Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek
12 listopada 2020
Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.
Obecny pogląd na boczną organizację błony komórkowej pozostaje niekompletny. Z tego powodu ważne jest, aby wdrożyć kilka nowych innowacyjnych technik, takich jak spektroskopia korelacji fluorescencyjnej z zmiennością plamki. Jest to bardzo potężna technika charakteryzująca się doskonałą rozdzielczością czasową i przestrzenną.
Ponadto jest nieinwazyjny i umożliwia badanie błon komórkowych w warunkach fizjologicznych. Każdego dnia przed przeprowadzeniem eksperymentu otwórz wszystkie przysłony przysłony i użyj miernika mocy do pomiaru mocy lasera przy całkowicie otwartej pierwszej przysłonie. Obróć płytkę do połowy, aby zlokalizować maksymalną moc.
Jeśli moc lasera jest niższa niż zwykle, użyj przysłony, aby sprawdzić wyrównanie i naprzemiennie przesuwaj L1 i M1 w razie potrzeby. Następnie zanotuj wartość mocy w notatniku laboratoryjnym. Aby sprawdzić ścieżkę wykrywania, umieść na obiektywie wodę, szkiełko nakrywkowe i kroplę dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G.
Następnie uruchom oprogramowanie korelatora i zapisz dane. Funkcja automatycznej korelacji powinna wyświetlać niski poziom szumu, mały rozmiar odpadów i wysoką szybkość zliczania na cząsteczkę na sekundę. Aby skalibrować wielkość plamki, umieść szkiełko nakrywkowe zakodowane w kulturze komórkowej na obiektywie do zanurzenia w wodzie i dodaj 200 mikrolitrów dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G do szkiełka nakrywkowego.
Dostosuj moc wiązki laserowej 488 nm do 300 mikrowatów i w oprogramowaniu wybierz port mikroskopu wykrywania oświetlenia svFCS. Włącz APD i otwórz tęczówkę, aż sygnał spadnie, aby uzyskać minimalny rozmiar odpadu lub zamknij go, aby uzyskać większy rozmiar odpadu. Nagraj około 10, 20-sekundowych funkcji automatycznej korelacji, aby poprawić odtwarzalność statystyczną i wyłączyć APD.
W odpowiednim programie do analizy danych sprawdź i odrzuć przebiegi z silnymi wahaniami spowodowanymi agregatami molekularnymi, a następnie dopasuj średnią zachowanej funkcji automatycznej korelacji do modelu dyfuzji 3D, wyodrębnij średni czas dyfuzji z parametrów dopasowania i zapisz dane jako plik TXT. Do analizy svFCS dostosuj wiązkę 488 nanometrów o mocy od dwóch do czterech mikrowatów i równoważ próbki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz port mikroskopu detekcji oświetlenia svFCS i APD.
Następnie wykonaj skanowanie XY i skanowanie Z wybranej komórki. Wybierz błonę plazmatyczną w górnej części komórki, aby zlokalizować punkt konfokalny o maksymalnej intensywności fluorescencji i rozpocznij akwizycję danych. W oprogramowaniu korelatora nagraj jedną serię 20, pięciosekundowych przebiegów.
Po ostatnim uruchomieniu wyłącz APD i odrzuć wszelkie nieoczekiwane przebiegi, jak pokazano. Dopasuj funkcję średniej automatycznej korelacji do dwugatunkowego modelu dyfuzji 2d i zapisz parametry dopasowania do wcześniej zapisanego pliku TXT. Po zarejestrowaniu wszystkich interesujących komórek przeanalizuj co najmniej cztery rozmiary odpadów wahające się od 200 do 400 nanometrów, aby ustalić jedno prawo dyfuzji.
Następnie w MATLAB wybierz folder zawierający wszystkie pliki TXT odpowiadające co najmniej czterem eksperymentom dotyczącym wielkości odpadów i wykreśl czas dyfuzji w stosunku do marnotrawstwa kwadratowego. Na tym rysunku można zaobserwować prawo dyfuzji dla Thy1-GFP wyrażonego w komórkach Cos7. Prawo dyfuzji ma dodatnią wartość czasu zerowego, co wskazuje, że Thy1-GFP jest zamknięty w strukturach nanodomenowych błony plazmatycznej.
W tej analizie leczenie oksydazą cholesterolową komórek wyrażających Thy1-GFP spowodowało przesunięcie wartości zerowej czasu prawa dyfuzji do 7,36 plus minus 1,34 milisekundy. Potwierdzenie, że charakter uwięzienia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratwy lipidowej. Niewielki, ale znaczący spadek całkowitej zawartości cholesterolu zaobserwowano również po leczeniu oksydazą cholesterolową.
Ponieważ enzym ten działa tylko na pulę cholesterolu dostępną na zewnętrznej płatku błony komórkowej, dane te sugerują, że obserwowany spadek cholesterolu jest związany tylko z błoną plazmatyczną i powoduje destabilizację nanodomen tratwy lipidowej. Najważniejszą rzeczą przy podejmowaniu tej procedury jest właściwa kalibracja systemu svFCS i przygotowanie komórek do analizy. svFCS jest doskonałym narzędziem do badania organizacji błon komórkowych.
Jednak może być również używany do analizy dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych. Technika ta może być z powodzeniem zastosowana w biomedycynie w celu określenia wpływu potencjalnych leków na żywe komórki, takie jak komórki nowotworowe.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół budowy mikroskopu do spektroskopii korelacyjnej fluorescencji z wariacją plamki (svFCS), służącego do pomiaru dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej żywych komórek. Technika ta oferuje doskonałą rozdzielczość czasową i przestrzenną, pozostając jednocześnie nieinwazyjną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Lateralna organizacja błony plazmatycznej nie jest w pełni zrozumiała.
- Do uzyskania lepszego wglądu niezbędne są innowacyjne techniki, takie jak svFCS.
- svFCS umożliwia badanie błon komórkowych w warunkach fizjologicznych.
- Prawidłowa kalibracja i przygotowanie komórek są kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie protokołu dla mikroskopii svFCS.
- Pomiar dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej.
- Analiza wpływu cholesterolu na organizację błony.
Zastosowane metody
- Kalibracja systemu svFCS przy użyciu roztworu rodaminy 6G.
- Pozyskiwanie danych poprzez skanowanie w osiach XY oraz Z wybranych komórek.
- Analiza praw dyfuzji z wykorzystaniem programu MATLAB.
- Porównanie parametrów dyfuzji przed i po zastosowaniu oksydazy cholesterolu.
Główne wyniki
- Dyfuzja Thy1-GFP jest ograniczona w obrębie struktur nanodomenowych.
- Opracowanie oksydazą cholesterolu przesuwa wartość czasu zero prawa dyfuzji.
- Zaobserwowano spadek całkowitej zawartości cholesterolu.
- Badanie sugeruje, że cholesterol wpływa na stabilność tratw lipidowych.
Wnioski
- svFCS jest skuteczną metodą badania organizacji błony komórkowej.
- Technika ta pozwala również na analizę dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych.
- Otrzymane wyniki mają znaczenie dla zrozumienia wpływu leków na żywe komórki.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spektroskopia korelacyjna fluorescencji z wariacją plamki (svFCS) umożliwia wysokorozdzielczą analizę dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej w warunkach fizjologicznych, dostarczając kluczowych informacji na temat organizacji błony i dynamiki tratw lipidowych. Możliwość ta wspiera walidację celu poprzez wyjaśnienie biofizycznego kontekstu białek związanych z błoną, co pozwala na ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Nieinwazyjny charakter tej metody oraz jej kompatybilność z żywymi komórkami zwiększają jej przydatność w badaniach przesiewowych przedklinicznych i translacyjnych badaniach nad biomarkerami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ilościową analizę zachowania dyfuzyjnego białek błonowych, takich jak Thy1-GFP, w obrębie struktur nanodomenowych.
- Wartość operacyjna: Ujawnia zależne od cholesterolu ograniczenie dyfuzji (confinement), co umożliwia funkcjonalną walidację powiązań z tratwami lipidowymi.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację celów, których lokalizacja w błonie jest wrażliwa na zaburzenia środowiska lipidowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do screeningu związków poprzez ustalenie podstawowych praw dyfuzji w warunkach fizjologicznych.
- Wynik ilościowy: Generuje powtarzalne pomiary czasu dyfuzji dla różnych rozmiarów talii wiązki, co wspiera standaryzację testu.
- Znaczenie dla screeningu: Wykrywa indukowane przez związki przesunięcia parametrów dyfuzji, co wskazuje na zmiany w organizacji błony lub oddziaływanie z celem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje zaburzenia nanodomen tratw błony plazmatycznej, co jest istotne w patologiach związanych z dysregulacją lipidową.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje z wczesnych etapów odkryć z walidacją przedkliniczną, wykazując, w jaki sposób perturbacje środowiskowe (np. modulacja cholesterolu) zmieniają zachowanie celu.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza odczytów mechanistycznych, które informują kryteria go/no-go w oparciu o odporność celu na perturbacje błonowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
svFCS wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – oferując biofizyczną warstwę charakterystyki, która uzupełnia testy biochemiczne i fenotypowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar współczynników dyfuzji oraz identyfikację populacji molekularnych ograniczonych i mobilnych.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testu poprzez standaryzowaną kalibrację z wykorzystaniem rhodamine 6G oraz walidację integralności ścieżki detekcji.
- Analityka: Dostarcza ilościowe prawa dyfuzji poprzez analizę funkcji autokorelacji w programie MATLAB, co pozwala na porównanie zachowania cząsteczek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany w organizacji błony z efektami funkcjonalnymi, wspierając dopasowanie biomarkerów w sytuacjach, gdy zmiany dyfuzji korelują z odpowiedziami fenotypowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania dynamiki białek błonowych w odniesieniu do wielu celów i linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozstrzygnięcie kwestii uwięzienia w nanoskali i heterogeniczności dyfuzji w błonie plazmatycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej kalibracji mocy lasera, kontroli ścieżki detekcji oraz uśrednianiu funkcji autokorelacji z powtórzeń.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez kwantyfikację stabilności celu w środowiskach błonowych zbliżonych do naturalnych, co zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach wynikających z nieprzewidzianych właściwości biofizycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zależność od integralności tratw lipidowych w kontekście prawidłowej lokalizacji i funkcji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej, bezpieczeństwa pracy z laserami oraz analizy danych spektroskopii korelacyjnej.
- Wymaga dostosowanego mikroskopu fluorescencyjnego z detektorem APD, oprogramowaniem korelatora oraz precyzyjną kontrolą mocy lasera (2–4 µW dla pomiarów svFCS).
- Wymaga standaryzacji protokołów kalibracyjnych pomiędzy zespołami (np. walidacja rozmiaru plamki rodaminy 6G) oraz potoków analizy danych (np. dopasowanie dwuwymiarowych modeli dyfuzji w programie MATLAB).
- Obejmuje kwestie adaptacji do różnych białek błonowych, typów komórek oraz czynników perturbujących innych niż oksydaza cholesterolu.
- Ograniczone koniecznością starannego przygotowania próbek w celu uniknięcia agregatów molekularnych i zapewnienia istotności fizjologicznej podczas równoważenia w temperaturze 37°C.
