Name: Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Odkryj metodę mikroskopii fluorescencyjnej TIRFM do badania interakcji DNA-białko na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół wykorzystuje modyfikowane DNA λ i białka znakowane kropkami kwantowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Hasanowi Yardimci i dr Sevimowi Yardimci z Instytutu Francisa Cricka za życzliwą pomoc w eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami, dr Danielowi Duzdevichowi z laboratorium dr Erica C. Greene'a z Uniwersytetu Columbia, dr Yujie Sun z Uniwersytetu Pekińskiego i dr Chunlai Chen z Uniwersytetu Tsinghua za przydatną dyskusję. Badanie to było wspierane przez National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS Interdisciplinary Innovation Team oraz Newton Advanced Fellowship (NA140085) z Royal Society.

1. Przygotowanie substratu DNA λ-ARS317
<ol>
	<li>Budowa i pakowanie substratów DNA
	<ol>
		<li>Trawić natywne λ DNA za pomocą enzymu XhoI; amplifikować fragment DNA o długości 543 pz zawierający ARS317 z genomowego DNA pączkujących drożdży przy użyciu starterów zawierających 20 pz homologicznych sekwencji przed i za miejscem enzymu XhoI na DNA lambda. Dodać 100 ng roztrawionego λ DNA XhoI i 10 ng fragmentu DNA do 10 μl homologicznego systemu reakcji rekombinacji i inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Aby zapakować rekombinację λ DNA, dodać 25 μl ekstraktów z opakowania lambda do produktu rekombinacji i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Następnie dodać dodatkowe 25 μl ekstraktów z opakowań lambda do probówki reakcyjnej. Kontynuować inkubację reakcji w temperaturze 30 °C przez 90 minut.</li>
		<li>Dodać 500 μl sterylnego buforu rozcieńczającego (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) do układu reakcyjnego i delikatnie wymieszać, kilkakrotnie obracając probówkę do góry dnem. Dodać 25 μl chloroformu, delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 100 μl pakowanego faga i 100 μl LE392MP bakteryjnego (hodowanego w temperaturze 0,8 - 1,0 przy użyciu pożywki LB, dodając 10 mMMgSO4) do nowej probówki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 200 μl mieszaniny fagów i bakterii do 4 ml agaru (pożywka LB + 0,7% agar + 10 mMMgSO4, schłodzona do 48 °C). Natychmiast wymieszaj, kilkakrotnie obracając probówkę do góry nogami i wylej ją na wstępnie podgrzany (37 °C) talerz LB.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc i przesiewać blaszkę λ-ARS317 za pomocą PCR i sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie substratu DNA z ciekłych lizatów11,18
	<ol>
		<li>Pobrać jedną płytkę do 200 μl sterylnego ddH2O z 10 mM MgCl2 i 10 nM CaCl2. Wymieszać z 200 μl LE392MP bakterii (hodowanych przez noc w pożywce LB) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Mieszaninę fagów i bakterii dodać do 100 ml pożywki NZCYM (10 g/l NZ-aminy, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl, 1 g/l hydrolizatu Casamino i 2 g/l MgSO4·7H2O) i hodować przez 7 godzin w temperaturze 37 °C. Dodać 250 μl chloroformu do kultury i wstrząsać przez kolejne 10 minut.</li>
		<li>Przenieść kulturę do kolby o pojemności 200 ml. Dodać 5,8 g NaCl (1 M stężenie końcowe), wymieszać do rozpuszczenia ręcznie i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatant do kolby o pojemności 200 ml i dodać 10% PEG8000 (m/V). Mieszać do rozpuszczenia za pomocą mieszadła magnetycznego i inkubować na lodzie przez 30 minut lub dłużej.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia bakteriofaga. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 2 ml buforu rozcieńczającego fagi. Przenieś go do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 μl RNazy (końcowe stężenie wynosi 20 μg/ml) i 40 μl DNazy (końcowe stężenie wynosi 5 μg/ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać 2 ml 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 μL proteinazy K (końcowe stężenie to 10 μg/mL). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 2 ml wstępnie schłodzonego octanu potasu (3 M, pH 4,8) i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnych.</li>
		<li>Dodać 0,7x objętość izopropanolu do supernatantu. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę do góry nogami i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia DNA. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Przemyć DNA raz 70% etanolem przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Delikatnie eluuj DNA za pomocą 500 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) i przenieś DNA do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dwukrotnie ekstrahować DNA za pomocą fenolu: chloroformu przez odwirowanie w stężeniu 8 000 g przez 10 minut.</li>
		<li>Wytrącić się za pomocą izopropanolu o objętości 0,7x. Wymieszać, delikatnie obracając probówkę do góry nogami i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Umyć raz 70% etanolem, ponownie zawiesić w 200 μl TE. Zmierzyć stężenie DNA i przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 12,5 μg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. biotynylacja DNA λ-ARS317
<ol>
	<li>Aby fosforylować biotynylowane oligonukleotydy (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotyna-3') komplementarne do lewego końca natywnego λ DNA, dodaj 1 μl (100 μM) oligonukleotydów, 7,5 μl ddH2O, 1 μl 10x buforu ligazy i 0,5 μl T4 PNK. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Aby ufosforylować λ-ARS317, dodać 12,5 μg λ-ARS317, 3 μl 10x buforu ligazy, 1 μL T4 PNK i ddH2O do całkowitej objętości 30 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Do wyżarzanych oligonukleotydów z λ-ARS317 dodać 0,5 μl fosforylowanych oligonukleotydów, 195 μl ddH2O, 25 μl buforu 10×ligazy do fosforylowanej probówki λ-ARS317. Delikatnie wymieszać, odwracając probówkę do góry dnem i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Wyłączyć grzałkę bloku i pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury poniżej 33 °C w bloku.</li>
	<li>Aby podwiązać oligonukleotydy λ-ARS317, dodaj 1 μl ligazy DNA T4 i 0,63 μl ATP (200 mM). Delikatnie wymieszać, obracając probówkę do góry dnem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub 4 °C przez noc. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc. 
	UWAGA: Aby uniknąć rozpadu DNA, wszystkie etapy mieszania należy wykonać, delikatnie obracając probówkę do góry nogami, zamiast mieszać za pomocą pipet.</li>
</ol>
3. Czyszczenie i funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Umieść 20 szkiełek nakrywkowych w 4 słoikach do barwienia (5 szkiełek nakrywkowych/słoik), sonikuj przez 30 minut w etanolu i spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2O3 razy.</li>
		<li>Sonikować przez 30 minut 1 M wodorotlenkiem potasu (KOH) i przepłukać szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2O3 razy. Powtórz raz sonikację etanolu i KOH.</li>
		<li>Sonikować acetonem przez 30 minut, a następnie dokładnie spłukać ultraczystymH2O(co najmniej 3 razy). 
		UWAGA: Aceton musi być dokładnie usunięty przez płukanie ultraczystymH2O, ponieważ może to spowodować wybuch, gdy rozpuszczalnik organiczny (taki jak aceton) zostanie omyłkowo zmieszany z roztworem piranii14.</li>
		<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (mieszanina 3:1H2SO4 i 30%H2O2) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Roztwór Pirania jest wysoce energetyczny i erozyjny, więc używaj go ostrożnie. Przygotowując roztwór piranii, należy najpierw dodać 50 mlH2O2do szklanej zlewki o pojemności 500 ml, a następnie powoli dodać 150 mlH2SO4 do zlewki.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe spłukać ultraczystymH2O5 razy. Następnie dokładnie umyć każde szkiełko nakrywkowe ultraczystymH2Oza pomocą 3 zlewek wypełnionych ultraczystymH2Oi wysuszyć szkiełko nakrywkowe papierem od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko nakrywkowe w słoiku do barwienia i dokładnie wysusz je w piekarniku o temperaturze 110 °C przez 30 minut.
		<ol>
			<li>Opłucz szkiełko nakrywkowe metanolem i ponownie umieść słoik do barwienia w piekarniku o temperaturze 110 °C, aby dokładnie wysuszyć szkiełko nakrywkowe. 
			UWAGA: Dokładne wysuszenie szkiełka nakrywkowego jest bardzo ważne, ponieważ APTES będzie miał wiele możliwych struktur powierzchni, gdy znajdzie się w obecności wody19.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalizacja szkiełka nakrywkowego
	<ol>
		<li>Dodaj 70 ml roztworu silanu (93% metanolu, 5% octu i 2% APTES) do każdego słoika, zakręć nakrętkę i pozostaw słoik w temperaturze pokojowej na noc.</li>
		<li>Umyj i wysusz szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w kroku 3.1.5, z wyjątkiem dokładnego wysuszenia szkiełek nakrywkowych przy użyciu gazowego azotu zamiast umieszczania ich w suszarce.</li>
		<li>Dokładnie rozpuścić 150 mg mPEG (glikolu metoksypolietylenowego) i 6 mg biotyny-PEG (glikolu biotynowo-polietylenowego) w 1 ml 0,1 M świeżo wytworzonego NaHCO3 (pH 8,2). Następnie odwirować przy 17 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia nierozpuszczalnych PEG. 
		UWAGA: Świeżo przygotowany NaHCO3 jest gotowy; nie ma potrzeby dostosowywania jego pH.</li>
		<li>Umieść silanizowane szkiełka nakrywkowe w pudełkach i połóż dwa małe szkiełka nakrywkowe na dwóch końcach silanizowanych szkiełek nakrywkowych. Odpipetować 100 μl roztworu PEG na środku silanizowanego szkiełka nakrywkowego i umieścić kolejne silanizowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu.</li>
		<li>Dodaj trochę ultraczystegoH2Odo pudełka, aby było wilgotne, i inkubuj szkiełka nakrywkowe z roztworem PEG przez co najmniej 3 godziny w ciemności. Inkubacja przez noc również może zadziałać.</li>
		<li>Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i trzymaj funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry, dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2Oi wysusz je gazowym azotem.</li>
		<li>Zaznacz funkcjonalizowaną stronę szkiełek nakrywkowych na jednym z rogów za pomocą markera, trzymaj funkcjonalizowaną stronę do góry, umieść je w pudełkach i przechowuj pudełka w eksykatorze próżniowym przez 1 miesiąc.</li>
		<li>Aby przechowywać szkiełka nakrywkowe przez dłuższy czas, umieść jedno szkiełko nakrywkowe w probówce o pojemności 50 ml wywierconej z jednym otworem w nakrętce, a następnie włóż probówkę do plastikowej torby i zamknij torebkę za pomocą zgrzewarki próżniowej. W ten sposób szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez około 3 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zespół komory przepływowej
<ol>
	<li>Wytnij kanał 15 mm × 2 mm na środku kawałka taśmy dwustronnej (30 mm × 12 mm) za pomocą dziurkacza.</li>
	<li>Odklej papierową stronę taśmy dwustronnej i wklej ją na szkiełko podstawowe z dwoma otworami. Naciśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Z naszego doświadczenia wynika, że łatwiej jest usunąć pęcherzyki powietrza poprzez odklejenie strony papierowej niż plastikowej strony taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Pokrój funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe (60 mm × 24 mm) na cztery części (30 mm × 12 mm) za pomocą rysika szklanego z diamentową końcówką i usuń zanieczyszczenia za pomocą gazowego azotu. Pamiętaj, aby trzymać funkcjonalną stronę do góry.</li>
	<li>Odklej plastikową stronę taśmy dwustronnej i wklej szkiełko na funkcjonalizowany szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a taśmą. Dokładne usunięcie pęcherzyków powietrza może uchronić komorę przepływową przed wyciekiem podczas pompowania do niej.</li>
	<li>Włóż rurki dolotowe i wylotowe odpowiednio do małych i dużych otworów. Zamocuj rurkę za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Przepompować 20 μl streptawidyny (0,2 mg/ml) do komory przepływowej za pomocą strzykawki ręcznie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie pompuj bufor blokujący 10 do komory przepływowej, aby zastąpić streptawidynę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Wizualizacja pojedynczej cząsteczki
<ol>
	<li>Uzyskaj wyrównanie ogniskowej czerwieni i dalekiej czerwieni za pomocą A5 na szkiełku testowym mikroskopu fluorescencyjnego #1 poprzez jednoczesne wzbudzenie za pomocą lasera 532 nm i lasera 640 nm. Twórz obrazy o podwójnej długości fali z układem optycznym rozdzielającym (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieścić celę przepływową na mikroskopie i podłączyć jej rurkę wylotową do dłuższej rurki łączącej się ze sprężyną o pojemności 10 ml zainstalowaną na automatycznej programowalnej pompie do infuzji/odstawienia. 
	UWAGA: Pompowanie do komory przepływowej wymienionej poniżej oznacza wycofanie z rurki wlotowej komory przepływowej do strzykawki.</li>
	<li>Pompuj bufor blokujący o wydajności 500 μl/min do komory przepływowej, aby szybko usunąć powietrze i zapewnić odblokowanie bufora w komorze przepływowej. Następnie pompuj bufor blokujący z prędkością 200 μl/min do komory przepływowej i odwróć rurkę wylotową, aby dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza z rurki dolotowej i komory przepływowej. 
	UWAGA: Wszystkie pompowane do komory przepływowej należy przed użyciem odgazować w eksykatorze próżniowym przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl biotynylowanego λ-ARS317 DNA do 80 μl buforu blokującego i pompować go do komory przepływowej z prędkością 25 μl/min przez 2 min. Następnie przepłukać DNA λ-ARS317 za pomocą 200 μl buforu blokującego z szybkością 50 μl/min.</li>
	<li>Przepompować 200 μl bufora wiążącego10 z szybkością 50 μL/min, aby usunąć bufor blokujący w komorze przepływowej.</li>
	<li>Dodać 0,2 μl Qdot705 pokrytego streptawidyną (1 μM) i 0,2 μl biotynylowanego ORC (1,2 μM) do probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie dodaj 20 μl buforu wiążącego do probówki i umieść ją na lodzie. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi około 10 nM.</li>
	<li>Dodać 2 μl ORC-Qdot705 (10 nM), 1 μl DTT (100 mM), 1 μl ATP (200 mM) do 96 μl buforu wiążącego. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi 0,2 nM.</li>
	<li>Pompować 20 μL 0,2 nM ORC-Qdot705 z prędkością 10 μL/min do komory przepływowej. Wypłukać nadmiar ORC-Qdot705 za pomocą 200 μl buforu wiążącego z szybkością 100 μL/min. Następnie pompuj bufor wiążący z 30 nM SYTOX Orange do komórki przepływowej, aby wybarwić substraty DNA z szybkością 100 μl / min.</li>
	<li>Wzbudz sygnał ORC-Qdot705 i sygnał SYTOX Orange Barwionego DNA za pomocą odpowiednio lasera 405 nm i lasera 532 nm. Obserwuj sygnały jednocześnie z przepływem 100 μl/min za pomocą czteropasmowego filtra pasmowo-przepustowego (FF01-446/510/581/703-25) i rejestruj obrazy za pomocą EM-CCD z prędkością 100 ms na klatkę. Zbierz 20 stosów obrazów z różnych pól.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Przytnij obrazy za pomocą oprogramowania Fiji za pomocą nowej wtyczki, która jest modyfikowana przez nas w oparciu o wtyczkę Image (OI_cut_RGBmerge) opracowaną przez laboratorium dr Rona Vale'a na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.
	<ol>
		<li>Przytnij stos obrazów (512 × 512 pikseli) do dwóch stosów obrazów (256 × 256 pikseli). Jeden to ekscytujący wynik lasera 532 nm, a drugi to ekscytujący wynik lasera 405 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj 61 obrazów sekwencyjnych za pomocą projektu Fiji-Image-Stacks-Z (średnia intensywność).</li>
	<li>Zmierz ręcznie długość DNA (LDNA) i odległość od miejsca wiązania ORC-Qdot705 (LORC) na DNA do spętanego końca DNA.</li>
	<li>Oblicz wynik LORC/LDNA za pomocą programu Excel, przeanalizuj dane za pomocą metody bootstrap według R, a następnie utwórz histogram i dopasuj rozkłady Gaussa.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots%3A+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62(2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li>
<li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li>
<li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).</li>
<li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation%3A+origin+specificity%2C+licensing%2C+and+firing+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li>
<li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927317301020">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li>
<li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+%CE%BB+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li>
<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół obserwacji interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie zmodyfikowanym λ DNA za pomocą TIRFM w komórce przepływowej. Niezbędne kroki obejmują specyficzną dla miejsca modyfikację substratu DNA, biotynylację DNA, czyszczenie i funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, przygotowanie komórek przepływowych i obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Są dwa kluczowe punkty, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, wszystkie etapy związane z λ DNA powinny być delikatnie manipulowane...

Interakcje między białkiem a DNA są niezbędne dla wielu złożonych procesów biologicznych, takich jak replikacja DNA, naprawa DNA i transkrypcja. Chociaż konwencjonalne podejścia rzuciły światło na właściwości tych procesów, wiele kluczowych mechanizmów jest nadal niejasnych. Ostatnio, dzięki szybko rozwijającym się technikom pojedynczych cząsteczek, niektóre mechanizmy zostały rozwiązane1,2,3.
Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji oddziaływań białko-DNA w czasie rzeczywistym zależy głównie od rozwoju detekcji fluorescencji i sond fluorescencyjnych. W przypadku badania pojedynczej cząsteczki ważne jest, aby oznaczyć interesujące białko odpowiednią sondą fluorescencyjną, ponieważ systemy wykrywania fluorescencji są najczęściej dostępne na rynku.
Białka fluorescencyjne są powszechnie używane w biologii molekularnej. Jednak niska jasność fluorescencji i odporność na fotowybielanie ograniczają jego zastosowanie w wielu testach jednocząsteczkowych. Kropki kwantowe (Qdots) to maleńkie nanocząstki emitujące światło4. Ze względu na swoje unikalne właściwości optyczne, Qdots są 10 - 20 razy jaśniejsze i kilka tysięcy razy bardziej stabilne niż powszechnie stosowane barwniki organiczne5. Co więcej, Qdot mają duże przesunięcie Stokesa (różnica między pozycją wzbudzenia a pikami emisji)5. W związku z tym Qdots mogą być używane do długotrwałej obserwacji (od minut do godzin) i pozyskiwania obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu, podczas gdy nie mogą być wykorzystywane w testach ilościowych.
Do tej pory istnieją dwa podejścia do oznaczania docelowego białka za pomocą Qdots specyficznie dla miejsca: znakowanie za pomocą pierwszorzędowych lub drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z Qdot6,7,8; lub bezpośrednie znakowanie docelowego białka za pomocą Qdots, co opiera się na silnym oddziaływaniu między biotyną a streptawidyną9,10,11,12,13. Qdot powlekane streptawidyną są dostępne w handlu. W naszym niedawnym badaniu, specyficznie biotynylowane białka w pączkujących drożdżach o wysokiej wydajności zostały oczyszczone przez nadekspresję białek znakowanych BirA i Avi in vivo10. Śledząc i optymalizując testy jednocząsteczkowe14,15,16,17, zaobserwowaliśmy interakcje między białkami znakowanymi Qdot a DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą TIRFM10.
Tutaj wybieramy kompleks rozpoznawania pochodzenia pączkujących drożdży (ORC), który może specyficznie rozpoznawać i wiązać się z autonomicznie replikującą się sekwencją (ARS), jako nasze interesujące białko. Poniższy protokół przedstawia krok po kroku procedurę wizualizacji interakcji ORC oznaczonego znakiem Qdot z ARS za pomocą TIRFM. Opisano przygotowanie specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA, biotynylację DNA, czyszczenie i funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, składanie komórek przepływowych oraz obrazowanie pojedynczych cząsteczek.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Sklep 25 &mu; L podwielokrotności przy -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>enzym Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania szybkiej fuzji</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Ekstrakty opakowaniowe Lambda </td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Szczep bakteryjny LE392MP jest zawarty w tym pakiecie.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013092</td><td>Każda marka jest dopuszczalna.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Każda marka jest dopuszczalna.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Każda marka jest dopuszczalna.</td></tr><tr><td>NZ-amina</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterylna, luzem, 500szt</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane startery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA, Ligaza DNA T4, Bufor reakcyjny (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80120891</td><td>kwas siarkowy</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Nadtlenek wodoru</td></tr><tr><td></td><td>Metanol Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (glikol metoksypolietylenowy)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotyna-PEG (glikol biotynowo-polietylenowy)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka próżniowa</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Rysik szklany z diamentową końcówką</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe</td><td>Marka żagla</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Rurka doprowadzająca</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>średnica wewnętrzna 0,38 mm; średnica zewnętrzna 1,09 mm.</td></tr><tr><td>Rurka wylotowa</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>średnica wewnętrzna 0,76 mm; średnica zewnętrzna 1,22 mm.</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>pięciominutowa żywica epoksydowa</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Pompa programowalna do infuzji/odstawienia </td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Laser 532 nm</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Obrazowanie optyka dzielona</td><td>Hamamatsu photonics KK</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>System oświetlenia TIRF</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60 razy; Obiektyw TIRF</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Czterokrawędziowy laserowy dichroiczny beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Czterozakresowy filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescencja, szkiełko testowe mikroskopu #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 sprzężony streptawidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store przy 4 &ordm; C, nie zamrażać.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Przygotuj 200 mM roztwór ATP, używając ddH2O, dostosuj pH do 7,0 i przechowuj 10 &mu; L podwielokrotności przy -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>Naziemna telewizja cyfrowa</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Przygotuj 1 M roztwór za pomocą ddH2O i przechowuj 10 &mu; l podwielokrotności przy -20 &ordm;C.</td></tr></tbody></table>

wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym qdot a specyficznie modyfikowanym λ dna na poziomie pojedynczej cząsteczki

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Mikroskopia fluorescencyjna wniosła ogromny wkład w analizę mechanizmów złożonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki. W testach jednocząsteczkowych do badania oddziaływań DNA-białko należy wziąć pod uwagę dwa ważne czynniki: substrat DNA o długości wystarczającej do łatwej obserwacji i znakowanie białka odpowiednią sondą fluorescencyjną. 48,5 kb λ DNA jest dobrym kandydatem na substrat DNA. Kropki kwantowe (Qdots), jako klasa sond fluorescencyjnych, umożliwiają długotrwałą obserwację (od minut do godzin) i akwizycję wysokiej jakości obrazu. W tym artykule przedstawiamy protokół badania interakcji DNA-białko na poziomie pojedynczej cząsteczki, który obejmuje przygotowanie specyficznie zmodyfikowanego DNA λ i znakowanie białka docelowego za pomocą Qdot pokrytych streptawidyną. Aby udowodnić słuszność koncepcji, wybieramy ORC (kompleks rozpoznawania pochodzenia) w pączkujących drożdżach jako białko będące przedmiotem zainteresowania i wizualizujemy jego interakcję z ARS (autonomicznie replikującą się sekwencją) za pomocą TIRFM. W porównaniu z innymi sondami fluorescencyjnymi, Qdots mają oczywiste zalety w badaniach pojedynczych cząsteczek ze względu na wysoką stabilność przed fotowybielaniem, ale należy zauważyć, że ta właściwość ogranicza jej zastosowanie w testach ilościowych.

Aby zwizualizować interakcję między znakowanym Qdot ORC a ARS, w pierwszej kolejności przygotowano podłoże DNA λ-ARS317. Fragment DNA zawierający ARS317 zintegrowano w miejscu XhoI (33,5 kb) natywnego DNA λ poprzez rekombinację homologiczną (Rycina 1A). Produkt rekombinacji zapakowano przy użyciu ekstraktów, a zapakowane cząsteczki fagów hodowano na płytkach z pożywką LB (Rycina 1B). Pozytywne plamy fagowe wyselekcjonowa...

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania pojedynczych cząsteczek interakcji białek DNA, takich jak replikacja DNA, naprawa genów i utrzymanie struktury chromosomów. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać zmodyfikowane DNA lambda o wysokiej zawartości kolagenu, a następnie szybko utwardzić znakowane białka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy montażu komór przepływowych są trudne do nauczenia.Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe, umieść 20 szkiełek nakrywkowych w czterech słoikach do barwienia, wlej do nich etanol i sonikuj przez 30 minut w etanolu. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą trzy razy. Następnie sonikować szkiełka nakrywkowe jednym molowym wodorotlenkiem potasu przez 30 minut i trzykrotnie spłukać szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą.Następnie powtórzyć jednokrotną sonikację etanolu i wodorotlenku potasu. Sonikować szkiełka nakrywkowe acetonem przez 30 minut, a następnie dokładnie spłukać ultraczystą wodą. Teraz umieść szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji spłucz szkiełka nakrywkowe pięciokrotnie ultraczystą wodą. Następnie dokładnie umyj każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą. Użyj papieru, aby wysuszyć szkiełko nakrywkowe od jego krawędzi i umieść je w słoiku do barwienia.Dokładnie wysusz szkiełko nakrywkowe w piekarniku o temperaturze 110 stopni Celsjusza. Teraz spłucz szkiełko nakrywkowe metanolem, a następnie włóż słoik do barwienia z powrotem do piekarnika o temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby wysuszyć szkiełko nakrywkowe. Aby przeprowadzić funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, dodaj 70 mililitrów roztworu silanu do każdego słoika, zakręć nakrętkę i pozostaw słoik w temperaturze pokojowej na noc.Umyj szkiełka nakrywkowe za pomocą trzech zlewek wypełnionych ultraczystą wodą. Dokładnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą gazowego azotu. Rozpuść 150 miligramów methoxy-PEG i sześć miligramów biotyny-PEG w jednym mililitrze świeżo przygotowanego 0,1-molowego wodorowęglanu sodu.Wirować przy 17 000 g przez jedną minutę, aby usunąć nierozpuszczalne PEG. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu PEG na środku silanizowanego szkiełka nakrywkowego i umieść kolejne silanizowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Inkubować szkiełka nakrywkowe z roztworem PEG przez co najmniej trzy godziny w ciemności.Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i trzymaj funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i wysusz je gazowym azotem. Teraz zaznacz funkcjonalną stronę szkiełek nakrywkowych na jednym z rogów za pomocą markera.Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej tubie wywierconej z jednym otworem w nasadce. Umieść probówkę w plastikowej torbie, zamknij torebkę za pomocą zgrzewarki próżniowej i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zmontować komórkę przepływową, wytnij kanał pośrodku kawałka taśmy dwustronnej za pomocą dziurkacza.Odklej papierową stronę taśmy dwustronnej i wklej ją na szklaną stronę z dwoma otworami. Łatwiej jest usunąć pęcherzyki powietrza, odklejając stronę papierową niż plastikową stronę taśmy dwustronnej. Naciśnij taśmę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Następnie pokrój funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe na cztery części za pomocą rysika szklanego z diamentową końcówką i usuń zanieczyszczenia za pomocą azotu, trzymając funkcjonalizowaną stronę do góry. Odklej plastikową stronę taśmy dwustronnej i wklej szkiełko na funkcjonalizowany szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a taśmą.Dokładne usunięcie pęcherzyków powietrza może uchronić komorę przepływową przed wyciekiem podczas pompowania do niej. Teraz włóż rurkę wlotową do małego otworu i włóż rurkę wylotową do dużego otworu. Zamocuj rurkę za pomocą żywicy epoksydowej.Ręcznie przepompować 20 mikrolitrów po 0,2 miligrama na mililitr streptawidyny do komory przepływowej za pomocą strzykawki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie pompuj bufor blokujący do komory przepływowej, aby zastąpić streptawidynę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej. Uzyskaj wyrównanie ogniskowej czerwieni czerwonej i dalekiej czerwieni z A5 na szkiełku testowym mikroskopu fluorescencyjnego numer jeden poprzez jednoczesne wzbudzenie za pomocą lasera 532 nanometrowego i lasera 640 nanometrowego.Twórz obrazy o podwójnej długości fali dzięki optyce rozdzielającej. Umieść celę przepływową na mikroskopie i podłącz jej rurkę wylotową do dłuższej rurki, która jest podłączona do 10-mililitrowej sprężyny zainstalowanej na automatycznej programowalnej pompie do pobierania infuzji. Usuń pęcherzyki powietrza w komorze przepływowej, wstrzykując bufor blokujący i odwracając rurkę wylotową.Dodaj 0,5 mikrolitra biotynylowanego DNA lambda-ARS317 do 80 mikrolitrów buforu blokującego. Pompuj przygotowaną mieszaninę do komory przepływowej z prędkością 25 mikrolitrów na minutę przez dwie minuty. Następnie przepłukać DNA lambda-ARS317 za pomocą 200 mikrolitrów buforu blokującego z szybkością 50 mikrolitrów na minutę.Teraz pompuj 200 mikrolitrów buforu wiążącego z szybkością 50 mikrolitrów na minutę, aby usunąć bufor blokujący w komórce przepływowej. Następnie dodaj dwa mikrolitry ORC-Qdot705, jeden mikrolitr DTT i jeden mikrolitr ATP do 96 mikrolitrów buforu wiążącego. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi 0,2 nanomola.Po przepompowaniu buforu wiążącego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wpompuj 20 mikrolitrów przygotowanego roztworu ORC-Qdot705 z szybkością 10 mikrolitrów na minutę do celi przepływowej. Wypłucz nadmiar ORC-Qdot705 za pomocą 200 mikrolitrów buforu wiążącego z szybkością 100 mikrolitrów na minutę. Następnie pompuj bufor wiążący z 30 nanomolowymi SYTOX Orange do komórki przepływowej, aby wybarwić substraty DNA z szybkością 100 mikrolitrów na minutę.Na koniec wzbudz sygnał ORC-Qdot705 za pomocą lasera 405 nanometrowego i wzbudz sygnał SYTOX Orange Barwionego DNA za pomocą lasera 532 nanometrowego. Obserwuj sygnały jednocześnie z przepływem 100 mikrolitrów na minutę za pomocą czteropasmowego filtra pasmowoprzepustowego. Nagrywaj obrazy za pomocą EMCCD z 100 milisekundami na klatkę.Ilustracja substratu DNA lambda-ARS317 jest pokazana tutaj. ORC oznaczony jako Qdot705 został wzbudzony przez laser o długości 405 nanometrów. DNA wybarwione na pomarańczowo SYTOX zostało wzbudzone przez laser o długości 532 nanometrów.Scalony wynik sugeruje, że ORC oznaczony Qdot705 wiąże się z ARS317. Wynik rozkładu wiązania ORC na DNA lambda-ARS317 pokazuje, że ORC wiąże się z ARS317 z dużą obfitością. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak jednocząsteczkowy FRET, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji białko-białko i dynamiki białek.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem fluorescencyjnym pojedynczych cząsteczek do zbadania interakcji białek DNA w odtworzonych systemach replikacji i naprawy DNA in vitro. Nie zapominaj, że praca z roztworem Piranha może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie masek ochronnych, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Odkryj metodę mikroskopii fluorescencyjnej TIRFM do badania interakcji DNA-białko na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół wykorzystuje modyfikowane DNA λ i białka znakowane kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Przeglądaj więcej filmów