Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Nasz protokół pomoże odpowiedzieć na pytanie, jaki interakcje między komórkami odpornościowymi mają na funkcjonowanie wysp trzustkowych. Metoda żywego wycinka tkanki trzustkowej pozwala na badanie fizjologii i funkcji wysp trzustkowych przy jednoczesnym zachowaniu tkanek leżących u podstaw patologii i rodzimego mikrośrodowiska. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat procesów chorobowych chorób trzustki, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca typu I i cukrzyca typu II.

Na początek ułóż klocki na uchwycie próbki w taki sposób, aby nie przekraczały szerokości ostrza, upewniając się, że ostrze może przesunąć się do przodu na najmniejszą możliwą odległość, gdy wibratom porusza się powoli. Nałóż linię super kleju na uchwyt próbki, tworząc cienką warstwę za pomocą końcówki dozownika kleju, a następnie odwróć bloki chusteczki na klej tak, aby strona blisko chusteczki była skierowana do góry. Delikatnie dociśnij bloki i pozostaw klej do wyschnięcia na trzy minuty.

Następnie przymocuj płytkę do wibratomu za pomocą i wyreguluj wysokość ostrza oraz przebytą odległość tak, aby ostrze poruszało się na całej długości bloków i ledwo nad nimi. Delikatnie popchnij bloki kleszkami, aby sprawdzić, czy klej wysechł, a następnie napełnij tackę wibratomu schłodzonym roztworem zewnątrzkomórkowym, aż ostrze zostanie pokryte. Ustaw wibratom, aby zrobić plastry o grubości 120 mikrometrów i rozpocznij go, a następnie obserwuj, jak plastry schodzą z bloków tkanki.

Podnieś plastry, gdy odpłyną od bloku, umieszczając pod nimi pędzel lub kleszcze i umieść plastry w buforze wodorowęglanowym Krebsa-Ringera zawierającym trzy milimolowe inhibitory D-glukozy i trypsyny. Umieść płytki zawierające plastry na kołysce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę z prędkością 25 obr./min. Jeśli plastry muszą być przechowywane przez dłuższy czas, umieść je w 15 mililitrach pożywki do hodowli plastrów i umieść płytkę w inkubatorze.

Przygotowane plastry inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do badań tego samego dnia lub przenieść plastry hodowane w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez noc do 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę przed eksperymentem. Włączyć mikroskop co najmniej godzinę przed zapisem i ustawić inkubator na górze stopnia do 37 stopni Celsjusza. Zabezpiecz szklane dno płytki Petriego z plastrem na stoliku.

Ustaw ostrość mikroskopu, ustawiając obiektyw 10X w trybie jasnego pola i zlokalizuj wysepki w trybie jasnego pola, szukając pomarańczowo-brązowych owali w przekroju. Przełącz mikroskop na obrazowanie konfokalne, naciskając przycisk CS na kontrolerze ekranu dotykowego mikroskopu. Aby wyświetlić wysepki za pomocą współczynnika odbicia, włącz detektor laserowy 638 i detektor PMT.

Ustaw moc lasera w zakresie od jednego do 2% i wyłącz filtry wycinające. Użyj lasera 405 nm i detektora PMT, aby obserwować barwienie kwasem nukleinowym. Detektor hybrydowy do wykrywania przeciwciał CD8 oraz detektor laserowy i hybrydowy o długości 488 nanometrów do obserwacji tetrameru insuliny.

Wyśrodkuj interesującą wysepkę w polu widzenia za pomocą pokręteł X i Y kontrolera stage. Po zlokalizowaniu interesującej nas wysepki przełącz się na obiektyw 20X i powiększ ją tak, aby zajęła większość kadru. Weź stos Z wysepki, a następnie znajdź najlepsze sekcje optyczne, w których komórki są żywe, a wszelkie otaczające komórki odpornościowe są w centrum uwagi.

Ustaw mikroskop tak, aby nagrywał w trybie XYZT i zoptymalizuj ustawienia, aby rejestrować stos z wybranych kroków co 20 minut przez kilka godzin. Wyspy trzustkowe w wycinku tkanki trzustki uwidoczniono za pomocą mikroskopii jasnego pola i światła odbitego. Insulina w wysepkach zwiększa ziarnistość i powoduje absorpcję dużych ilości odbitego światła, zwiększając widoczność wysp trzustkowych.

Żywotność żywego wycinka ludzkiej tkanki trzustki oceniano za pomocą barwienia. Żywe komórki są oznaczone kolorem zielonym, a martwe komórki kolorem niebieskim. Innym pozytywnym wskaźnikiem żywotności jest obserwowalna aktywność podstawowa.

Gdy żywy wycinek trzustki został załadowany wskaźnikiem wapnia przepuszczalnym dla komórek, stymulację glukozy zaobserwowano zarówno w plastrach trzustki myszy, jak i ludzi. Określono również ilościowo fluorescencję poszczególnych komórek podczas stymulacji glukozą. Nienaruszone i chore wysepki obserwowano za pomocą barwienia ditizonem i mikroskopii światła odbitego.

Chore wyspy trzustkowe zaczynają tracić ziarnistość z powodu infiltracji komórek odpornościowych i śmierci komórki. Populacje komórek odpornościowych można zidentyfikować za pomocą przeciwciał CD8 i barwienia tetramerem insuliny. Współbarwienie wskazuje, że komórki są efektorowymi limfocytami T, które są specyficznie ukierunkowane na antygen insulinowy.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w tej procedurze, jest trzymanie plastrów w roztworach inhibitora proteazy przez cały czas. Po tej procedurze można przeprowadzić liczne eksperymenty z komórkami odpornościowymi, co pozwala na zbadanie wpływu interakcji komórek odpornościowych i funkcji wysp trzustkowych.