Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Obecny pogląd na boczną organizację błony komórkowej pozostaje niekompletny. Z tego powodu ważne jest, aby wdrożyć kilka nowych innowacyjnych technik, takich jak spektroskopia korelacji fluorescencyjnej z zmiennością plamki. Jest to bardzo potężna technika charakteryzująca się doskonałą rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Ponadto jest nieinwazyjny i umożliwia badanie błon komórkowych w warunkach fizjologicznych. Każdego dnia przed przeprowadzeniem eksperymentu otwórz wszystkie przysłony przysłony i użyj miernika mocy do pomiaru mocy lasera przy całkowicie otwartej pierwszej przysłonie. Obróć płytkę do połowy, aby zlokalizować maksymalną moc.

Jeśli moc lasera jest niższa niż zwykle, użyj przysłony, aby sprawdzić wyrównanie i naprzemiennie przesuwaj L1 i M1 w razie potrzeby. Następnie zanotuj wartość mocy w notatniku laboratoryjnym. Aby sprawdzić ścieżkę wykrywania, umieść na obiektywie wodę, szkiełko nakrywkowe i kroplę dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G.

Następnie uruchom oprogramowanie korelatora i zapisz dane. Funkcja automatycznej korelacji powinna wyświetlać niski poziom szumu, mały rozmiar odpadów i wysoką szybkość zliczania na cząsteczkę na sekundę. Aby skalibrować wielkość plamki, umieść szkiełko nakrywkowe zakodowane w kulturze komórkowej na obiektywie do zanurzenia w wodzie i dodaj 200 mikrolitrów dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G do szkiełka nakrywkowego.

Dostosuj moc wiązki laserowej 488 nm do 300 mikrowatów i w oprogramowaniu wybierz port mikroskopu wykrywania oświetlenia svFCS. Włącz APD i otwórz tęczówkę, aż sygnał spadnie, aby uzyskać minimalny rozmiar odpadu lub zamknij go, aby uzyskać większy rozmiar odpadu. Nagraj około 10, 20-sekundowych funkcji automatycznej korelacji, aby poprawić odtwarzalność statystyczną i wyłączyć APD.

W odpowiednim programie do analizy danych sprawdź i odrzuć przebiegi z silnymi wahaniami spowodowanymi agregatami molekularnymi, a następnie dopasuj średnią zachowanej funkcji automatycznej korelacji do modelu dyfuzji 3D, wyodrębnij średni czas dyfuzji z parametrów dopasowania i zapisz dane jako plik TXT. Do analizy svFCS dostosuj wiązkę 488 nanometrów o mocy od dwóch do czterech mikrowatów i równoważ próbki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz port mikroskopu detekcji oświetlenia svFCS i APD.

Następnie wykonaj skanowanie XY i skanowanie Z wybranej komórki. Wybierz błonę plazmatyczną w górnej części komórki, aby zlokalizować punkt konfokalny o maksymalnej intensywności fluorescencji i rozpocznij akwizycję danych. W oprogramowaniu korelatora nagraj jedną serię 20, pięciosekundowych przebiegów.

Po ostatnim uruchomieniu wyłącz APD i odrzuć wszelkie nieoczekiwane przebiegi, jak pokazano. Dopasuj funkcję średniej automatycznej korelacji do dwugatunkowego modelu dyfuzji 2d i zapisz parametry dopasowania do wcześniej zapisanego pliku TXT. Po zarejestrowaniu wszystkich interesujących komórek przeanalizuj co najmniej cztery rozmiary odpadów wahające się od 200 do 400 nanometrów, aby ustalić jedno prawo dyfuzji.

Następnie w MATLAB wybierz folder zawierający wszystkie pliki TXT odpowiadające co najmniej czterem eksperymentom dotyczącym wielkości odpadów i wykreśl czas dyfuzji w stosunku do marnotrawstwa kwadratowego. Na tym rysunku można zaobserwować prawo dyfuzji dla Thy1-GFP wyrażonego w komórkach Cos7. Prawo dyfuzji ma dodatnią wartość czasu zerowego, co wskazuje, że Thy1-GFP jest zamknięty w strukturach nanodomenowych błony plazmatycznej.

W tej analizie leczenie oksydazą cholesterolową komórek wyrażających Thy1-GFP spowodowało przesunięcie wartości zerowej czasu prawa dyfuzji do 7,36 plus minus 1,34 milisekundy. Potwierdzenie, że charakter uwięzienia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratwy lipidowej. Niewielki, ale znaczący spadek całkowitej zawartości cholesterolu zaobserwowano również po leczeniu oksydazą cholesterolową.

Ponieważ enzym ten działa tylko na pulę cholesterolu dostępną na zewnętrznej płatku błony komórkowej, dane te sugerują, że obserwowany spadek cholesterolu jest związany tylko z błoną plazmatyczną i powoduje destabilizację nanodomen tratwy lipidowej. Najważniejszą rzeczą przy podejmowaniu tej procedury jest właściwa kalibracja systemu svFCS i przygotowanie komórek do analizy. svFCS jest doskonałym narzędziem do badania organizacji błon komórkowych.

Jednak może być również używany do analizy dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych. Technika ta może być z powodzeniem zastosowana w biomedycynie w celu określenia wpływu potencjalnych leków na żywe komórki, takie jak komórki nowotworowe.