szybki, a zatem można go używać do obserwacji dystrybucji białek w komórkach w czasie rzeczywistym.Ocena i kwantyfikacja partycjonowania błony białka związanego obwodowo jest skomplikowana ze względu na dyfrakcję światła, która powoduje mieszanie się błony plazmatycznej i fluorescencji cytoplazmatycznej pod mikroskopem. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania materiału biologicznego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotowany materiał należy zabarwić barwnikiem FM 4-64 stosując protokół barwienia odpowiedni dla badanego materiału.W przypadku komórek tytoniowych BY-2 zabarwić 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej 0,2 mikrolitra 10-milimolowego roztworu FM 4-64 w dimetylosulfotlenku. Aby uchwycić jeden równikowy przekrój konfokalny na jedną komórkę, ustaw sekwencyjne skanowanie dwukanałowe dla chromoforu używanego jako znacznik białka i dla FM 4-64. Ustaw także wyższą rozdzielczość optyczną.Przykładowa konfiguracja to 63-krotny

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj prezentujemy protokoły bezdetergentowej homogenizacji hodowanych komórek ssaków oparte na kawitacji azotu i późniejszym oddzieleniu białek cytozolowych i błonowych przez ultrawirowanie. Metoda ta jest idealna do monitorowania podziału białek błony obwodowej między frakcjami rozpuszczalnymi i błonowymi.

Kawitacja azotu i wirowanie różnicowe pozwalają na monitorowanie dystrybucji białek błony obwodowej w hodowanych komórkach

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj metodę obliczeniową do analizy lokalizacji białek związanych obwodowo z błoną plazmatyczną przy użyciu barwnika FM 4-64 i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia szybką, ilościową ocenę w czasie rzeczywistym bez zaawansowanej mikroskopii.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Przeglądaj więcej filmów