Name: Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj metodę svFCS do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek. Technika ta pozwala badać organizację błon komórkowych i wpływ cholesterolu na stabilność lipidowych nanodomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SB, SM i DM były wspierane przez fundusze instytucjonalne z CNRS, Inserm i Uniwersytetu Aix-Marseille oraz granty programowe z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR-17-CE15-0032-01 i ANR-18-CE15-0021-02) oraz francuskiego "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW uznaje "BioTechNan", program interdyscyplinarnych środowiskowych studiów doktoranckich KNOW w dziedzinie biotechnologii i nanotechnologii. EB dziękuje za wsparcie finansowe Narodowego Centrum Nauki (NCN) w ramach projektu nr 2016/21/D/NZ1/00285, a także Rządu Francji i Ambasady Francji w Polsce. MŁ dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Ministerstwa Rozwoju (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) oraz Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT porozumiało się ze wsparciem finansowym Narodowego Centrum Nauki (NCN) w ramach projektu nr 2016/21/B/NZ3/00343 oraz Wrocławskiego Centrum Biotechnologii (KNOW).

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ABC+kinases+by+phosphorylation%3A+protein+kinase+C+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm.</a> The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: From model membranes to cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+as+a+membrane-organizing+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts as a membrane-organizing principle.</a> Science. , (2010).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+cell+membrane%3A+Do+proteins+rule+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).</li>
<li>Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluid+-+Mosaic+Model+of+Membrane+Structure%3A+Still+relevant+to+understanding+the+structure%2C+function+and+dynamics+of+biological+membranes+after+more+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).</li>
<li>Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+undergo+hop+diffusion+in+compartmentalized+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Destainville, N., Salomé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. , (1976).</li>
<li>Petrášek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2008).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((40+Years+of+FCS%3A+How+it+all+began%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">40 Years of FCS: How it all began.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Elson, E. L., Magde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+I.+Conceptual+basis+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+II.+An+experimental+realization%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+in+living+cells+observed+by+fluorescence+correlation+spectroscopy+with+one-+and+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation.</a> Biophysical Journal. , (1999).</li>
<li>Bouchaud, J. P., Georges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffusion+in+disordered+media%3A+Statistical+mechanisms%2C+models+and+physical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Reports%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications.</a> Physics Reports. , (1990).</li>
<li>Yechiel, E., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+domains+in+fibroblast+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes.</a> Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).</li>
<li>Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+domains+by+FRAP+experiments+at+variable+observation+areas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas.</a> European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).</li>
<li>Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+K-Ras+and+H-Ras+display+different+interactions+with+saturable+nonraft+sites+at+the+surface+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+corralation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence corralation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ruprecht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contractility+triggers+a+stochastic+switch+to+fast+amoeboid+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Billaudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+plasma+membrane+organization+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).</li>
<li>Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+for+characterizing+plasma+membrane+subdomains+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).</li>
<li>Rege, T. A., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%2C+a+versatile+modulator+of+signaling+affecting+cellular+adhesion%2C+proliferation%2C+survival%2C+and+cytokine%2Fgrowth+factor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).</li>
<li>Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCahuzac%2C+N+%22Blood%22">Blood</a>. , (2006).</li>
<li>Guia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+of+activating+receptors+at+the+plasma+membrane+controls+natural+killer+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance.</a> Science Signaling. 4 (167), 21(2011).</li>
<li>Blouin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation-dependent+IFN-%CE%B3R+partitioning+in+lipid+and+actin+nanodomains+is+critical+for+JAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation.</a> Cell. 166 (4), 920-934 (2016).</li>
<li>Chouaki-Benmansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+regulate+the+TCR%2FCD3+complex+membrane+dynamics+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation.</a> Scientific Reports. , (2018).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+to+determine+diffusion+laws%3A+application+to+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Micro-+and+Nano-Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes.</a> Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).</li>
<li>Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescence+correlation+spectroscopy+enabling+direct+observation+of+spatiotemporal+dependence+of+diffusion+constants+as+an+evidence+of+anomalous+transport+in+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Humpolíčková, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2006).</li>
<li>Benda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+diffusion+coefficients+in+planar+phospholipid+systems+by+confocal+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy.</a> Langmuir. , (2003).</li>
<li>Ganguly, S., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+mimics+the+effect+of+cytoskeletal+destabilization+on+membrane+dynamics+of+the+serotonin1A+receptor%3A+A+zFCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li>
<li>Wenger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+analysis+within+single+nanometric+apertures+reveals+the+ultrafine+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).</li>
<li>Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+intact+living+cell+membranes+with+NSOM+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes.</a> Biophysical Journal. , (2011).</li>
<li>Regmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+optical+nanoantennas+resolve+cholesterol-dependent+nanoscale+heterogeneities+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells.</a> Nano Letters. , (2017).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+in+STED+microscopy%3A+Studying+the+nanoscale+of+lipid+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nanoscale+diffusion+dynamics+in+cellular+membranes+with+super-resolution+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+STED-background+corrected+fitting+model+for+unbiased+STED-FCS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Veerapathiran, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+imaging+FCS+diffusion+law+in+the+presence+of+multiple+diffusive+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+hop+or+not+to+hop%3A+exceptions+in+the+FCS+diffusion+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law.</a> Biophysical Journal. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy implementację modułu svFCS na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym, potężne eksperymentalne podejście do rozszyfrowania dynamiki organizacji błony plazmatycznej w żywych komórkach dzięki analizie prawa dyfuzji FCS. Koncepcyjnie svFCS opiera się na prostej zasadzie: pomiarach korelacji fluorescencji w dziedzinie czasu przy jednoczesnej zmianie wielkości obszaru oświetlenia23. Strategia ta odegrała zasadniczą rolę w dedukowaniu informacji nanoskopowych z pomiarów mikroskopowych, co pomaga rozszyfrować główne elementy fizykochemiczne przyczyniające się do organizacji błony plazmatycznej w stanie ustalonym25 i procesach fizjologicznych 30,31,32,33. Podsumowując, te analizy svFCS jednoznacznie wskazują na istnienie zależnych od lipidów nanodomen w różnych typach komórek i ich bezpośredni wpływ na dostrajanie różnych zdarzeń sygnalizacyjnych.
W tym kontekście istnieją pewne aspekty optyczne, które należy wziąć pod uwagę podczas budowania konfiguracji svFCS, aby zoptymalizować budżet fotonów i zminimalizować aberracje optyczne. Dlatego zalecamy użycie mikroskopu, z którego można wyjąć soczewkę tubusu podczas wykonywania pomiaru svFCS. Co więcej, pojedyncza przysłona odgrywa kluczową rolę w konfiguracji svFCS: zmienia rozmiar wiązki na tylnym otworze obiektywu, bezpośrednio zmieniając w ten sposób efektywny rozmiar talii (tj. efektywną objętość wzbudzenia). Średnica wiązki powinna pasować do tylnej źrenicy obiektywu, aby uzyskać najmniejszy rozmiar w pasie34. Ta opcja, która pomaga dostosować obwód talii, zapewnia optymalizację budżetu fotonowego i jest łatwa do wdrożenia. Wreszcie, wzdłuż ścieżki światła stosuje się minimalną liczbę części optycznych; Im mniej złożony system, tym mniej utraconych fotonów. Wszystkie te opcje znacznie zwiększają niezawodność eksperymentów svFCS.
Jeśli chodzi o sam protokół, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Najważniejsze jest odpowiednie ustawienie ścieżek optycznych, które ma kluczowe znaczenie dla udanych pomiarów svFCS (protokół, sekcja 2). Można to łatwo sprawdzić, analizując sygnał fluorescencyjny z roztworu Rh6G 2 nM, który powinien wynosić ~200 kHz przy oświetleniu laserowym 300 μW. Wszystkie tęczówki powinny być otwarte, a ACF powinny mieć ważną amplitudę (zwykle G0 ~ 1,5–2,0). Kolejny krytyczny punkt dotyczy komórek i ich przygotowania do analizy svFCS (protokół, sekcje 4-8). Ich gęstość musi być dostosowana tak, aby izolowane komórki, które mają być obserwowane, były dostępne do analizy. Nieprzylegające komórki muszą zostać unieruchomione na komorze nakrywkowej za pomocą roztworu poli-L-lizyny. Sygnał fluorescencyjny z znakowania komórek nie powinien być zbyt silny, w przeciwnym razie będzie to skutkowało bardzo płaskimi ACF-ami, które są trudne do dopasowania, a parametry dopasowania obarczone są istotnym błędem. Dodatkowo, niejednorodne znakowanie i agregaty fluorescencyjne w komórkach sprawiają, że pomiary svFCS są niezwykle trudne do interpretacji. Wreszcie, leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na żywotność komórek, a analiza svFCS nie powinna przekraczać jednej godziny po zabiegu. Lepiej jest również rejestrować fluktuacje fluorescencji z górnej błony plazmatycznej, ponieważ nie jest ona przymocowana do podpory i nie ma ryzyka utrudnionej dyfuzji cząsteczek z powodu fizycznych interakcji z podporą.
Technika svFCS poczyniła wystarczające postępy, aby można ją było stosować w różnych podejściach, ze względu na różnorodność modalności regulacji objętości detekcji, co umożliwia badanie różnych procesów biologicznych w żywych komórkach. Alternatywą dla regulacji wielkości objętości wzbudzenia jest zastosowanie zmiennego ekspandera wiązki35. Możliwe jest również proste modulowanie wielkości obszaru oświetlenia poprzez rejestrację sygnału fluorescencyjnego z punktu przecięcia błony plazmatycznej wzdłuż kierunku z36. Można to zrobić na standardowym mikroskopie konfokalnym, dla którego opracowano ramy teoretyczne w celu wyprowadzenia prawa dyfuzji37,38.
Chociaż metoda svFCS oferuje rozdzielczość czasoprzestrzenną, która jest niezbędna do scharakteryzowania niejednorodnej organizacji bocznej błony plazmatycznej, geometryczne tryby uwięzienia nie wykluczają się wzajemnie. Odchylenie t0 w jednym lub drugim kierunku ujawnia wyłącznie dominujący sposób uwięzienia25. Co więcej, kolejnym istotnym ograniczeniem obecnej metody svFCS jest klasyczna granica dyfrakcji optycznej (~200 nm). Jest to bezsprzecznie większe niż domeny ograniczające cząsteczki w błonie komórkowej plazmatycznej. W związku z tym analizę uwięzienia wyprowadza się z wartości t0 , ekstrapolowanej z prawa dyfuzji.
Ta wada została przezwyciężona poprzez wdrożenie alternatywnych metod. Początkowo stosowanie folii metalicznych wierconych za pomocą nanoapertur dawało możliwość oświetlenia bardzo małego obszaru membrany (tj. poniżej granicy dyfrakcji optycznej pojedynczych apertur nanometrycznych o promieniach wahających się od 75 do 250 nm)39. W ten sposób przedstawiono reżim przejściowy przewidziany na podstawie teoretycznego prawa dyfuzji dla organizacji izolowanej domeny, który pozwolił na udoskonalenie charakterystycznego rozmiaru nanometrycznych niejednorodności błon i ilościowe oszacowanie powierzchni zajmowanej przez nanodomeny zależne od lipidów39. Alternatywnie, oświetlenie nanometryczne zostało również opracowane przy użyciu skaningowej mikroskopii optycznejbliskiego pola 40 lub planarnych nanoanten optycznych41. Niedawno, połączenie wymuszonego zubożenia emisji (STED) i FCS dostarczyło potężnego i czułego narzędzia do dokumentowania prawa dyfuzji z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ten STED-FCS daje dostęp do charakterystyki dyfuzji molekularnej w nanoskali zachodzącej w krótkim czasie, umożliwiając badanie dynamicznej organizacji sond lipidowych w błonie plazmatycznej 42,43. Jednak niepełne tłumienie fluorescencji w procesie STED stanowi wyzwanie dla analizy krzywych autokorelacji w FCS.
Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowano nowy model dopasowania, poprawiając dokładność pomiarów czasów dyfuzji i średniej liczby cząsteczek44. Wreszcie, w celu powolnej dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej, zasadę svFCS można zastosować do danych zarejestrowanych za pomocą spektroskopii korelacji obrazu45. Ostatnio wykazano, że połączenie mikroskopii sił atomowych (AFM) z obrazowaniem całkowitego wewnętrznego odbicia-FCS (ITIR-FCS) przyczynia się do udoskonalenia natury mechanizmu utrudniającego dyfuzję molekularną w błonie plazmatycznej, zwłaszcza w pobliżu konfiguracji membrany progowej perkolacji ze względu na dużą gęstość nanodomen46.
Podsumowując, ustalenie prawa dyfuzji przez svFCS dostarczyło dowodów eksperymentalnych pozwalających wywnioskować lokalną heterogeniczność utworzoną przez dynamiczne zbiorowe asocjacje lipidów i białek błonowych. Jak stwierdzili Wohland iwspółpracownicy46, "analiza prawa dyfuzji FCS pozostaje cennym narzędziem do wnioskowania o cechach strukturalnych i organizacyjnych poniżej limitu rozdzielczości na podstawie informacji dynamicznych". Mimo to musimy opracować nowe modele, aby doprecyzować interpretację prawa dyfuzji, co powinno pozwolić na lepsze zrozumienie dynamiki zdarzeń molekularnych zachodzących w błonie plazmatycznej.

Złożoność organizacji błony plazmatycznej 
Obecne rozumienie organizacji błon komórkowych musi uwzględniać kilka aspektów1. Po pierwsze, złożony skład lipidowy różni się nie tylko w zależności od typu komórki, ale także w obrębie pojedynczej komórki (organelle błonowe/błona plazmatyczna). Poza tym związane lub wewnętrzne białka błonowe są w większości zorganizowane w dynamiczne kompleksy multimeryczne, z dużymi domenami rozciągającymi się na zewnątrz błony, co stanowi znacznie większy obszar niż w przypadku samych domen transbłonowych. Co więcej, białka związane z błoną wykazują specyficzne zdolności wiązania lipidów lub interakcji z lipidami, które odgrywają rolę w regulacji funkcji białek. Zależą one bezpośrednio od lokalnego składu i dostępności lipidów2.
Na koniec, obserwuje się znaczny poziom asymetrii między dwoma listkami błonowymi ze względu na wewnętrzną asymetryczną strukturę białek błonowych i rozmieszczenie lipidów. Rzeczywiście, równowaga metaboliczna lipidów między syntezą a hydrolizą, w połączeniu z przerzutkiem lipidów między listkami, generuje taką asymetryczną dystrybucję. Ponieważ każdy transport przez dwuwarstwę jest ograniczony przez darmową energię wymaganą do przemieszczania polarnej grupy głowy przez hydrofobowe wnętrze membran, jest on zwykle wspomagany przez selektywne transportery. Dla każdego typu komórki asymetria ma tendencję do stałego utrzymywania się. Łącznie czynniki te przyczyniają się do bocznej niejednorodności lub podziału błony plazmatycznej3,4.
Wzbogacamy tę reprezentację błony plazmatycznej, biorąc pod uwagę wewnętrzną dyfuzję molekularną wewnątrz i w poprzek dwuwarstwy, co przyczynia się do dynamicznej niejednorodności bocznej w skali od dziesiętnych do setek nanometrów i od mikrosekund do sekund. Na przykład zależne od lipidów nanodomeny błonowe - tak zwane tratwy lipidowe, zdefiniowane jako cholesterol i platformy sygnalizacyjne bogate w sfingolipidy - przyczyniają się do podziału błony plazmatycznej5,6. Jednak obecny pogląd na organizację błon nie ogranicza się tylko do tratw lipidowych. Nanodomeny błonowe są bardziej złożone i niejednorodne pod względem składu, pochodzenia i funkcji. Mimo to ich obecność w błonie plazmatycznej musi być ściśle skoordynowana, a dynamiczne interakcje między białkami i lipidami wydają się być ważne w dystrybucji przestrzennej i modyfikacji chemicznej nanodomen błonowych1,3,7,8.
Zasada svFCS i jej zastosowanie do badania organizacji błony plazmatycznej 
Chociaż poczyniono znaczne postępy w analizie domen błonowych, głównie za pomocą technik biofizycznych, determinanty, które dyktują lokalną organizację błony plazmatycznej, muszą zostać dopracowane z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową. Wyznaczniki oparte na śledzeniu pojedynczych molekuł zapewniają doskonałą precyzję przestrzenną i pozwalają na charakteryzację różnych trybów ruchu9,10,11,12, ale mają ograniczoną rozdzielczość czasową przy klasycznej niskiej liczbie klatek na sekundę kamery i wymagają więcej wysiłku eksperymentalnego, aby zarejestrować znaczną liczbę trajektorii. Alternatywnie, współczynnik dyfuzji składników membrany można ocenić za pomocą odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)13 lub spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)14. Ten ostatni zyskał więcej uwagi, głównie ze względu na jego wysoką czułość i selektywność, mikroskopijną objętość detekcji, niską inwazyjność i szeroki zakres dynamiki15.
Koncepcyjne podstawy FCS zostały wprowadzone przez Magde i współpracowników około 50 lat temu16,17. Opiera się na rejestrowaniu fluktuacji emisji fluorescencji z wysoką rozdzielczością czasową (od μs do s)18. W swojej nowoczesnej wersji pomiary w żywych komórkach są wykonywane przez małą objętość wzbudzenia konfokalnego (~0,3 femtolitra) umieszczoną w obszarze zainteresowania (np. na błonie komórkowej); Sygnał fluorescencyjny generowany przez dyfundujące cząsteczki fluorescencyjne wchodzące i wychodzące z objętości obserwacyjnej jest zbierany z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (tj. czas nadejścia każdego fotonu do detektora). Następnie sygnał jest obliczany w celu wygenerowania funkcji autokorelacji (ACF), z której ekstrahuje się średni czas td (czas dyfuzji), przez który cząsteczka pozostaje w objętości ogniskowej, wraz ze średnią liczbą cząstek (N) obecnych w objętości obserwacyjnej, która jest odwrotnie proporcjonalna do amplitudy ACF. Ten ostatni parametr może być przydatną informacją na temat stężenia cząsteczek w objętości obserwacyjnej.
Od tego czasu, dzięki szybko rozwijającemu się instrumentarium w biofotonice, zaimplementowano coraz większą liczbę modalności FCS, co pozwala na opis dynamicznych zjawisk zachodzących w żywych systemach. Mimo to, gatunek molekularny doświadczyłby bardziej nakładającego się rozkładu wartości współczynnika dyfuzji, co zwykle znajduje odzwierciedlenie w anomalnej charakterystyce dyfuzji, w której cząsteczki dyfundują z nieliniową relacją w czasie19, oraz trudności w zidentyfikowaniu biologicznego znaczenia tej anomalnej subdyfuzji. W przeszłości trudność ta została w pewnym stopniu przezwyciężona poprzez rejestrowanie dyfuzji molekularnej za pomocą FRAP z obszarów o różnych rozmiarach, a nie tylko z jednego obszaru, dostarczając w ten sposób dodatkowych informacji przestrzennych. Umożliwiło to na przykład konceptualizację mikrodomen membranowych20,21,22.
Przełożenie tej strategii na pomiary FCS (tj. tzw. spektroskopię korelacji fluorescencji (svFCS)) zostało ustalone poprzez zmianę wielkości ogniskowej obserwacji, co pozwoliło na rejestrację fluktuacji fluorescencji w różnych skalach przestrzennych23. W ten sposób podejście svFCS dostarcza pośrednich informacji przestrzennych pozwalających na identyfikację i określenie trybów dyfuzji molekularnej oraz rodzaju podziału błony (domeny izolowane kontra domeny ciągłe24) badanych cząsteczek. Wykreślając czas dyfuzji td jako funkcję różnych skal przestrzennych zdefiniowanych przez wartość talii (ω), która odpowiada wielkości promienia wiązki detekcyjnej w tym przypadku23,25, można scharakteryzować prawo dyfuzji danej cząsteczki w danym stanie fizjologicznym. svFCS jest zatem doskonałym odpowiednikiem śledzenia pojedynczych cząstek w dziedzinie czasu26. Zgodnie z ograniczeniem dyfuzji Browna należy spodziewać się ściśle liniowej zależności między czasem dyfuzji td a talią ω (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)23,25. Pochodzenie odchylenia prawa dyfuzji od tego schematu można przypisać niewyłącznym przyczynom, takim jak siatka cytoszkieletu, stłoczenie molekularne, dynamiczne partycjonowanie w nanodomenach lub dowolna kombinacja tych i innych efektów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i musi być przetestowana eksperymentalnie25.
Tutaj zapewniamy wszystkie niezbędne punkty kontrolne do codziennego użytku systemu optycznego svFCS zbudowanego od podstaw, który uzupełnia nasze poprzednie recenzje protokołów27,28 na temat tego eksperymentalnego podejścia. Ponadto, jako dowód słuszności koncepcji, podajemy wytyczne dotyczące kalibracji konfiguracji, przygotowania komórek, pozyskiwania danych i analizy w celu ustalenia prawa dyfuzji svFCS (DL) dla Thy1-GFP, białka zakotwiczonego w błonie komórkowej glikozylofosfatydyloinozytolu, o którym wiadomo, że jest zlokalizowane w nanodomenach tratwy lipidowej29. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób częściowa destabilizacja nanodomen lipidowo-tratwy przez leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na właściwości dyfuzyjne Thy1-GFP. Dodatkowo, szczegółowy opis budowania konfiguracji svFCS od podstaw znajduje się w materiałach uzupełniających.

<table><tbody><tr><td>Narzędzie do zliczania</td><td>Klucz płaski do pierścieni ustalających z gwintem SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa i moduł zliczający pojedyncze fotony (SPCM)</td><td>Moduł zliczający pojedyncze fotony, fotodioda lawinowa</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 & Omega; wtyczka do 50 & Omega; przewód wtykowy 2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>koncentryczny 415 Złącza cinch, RG-316, 50 i Omega; Ze złączem, 1,22 m, RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega; Adapter RF Wtyk BNC do gniazda BNC 0 i rzadko; 1GHz</td><td>RS Components</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Gniazdo Typ E &ndash; Francuski przedłużacz, 230 V</td><td>RS Components</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot, zasilacz wtykowy 6 W 5 V DC, 1,2 A, 1 wyjście Zasilacz impulsowy, typ C</td><td>RS Components</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Oscylator referencyjny zasilający Adapter RF</td><td>RS Components</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Filtrowanie fluorescencyjne</td><td>535/70 ET Pasmo przepustowe, AOI 0&deg; Średnica chrominancji 25 mm</td><td>Filtr AHF</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&deg; Filtr AHF Chroma 25,5 x 36 x 1 mm</td><td></td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Filtr długoprzepustowy, AOI 0&deg; Filtr AHF o średnicy chrominancji 25</td><td></td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Korelator sprzętowy</td><td>80 MHz Korelator cyfrowy</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT sprzężony światłowód, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Bezpieczeństwo laserowe</td><td>Wysokowydajna taśma maskująca, 1" x 180' (25 mm x 55 m) rolka</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Chusteczki do soczewek, 25 arkuszy w broszurze, 5 broszur</td> Laserowe <td>okulary ochronne Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>, jasnopomarańczowe soczewki, 48% przepuszczalności światła widzialnego</td><td>Mikroskop Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td></td><td>Zmotoryzowany mikroskop odwróconej fluorescencji Zeiss Axiovert 200M Precyzyjne i zgrubne ustawianie ostrości, obrót wieżyczki reflektora, obrót głowicy obiektywu, przełączanie portów kamery i wewnętrznych przesłon świetlnych</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.wybrane dla FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm przy D=0,17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Pierścień środkowy W0.8 - W0.8 H "5"</td> <td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Ścieżka optyczna</td><td>D25.4mm Lustro, chronione srebrne</td><td>tholabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=60.0.mm, Widoczne</td><td>achromatyczne Horlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=35.0.mm, Widoczne</td><td>achromatyczne</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &micro; m Otwór otworkowy</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25,4 mm Zamontowany zero, zamówienie 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cube 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Stopień obrotu 56 mm x 26 mm Gwintowany identyfikator</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Kinematyczny uchwyt platformowy</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Regulowany zacisk pryzmatyczny</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Blok belki - obszar aktywny 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M Przysłona</td></tr><tr><td></td><td>irysowa 1 mm do 25 mm Przysłona</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Leworęczny kinematyczny cylindryczny uchwyt</td><td>obiektywu Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td> 1<td>" Uchwyt optyczny, kran M4</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1" Stackable Lens Tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Stackable Lens Mount do 1" optycznej głębokości użytkowej i frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>Uchwyt do układania w stos do 1 "Optyczna głębokość użytkowa 2"</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Małe szyny optyczne 600 mm, metryczne</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600 / M</td></tr><tr><td></td><td>Małe szyny optyczne 75 mm, metryczne</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075 / M</td></tr><tr><td></td><td>Małe szyny optyczne 150 mm, metryczne</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150 / M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Otwór z pogłębieniem 1 "x 1"</td> <td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Nośnik szynowy, prostopadły jaskółczy ogon</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>Precyzyjne mocowanie soczewki translacyjnej do 1-calowych</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12; " (12mm) Stopień translacji jaskółczego ogona</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Zaciski szynowe</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Metryczny stolik translacyjny XYZ (zawiera PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>gumowana tkanina Zestaw</td> sterowników kulkowych <td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>/ 6 narzędzi</td><td>Adapter Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>z zewnętrznymi gwintami M6 x 1,0 i zewnętrznymi gwintami M4 x 0,7</td><td>Podstawa montażowa Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 sztuk</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Mocowanie obiektywu do adaptera optycznego 25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>Kinematyczne mocowanie lustra do optyki 1 cal Silikonowa głowica zasilająca</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>, 400-1100nm, 50mW</td> Uchwyty do słupków <td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm, śruba skrzydełkowa z blokadą sześciokątną, L=50 mm, 5 sztuk</td><td></td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Uchwyt słupka ze sprężynową śrubą skrzydełkową z blokadą sześciokątną, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 50 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, otwór gwintowany M6, 5 sztuk</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 75 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6, 5 sztuk</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Interfejs USB Power and Energy Meter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 30 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6 Rurki</td><td></td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 20 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>Szyna konstrukcyjna o długości 750 mm (skrzynka detekcyjna)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>Szyna konstrukcyjna o długości 350 mm (skrzynka detekcyjna)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>Quick Corner Cube do szyn 25 mm</td> Wspornik kątowy <td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>do szyn 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>tablica plakatowa 20" x 30" (508 mm x 762 mm), grubość 1/16" (1,6 mm), 5 arkuszy</td><td>Zawias Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>do obudów</td> <td>szynowych 25 mmOgranicznik pokrywy Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>do obudów szynowych 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Zestaw z walcowym</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 i zestaw osprzętu</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>Zacisk stołowy, kształt litery L, 5 sztuk</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr>SM1<td></td><td>Membrana przysłony irysowej uruchamiana pierścieniowo (&Oslash; 0,8 - &&Oslash; 12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash; 1" Tarcza wyrównująca z matowego szkła SM1 z ukoszkiem; Otwór 1 mm</td><td></td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>Blat optyczny o strukturze plastra miodu, Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>Wspornik stołu optycznego, Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>Próbka nanopozycjonowania</td><td>Precyzja XYZ Nanopozycjonowanie</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>Cyfrowy wielokanałowy Piezo Co, 3 kanały, -30 do 130 V Złącze Sub-D, Czujniki pojemnościowe,Physik</td> <td>Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>komora temperaturowa</td><td>System inkubatora mikroskopu odwróconego Zeiss 200M MATT BLK</td><td>Digital Pixel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dwukanałowy mikroprocesorowy regulator temperatury</td><td>Cyfrowy piksel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>Dwa moduły</td> <td>grzewcze bez wibracjiCyfrowy</td><td>czujnik temperatury Pixel DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 Piksel</td><td>cyfrowy</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td><silny>odczynniki i materiały biologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hodowla i transfekcja</td><td>komórkowa Komórki Cos7</td><td>ATCC&reg;</td><td>CRL-1651 i handel;</td></tr><tr><td></td><td>8-dołkowe komory Lab-Tek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>Bufor PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>Odczynnik do transfekcji PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Pomiar zawartości cholesterolu</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Inhibitor proteazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Inhibitor fosfatazy Koktajl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Roztwór roboczy</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Czytnik mikropłytek</td><td>Pomiary svFCS Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td></td><td>Bufor HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes Bufor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Cholesterol oksydaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamiczne procesy biologiczne w żywych komórkach, w tym te związane z organizacją błony plazmatycznej, zachodzą na różnych skalach przestrzennych i czasowych, odpowiednio od nanometrów do mikrometrów i od mikrosekund do minut. Tak szeroki zakres procesów biologicznych stanowi wyzwanie dla konwencjonalnych podejść mikroskopowych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę wykonywania pomiarów spektroskopii korelacji fluorescencji ze zmiennością plamki (svFCS) przy użyciu klasycznego mikroskopu fluorescencyjnego, który został dostosowany. Protokół zawiera szczegółową kontrolę wydajności konfiguracji svFCS oraz wytyczne dotyczące pomiarów dyfuzji molekularnej za pomocą svFCS na błonie plazmatycznej żywych komórek w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo przedstawiamy procedurę przerywania nanodomen błony plazmatycznej przez leczenie oksydazą cholesterolową i pokazujemy, w jaki sposób te zmiany w bocznej organizacji błony plazmatycznej mogą zostać ujawnione przez analizę svFCS. Podsumowując, ta metoda oparta na fluorescencji może dostarczyć bezprecedensowych szczegółów na temat bocznej organizacji błony plazmatycznej z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Wyznaczono prawo dyfuzji (DL) dla Thy1-GFP wyrażanego w komórkach Cos-7 (Rysunek 4, czarne kwadraty). Prawo dyfuzji wykazuje dodatnią wartość t0 (19,47 ms ± 2 ms), co wskazuje, że Thy1-GFP jest ograniczony w strukturach nanodomen błony plazmatycznej. Potraktowanie komórek wyrażających Thy1-GFP oksydazą cholesterolu spowodowało przesunięcie wartości t0 dla DL do 7,36 ± 1,34 ms (Rysunek 4, szare kwadraty). Obserwacja ta potwierdza, że charakter ograniczenia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratw lipidowych. Zgodnie z opisanym powyżej testem statystycznym (patrz krok 9.1.3), oba prawa dyfuzji różnią się pod względem wartości t0 i Deff. Dodatkowo oceniono stężenie całkowitego cholesterolu komórkowego w niepotraktowanych komórkach Cos-7 w porównaniu z komórkami traktowanymi COase. Po zastosowaniu COase zaobserwowano niewielki, lecz istotny spadek całkowitej zawartości cholesterolu (Rysunek 5). Ponieważ enzym ten działa wyłącznie na pulę cholesterolu dostępną w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, przyjmujemy, że obserwowany spadek poziomu cholesterolu dotyczy tylko błony plazmatycznej i prowadzi do destabilizacji nanodomen tratw lipidowych.
<img alt="Schematy analizy dyfuzji; równania z wykresami pokazujące czas przejścia w funkcji powierzchni plamki; metoda mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Symulowane prawa dyfuzji w spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) ustalone za pomocą FCS z wariacją wielkości plamki dla różnych form organizacji błony.(Panele górne) Schematyczne przedstawienie organizacji błony — (A) dyfuzja swobodna, (B) bariery sieciowe i (C) uwięzienia w pułapkach/domenach — z narysowaną trajektorią dla pojedynczej cząsteczki (czerwona). Niebieskie okręgi oznaczają przecięcie błony z wiązką lasera o promieniu w talii ω. (Panele dolne) Prawa dyfuzji FCS przedstawione poprzez wykreślenie czasu dyfuzji td jako funkcji kwadratu promienia ω2. Projekcja prawa dyfuzji (zielona przerywana linia) przecina oś czasu w (A) punkcie początkowym (t0 = 0) w przypadku dyfuzji swobodnej; (B) na osi ujemnej (t0 &lt; 0) w obecności barier sieciowych lub (C) na osi dodatniej (t0 &gt; 0) w przypadku występowania pułapek i domen (tratw lipidowych). D to lateralny współczynnik dyfuzji dla ruchu Browna; Deff to efektywny współczynnik dyfuzji; Dmicro to mikroskopowy współczynnik dyfuzji wewnątrz pułapek sieciowych; Din to współczynnik dyfuzji wewnątrz domen; Dout to współczynnik dyfuzji na zewnątrz domen; L to długość boku kwadratowej domeny; a rD to promień domeny kolistej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy He i Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu mikroskopowego z komputerem, systemem DAQ, APD/SPCM, korelatorami; analiza fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczna budowa sterowania sprzętowego svFCS. Komputer steruje wszystkimi urządzeniami za pomocą różnych protokołów komunikacyjnych: szeregowego (mikroskop, zewnętrzna migawka), USB (piezoelektryczny stolik XYZ, korelator) oraz PCI (płyta akwizycyjna). DAQ: płyta akwizycji danych, APD: fotodioda lawinowa, SPCM: moduł zliczania pojedynczych fotonów, DO: wyjście cyfrowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu optycznego z laserem 488nm, drogą wiązki, korelatorami, detektorem APD i systemem obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczne przedstawienie optycznych ścieżek wzbudzenia i emisji w układzie svFCS. Układ svFCS składa się z czterech modułów: (1) kolimacja wyjścia światłowodowego lasera 488 nm, (2) kombinacja płytki półfalowej i polaryzacyjnego dzielnika wiązki służąca do regulacji mocy optycznej, (3) ogniszkowanie wiązki lasera na próbce po przejściu przez zmotoryzowany mikroskop bez soczewki tubusowej oraz (4) detekcja fluorescencji za pomocą ścieżki detekcyjnej typu konfokalnego na fotodiodę lawinową sprzężoną z modułem zliczania pojedynczych fotonów, który przekazuje sygnał do sprzętowego korelatora. Prostota konstrukcji zapewnia systemowi czułość, stabilność i łatwość obsługi (szeroko omówione w Materiałach uzupełniających). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres procesu dyfuzji, równanie: T w zależności od D_eff, schemat porównujący czasy dyfuzji NT i COase." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Prawa dyfuzji svFCS wygenerowane z analizy dyfuzji Thy1-GFP eksprymowanego w komórkach Cos-7. Prawa dyfuzji svFCS dla komórek Cos-7 niepoddanych działaniu czynnika (NT, czarne kwadraty) oraz po traktowaniu oksydazą cholesterolu (COase, szare koła). Wstawka na wykresie przedstawia test statystyczny istotności różnicy między dwoma zaprezentowanymi prawami dyfuzji svFCS (zgodnie z Mailfert et al.28). Wartość testowa (T) powinna być powyżej progu ustalonego na 3,8, gdy oba prawa dyfuzji są różne. Im jest ona wyższa, tym większa jest różnica między prawami dyfuzji. Wartość T jest oznaczona kolorystycznie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy redukcji cholesterolu; NT vs traktowanie COase; istotność statystyczna; analiza biochemiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Porównanie całkowitej zawartości cholesterolu w komórkach Cos-7. Komórki Cos-7 nie były traktowane (NT) lub zostały poddane działaniu 1 U/mL oksydazy cholesterolu (COase) przez 1 h. Dane przedstawiają przykład jednego eksperymentu wykonanego w trzech powtórzeniach. Do oceny różnic statystycznych wykorzystano obustronny, niezależny test t (α=0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela materiałów: Lista elementów optycznych wymaganych do konfiguracji svFCS.
Materiały uzupełniające: Niniejszy dokument opisuje budowę układu svFCS od podstaw. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Obecny pogląd na boczną organizację błony komórkowej pozostaje niekompletny. Z tego powodu ważne jest, aby wdrożyć kilka nowych innowacyjnych technik, takich jak spektroskopia korelacji fluorescencyjnej z zmiennością plamki. Jest to bardzo potężna technika charakteryzująca się doskonałą rozdzielczością czasową i przestrzenną.Ponadto jest nieinwazyjny i umożliwia badanie błon komórkowych w warunkach fizjologicznych. Każdego dnia przed przeprowadzeniem eksperymentu otwórz wszystkie przysłony przysłony i użyj miernika mocy do pomiaru mocy lasera przy całkowicie otwartej pierwszej przysłonie. Obróć płytkę do połowy, aby zlokalizować maksymalną moc.Jeśli moc lasera jest niższa niż zwykle, użyj przysłony, aby sprawdzić wyrównanie i naprzemiennie przesuwaj L1 i M1 w razie potrzeby. Następnie zanotuj wartość mocy w notatniku laboratoryjnym. Aby sprawdzić ścieżkę wykrywania, umieść na obiektywie wodę, szkiełko nakrywkowe i kroplę dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G.Następnie uruchom oprogramowanie korelatora i zapisz dane. Funkcja automatycznej korelacji powinna wyświetlać niski poziom szumu, mały rozmiar odpadów i wysoką szybkość zliczania na cząsteczkę na sekundę. Aby skalibrować wielkość plamki, umieść szkiełko nakrywkowe zakodowane w kulturze komórkowej na obiektywie do zanurzenia w wodzie i dodaj 200 mikrolitrów dwóch nanomolowych roztworów rodaminy 6G do szkiełka nakrywkowego.Dostosuj moc wiązki laserowej 488 nm do 300 mikrowatów i w oprogramowaniu wybierz port mikroskopu wykrywania oświetlenia svFCS. Włącz APD i otwórz tęczówkę, aż sygnał spadnie, aby uzyskać minimalny rozmiar odpadu lub zamknij go, aby uzyskać większy rozmiar odpadu. Nagraj około 10, 20-sekundowych funkcji automatycznej korelacji, aby poprawić odtwarzalność statystyczną i wyłączyć APD.W odpowiednim programie do analizy danych sprawdź i odrzuć przebiegi z silnymi wahaniami spowodowanymi agregatami molekularnymi, a następnie dopasuj średnią zachowanej funkcji automatycznej korelacji do modelu dyfuzji 3D, wyodrębnij średni czas dyfuzji z parametrów dopasowania i zapisz dane jako plik TXT. Do analizy svFCS dostosuj wiązkę 488 nanometrów o mocy od dwóch do czterech mikrowatów i równoważ próbki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz port mikroskopu detekcji oświetlenia svFCS i APD.Następnie wykonaj skanowanie XY i skanowanie Z wybranej komórki. Wybierz błonę plazmatyczną w górnej części komórki, aby zlokalizować punkt konfokalny o maksymalnej intensywności fluorescencji i rozpocznij akwizycję danych. W oprogramowaniu korelatora nagraj jedną serię 20, pięciosekundowych przebiegów.Po ostatnim uruchomieniu wyłącz APD i odrzuć wszelkie nieoczekiwane przebiegi, jak pokazano. Dopasuj funkcję średniej automatycznej korelacji do dwugatunkowego modelu dyfuzji 2d i zapisz parametry dopasowania do wcześniej zapisanego pliku TXT. Po zarejestrowaniu wszystkich interesujących komórek przeanalizuj co najmniej cztery rozmiary odpadów wahające się od 200 do 400 nanometrów, aby ustalić jedno prawo dyfuzji.Następnie w MATLAB wybierz folder zawierający wszystkie pliki TXT odpowiadające co najmniej czterem eksperymentom dotyczącym wielkości odpadów i wykreśl czas dyfuzji w stosunku do marnotrawstwa kwadratowego. Na tym rysunku można zaobserwować prawo dyfuzji dla Thy1-GFP wyrażonego w komórkach Cos7. Prawo dyfuzji ma dodatnią wartość czasu zerowego, co wskazuje, że Thy1-GFP jest zamknięty w strukturach nanodomenowych błony plazmatycznej.W tej analizie leczenie oksydazą cholesterolową komórek wyrażających Thy1-GFP spowodowało przesunięcie wartości zerowej czasu prawa dyfuzji do 7,36 plus minus 1,34 milisekundy. Potwierdzenie, że charakter uwięzienia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratwy lipidowej. Niewielki, ale znaczący spadek całkowitej zawartości cholesterolu zaobserwowano również po leczeniu oksydazą cholesterolową.Ponieważ enzym ten działa tylko na pulę cholesterolu dostępną na zewnętrznej płatku błony komórkowej, dane te sugerują, że obserwowany spadek cholesterolu jest związany tylko z błoną plazmatyczną i powoduje destabilizację nanodomen tratwy lipidowej. Najważniejszą rzeczą przy podejmowaniu tej procedury jest właściwa kalibracja systemu svFCS i przygotowanie komórek do analizy. svFCS jest doskonałym narzędziem do badania organizacji błon komórkowych.Jednak może być również używany do analizy dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych. Technika ta może być z powodzeniem zastosowana w biomedycynie w celu określenia wpływu potencjalnych leków na żywe komórki, takie jak komórki nowotworowe.

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Poznaj metodę svFCS do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek. Technika ta pozwala badać organizację błon komórkowych i wpływ cholesterolu na stabilność lipidowych nanodomen.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów