Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej
12 kwietnia 2021
To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.
Nasz protokół pomoże odpowiedzieć na pytanie, jaki interakcje między komórkami odpornościowymi mają na funkcjonowanie wysp trzustkowych. Metoda żywego wycinka tkanki trzustkowej pozwala na badanie fizjologii i funkcji wysp trzustkowych przy jednoczesnym zachowaniu tkanek leżących u podstaw patologii i rodzimego mikrośrodowiska. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat procesów chorobowych chorób trzustki, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca typu I i cukrzyca typu II.
Na początek ułóż klocki na uchwycie próbki w taki sposób, aby nie przekraczały szerokości ostrza, upewniając się, że ostrze może przesunąć się do przodu na najmniejszą możliwą odległość, gdy wibratom porusza się powoli. Nałóż linię super kleju na uchwyt próbki, tworząc cienką warstwę za pomocą końcówki dozownika kleju, a następnie odwróć bloki chusteczki na klej tak, aby strona blisko chusteczki była skierowana do góry. Delikatnie dociśnij bloki i pozostaw klej do wyschnięcia na trzy minuty.
Następnie przymocuj płytkę do wibratomu za pomocą i wyreguluj wysokość ostrza oraz przebytą odległość tak, aby ostrze poruszało się na całej długości bloków i ledwo nad nimi. Delikatnie popchnij bloki kleszkami, aby sprawdzić, czy klej wysechł, a następnie napełnij tackę wibratomu schłodzonym roztworem zewnątrzkomórkowym, aż ostrze zostanie pokryte. Ustaw wibratom, aby zrobić plastry o grubości 120 mikrometrów i rozpocznij go, a następnie obserwuj, jak plastry schodzą z bloków tkanki.
Podnieś plastry, gdy odpłyną od bloku, umieszczając pod nimi pędzel lub kleszcze i umieść plastry w buforze wodorowęglanowym Krebsa-Ringera zawierającym trzy milimolowe inhibitory D-glukozy i trypsyny. Umieść płytki zawierające plastry na kołysce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę z prędkością 25 obr./min. Jeśli plastry muszą być przechowywane przez dłuższy czas, umieść je w 15 mililitrach pożywki do hodowli plastrów i umieść płytkę w inkubatorze.
Przygotowane plastry inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do badań tego samego dnia lub przenieść plastry hodowane w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez noc do 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę przed eksperymentem. Włączyć mikroskop co najmniej godzinę przed zapisem i ustawić inkubator na górze stopnia do 37 stopni Celsjusza. Zabezpiecz szklane dno płytki Petriego z plastrem na stoliku.
Ustaw ostrość mikroskopu, ustawiając obiektyw 10X w trybie jasnego pola i zlokalizuj wysepki w trybie jasnego pola, szukając pomarańczowo-brązowych owali w przekroju. Przełącz mikroskop na obrazowanie konfokalne, naciskając przycisk CS na kontrolerze ekranu dotykowego mikroskopu. Aby wyświetlić wysepki za pomocą współczynnika odbicia, włącz detektor laserowy 638 i detektor PMT.
Ustaw moc lasera w zakresie od jednego do 2% i wyłącz filtry wycinające. Użyj lasera 405 nm i detektora PMT, aby obserwować barwienie kwasem nukleinowym. Detektor hybrydowy do wykrywania przeciwciał CD8 oraz detektor laserowy i hybrydowy o długości 488 nanometrów do obserwacji tetrameru insuliny.
Wyśrodkuj interesującą wysepkę w polu widzenia za pomocą pokręteł X i Y kontrolera stage. Po zlokalizowaniu interesującej nas wysepki przełącz się na obiektyw 20X i powiększ ją tak, aby zajęła większość kadru. Weź stos Z wysepki, a następnie znajdź najlepsze sekcje optyczne, w których komórki są żywe, a wszelkie otaczające komórki odpornościowe są w centrum uwagi.
Ustaw mikroskop tak, aby nagrywał w trybie XYZT i zoptymalizuj ustawienia, aby rejestrować stos z wybranych kroków co 20 minut przez kilka godzin. Wyspy trzustkowe w wycinku tkanki trzustki uwidoczniono za pomocą mikroskopii jasnego pola i światła odbitego. Insulina w wysepkach zwiększa ziarnistość i powoduje absorpcję dużych ilości odbitego światła, zwiększając widoczność wysp trzustkowych.
Żywotność żywego wycinka ludzkiej tkanki trzustki oceniano za pomocą barwienia. Żywe komórki są oznaczone kolorem zielonym, a martwe komórki kolorem niebieskim. Innym pozytywnym wskaźnikiem żywotności jest obserwowalna aktywność podstawowa.
Gdy żywy wycinek trzustki został załadowany wskaźnikiem wapnia przepuszczalnym dla komórek, stymulację glukozy zaobserwowano zarówno w plastrach trzustki myszy, jak i ludzi. Określono również ilościowo fluorescencję poszczególnych komórek podczas stymulacji glukozą. Nienaruszone i chore wysepki obserwowano za pomocą barwienia ditizonem i mikroskopii światła odbitego.
Chore wyspy trzustkowe zaczynają tracić ziarnistość z powodu infiltracji komórek odpornościowych i śmierci komórki. Populacje komórek odpornościowych można zidentyfikować za pomocą przeciwciał CD8 i barwienia tetramerem insuliny. Współbarwienie wskazuje, że komórki są efektorowymi limfocytami T, które są specyficznie ukierunkowane na antygen insulinowy.
Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w tej procedurze, jest trzymanie plastrów w roztworach inhibitora proteazy przez cały czas. Po tej procedurze można przeprowadzić liczne eksperymenty z komórkami odpornościowymi, co pozwala na zbadanie wpływu interakcji komórek odpornościowych i funkcji wysp trzustkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia zastosowanie żywych przekrojów tkanki trzustki do badania fizjologii wysepek trzustkowych i interakcji między wysepkami a komórkami odpornościowymi. Metoda ta umożliwia badanie funkcjonalności wysepek, zachowując ich naturalne mikrośrodowisko.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Komórki wysepek odgrywają kluczową rolę w metabolizmie glukozy.
- Interakcje z komórkami odpornościowymi mogą wpływać na funkcjonowanie wysepek.
- Rozumienie tych interakcji jest niezbędne do rozwiązania problemów związanych z chorobami trzustki.
- Żywe przekroje tkanki utrzymują fizjologiczne konteksty komórek.
Cel badania
- Zbadanie wpływu interakcji komórek odpornościowych na funkcjonowanie wysepek.
- Dostarczenie wglądu w choroby trzustki, takie jak cukrzyca typu I i typu II.
- Opracowanie metody, która zachowuje patologie tkankowe i mikrośrodowiska.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie żywych przekrojów tkanki trzustki.
- Wykorzystanie wibrotoma do precyzyjnego cięcia.
- Zastosowanie mocnego kleju do stabilizacji bloków tkankowych.
- Obserwacja interakcji między wysepkami a komórkami odpornościowymi w czasie rzeczywistym.
Główne wyniki
- Metoda żywych przekrojów tkanki trzustki skutecznie zachowuje fizjologię wysepek.
- Interakcje z komórkami odpornościowymi okazały się znacząco wpływać na funkcjonowanie wysepek.
- To podejście umożliwia badanie leżących u podstaw patologii.
- Uzyskane wglądy mogą wpłynąć na strategie leczenia chorób trzustki.
Wnioski
- Żywe przekroje tkanki trzustki są cennym narzędziem do badania fizjologii wysepek.
- Metoda ta może poprawić zrozumienie interakcji odpornościowych w funkcjonowaniu wysepek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby rozwiązać problemy związane z chorobami trzustki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live pancreatic tissue slices enable direct observation of islet-immune cell interactions within a preserved native microenvironment, offering a physiologically relevant system for mechanistic de-risking in diabetes target validation. This approach supports predictive confidence by maintaining tissue viability and underlying pathologies such as type 1 and type 2 diabetes, allowing R&D teams to assess therapeutic hypotheses in a disease-relevant context. The method bridges discovery biology and translational research by providing quantitative, real-time readouts of islet function and immune cell dynamics critical for go/no-go decisions in early diabetes drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immune cell infiltration and its direct impact on islet granule integrity and insulin release.
- Operational Value: Preserves native tissue architecture and cellular interactions, reducing mechanistic ambiguity in target validation for immunomodulatory diabetes therapies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking immune cell activity to functional islet decline, providing a biomarker-aligned readout for target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts from calcium indicators and insulin tetramer staining to assess dose-dependent compound effects on islet function.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging protocols, ensuring reproducible baseline measurements across experimental runs and model systems.
- Scalability: Compatible with time-lapse microscopy and z-stack acquisition, enabling longitudinal monitoring of immune cell dynamics over several hours.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains underlying pathologies from human and mouse pancreatic tissue, allowing study of type 1 and type 2 diabetes mechanisms in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by preserving intercellular interactions critical for immune-mediated islet dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables visualization of effector T-cell interactions with insulin antigens via CD8 and insulin tetramer co-staining, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The live pancreatic tissue slice method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical research, providing a disease-relevant system that maintains tissue viability and microenvironment for mechanistic studies of islet-immune interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of immune cell impact on islet physiology, clarifying pathways involved in diabetes pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready tissue slices with quantitative outputs from glucose-stimulated calcium flux and insulin tetramer binding, facilitating reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates XYZT time-lapse data and z-stack optical sections, allowing teams to quantify cellular responses and immune cell localization over time.
- Translational Research: Maintains disease-relevant pathologies and native microenvironment, supporting continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying islet function across multiple disease models and therapeutic modalities, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of islet-immune interactions in intact tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled slicing, incubation, and imaging protocols that maintain slice viability and function.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immune cell activity to functional islet decline, reducing late-stage biological risk in diabetes drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to mitigate immune-mediated islet dysfunction in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome sectioning, and confocal microscopy for live imaging of immune cell dynamics.
- Dependent on instrumentation including a vibratome, confocal microscope with laser detectors (405nm, 488nm, 638nm), and stage-top incubator for environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, buffer composition (Krebs-Ringer bicarbonate with D-glucose and trypsin inhibitor), and incubation conditions to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems (human vs. mouse) or disease states (T1D vs. T2D) to maintain tissue viability and pathological relevance.
- Includes practical limitations such as the need for protease inhibitors to preserve slice integrity and the technical challenge of maintaining optical clarity during long-term time-lapse imaging.
