Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki
July 17th, 2018
Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania pojedynczych cząsteczek interakcji białek DNA, takich jak replikacja DNA, naprawa genów i utrzymanie struktury chromosomów. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać zmodyfikowane DNA lambda o wysokiej zawartości kolagenu, a następnie szybko utwardzić znakowane białka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy montażu komór przepływowych są trudne do nauczenia.
Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe, umieść 20 szkiełek nakrywkowych w czterech słoikach do barwienia, wlej do nich etanol i sonikuj przez 30 minut w etanolu. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą trzy razy. Następnie sonikować szkiełka nakrywkowe jednym molowym wodorotlenkiem potasu przez 30 minut i trzykrotnie spłukać szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą.
Następnie powtórzyć jednokrotną sonikację etanolu i wodorotlenku potasu. Sonikować szkiełka nakrywkowe acetonem przez 30 minut, a następnie dokładnie spłukać ultraczystą wodą. Teraz umieść szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez godzinę.
Po inkubacji spłucz szkiełka nakrywkowe pięciokrotnie ultraczystą wodą. Następnie dokładnie umyj każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą. Użyj papieru, aby wysuszyć szkiełko nakrywkowe od jego krawędzi i umieść je w słoiku do barwienia.
Dokładnie wysusz szkiełko nakrywkowe w piekarniku o temperaturze 110 stopni Celsjusza. Teraz spłucz szkiełko nakrywkowe metanolem, a następnie włóż słoik do barwienia z powrotem do piekarnika o temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby wysuszyć szkiełko nakrywkowe. Aby przeprowadzić funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, dodaj 70 mililitrów roztworu silanu do każdego słoika, zakręć nakrętkę i pozostaw słoik w temperaturze pokojowej na noc.
Umyj szkiełka nakrywkowe za pomocą trzech zlewek wypełnionych ultraczystą wodą. Dokładnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą gazowego azotu. Rozpuść 150 miligramów methoxy-PEG i sześć miligramów biotyny-PEG w jednym mililitrze świeżo przygotowanego 0,1-molowego wodorowęglanu sodu.
Wirować przy 17 000 g przez jedną minutę, aby usunąć nierozpuszczalne PEG. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu PEG na środku silanizowanego szkiełka nakrywkowego i umieść kolejne silanizowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Inkubować szkiełka nakrywkowe z roztworem PEG przez co najmniej trzy godziny w ciemności.
Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i trzymaj funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i wysusz je gazowym azotem. Teraz zaznacz funkcjonalną stronę szkiełek nakrywkowych na jednym z rogów za pomocą markera.
Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej tubie wywierconej z jednym otworem w nasadce. Umieść probówkę w plastikowej torbie, zamknij torebkę za pomocą zgrzewarki próżniowej i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zmontować komórkę przepływową, wytnij kanał pośrodku kawałka taśmy dwustronnej za pomocą dziurkacza.
Odklej papierową stronę taśmy dwustronnej i wklej ją na szklaną stronę z dwoma otworami. Łatwiej jest usunąć pęcherzyki powietrza, odklejając stronę papierową niż plastikową stronę taśmy dwustronnej. Naciśnij taśmę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
Następnie pokrój funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe na cztery części za pomocą rysika szklanego z diamentową końcówką i usuń zanieczyszczenia za pomocą azotu, trzymając funkcjonalizowaną stronę do góry. Odklej plastikową stronę taśmy dwustronnej i wklej szkiełko na funkcjonalizowany szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a taśmą.
Dokładne usunięcie pęcherzyków powietrza może uchronić komorę przepływową przed wyciekiem podczas pompowania do niej. Teraz włóż rurkę wlotową do małego otworu i włóż rurkę wylotową do dużego otworu. Zamocuj rurkę za pomocą żywicy epoksydowej.
Ręcznie przepompować 20 mikrolitrów po 0,2 miligrama na mililitr streptawidyny do komory przepływowej za pomocą strzykawki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie pompuj bufor blokujący do komory przepływowej, aby zastąpić streptawidynę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej. Uzyskaj wyrównanie ogniskowej czerwieni czerwonej i dalekiej czerwieni z A5 na szkiełku testowym mikroskopu fluorescencyjnego numer jeden poprzez jednoczesne wzbudzenie za pomocą lasera 532 nanometrowego i lasera 640 nanometrowego.
Twórz obrazy o podwójnej długości fali dzięki optyce rozdzielającej. Umieść celę przepływową na mikroskopie i podłącz jej rurkę wylotową do dłuższej rurki, która jest podłączona do 10-mililitrowej sprężyny zainstalowanej na automatycznej programowalnej pompie do pobierania infuzji. Usuń pęcherzyki powietrza w komorze przepływowej, wstrzykując bufor blokujący i odwracając rurkę wylotową.
Dodaj 0,5 mikrolitra biotynylowanego DNA lambda-ARS317 do 80 mikrolitrów buforu blokującego. Pompuj przygotowaną mieszaninę do komory przepływowej z prędkością 25 mikrolitrów na minutę przez dwie minuty. Następnie przepłukać DNA lambda-ARS317 za pomocą 200 mikrolitrów buforu blokującego z szybkością 50 mikrolitrów na minutę.
Teraz pompuj 200 mikrolitrów buforu wiążącego z szybkością 50 mikrolitrów na minutę, aby usunąć bufor blokujący w komórce przepływowej. Następnie dodaj dwa mikrolitry ORC-Qdot705, jeden mikrolitr DTT i jeden mikrolitr ATP do 96 mikrolitrów buforu wiążącego. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi 0,2 nanomola.
Po przepompowaniu buforu wiążącego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wpompuj 20 mikrolitrów przygotowanego roztworu ORC-Qdot705 z szybkością 10 mikrolitrów na minutę do celi przepływowej. Wypłucz nadmiar ORC-Qdot705 za pomocą 200 mikrolitrów buforu wiążącego z szybkością 100 mikrolitrów na minutę. Następnie pompuj bufor wiążący z 30 nanomolowymi SYTOX Orange do komórki przepływowej, aby wybarwić substraty DNA z szybkością 100 mikrolitrów na minutę.
Na koniec wzbudz sygnał ORC-Qdot705 za pomocą lasera 405 nanometrowego i wzbudz sygnał SYTOX Orange Barwionego DNA za pomocą lasera 532 nanometrowego. Obserwuj sygnały jednocześnie z przepływem 100 mikrolitrów na minutę za pomocą czteropasmowego filtra pasmowoprzepustowego. Nagrywaj obrazy za pomocą EMCCD z 100 milisekundami na klatkę.
Ilustracja substratu DNA lambda-ARS317 jest pokazana tutaj. ORC oznaczony jako Qdot705 został wzbudzony przez laser o długości 405 nanometrów. DNA wybarwione na pomarańczowo SYTOX zostało wzbudzone przez laser o długości 532 nanometrów.
Scalony wynik sugeruje, że ORC oznaczony Qdot705 wiąże się z ARS317. Wynik rozkładu wiązania ORC na DNA lambda-ARS317 pokazuje, że ORC wiąże się z ARS317 z dużą obfitością. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak jednocząsteczkowy FRET, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji białko-białko i dynamiki białek.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem fluorescencyjnym pojedynczych cząsteczek do zbadania interakcji białek DNA w odtworzonych systemach replikacji i naprawy DNA in vitro. Nie zapominaj, że praca z roztworem Piranha może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie masek ochronnych, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM). Metoda wykorzystuje specyficznie zmodyfikowany substrat DNA λ oraz białka oznaczone kwantowymi kropkami do ułatwienia obrazowania pojedynczych cząsteczek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biologia molekularna
Tło
- Rozumienie interakcji DNA-białko jest kluczowe dla poznania replikacji DNA i naprawy genów.
- Techniki obrazowania pojedynczych cząsteczek dostarczają szczegółowych informacji na temat dynamiki molekularnej.
- Protokół ma na celu uproszczenie montażu komórek przepływowych dla TIRFM.
- Demonstracje wizualne poprawiają naukę i zastosowanie metody.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu badania interakcji DNA-białko.
- Poprawa rozumienia mechanizmów molekularnych w utrzymaniu struktury chromosomu.
- Ułatwienie badań nad technikami obrazowania pojedynczych cząsteczek.
Stosowane metody
- Przygotowanie zmodyfikowanych substratów DNA λ.
- Oznaczanie białek kwantowymi kropkami.
- Montaż komórek przepływowych dla obrazowania TIRFM.
- Czyszczenie i przygotowanie szkiełków okrywowych dla optymalnych warunków obrazowania.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia efektywne wizualizowanie interakcji DNA-białko.
- Wykazano skuteczne obrazywanie oznaczonych białek oddziałujących z DNA.
- Dostarczono krok po kroku przewodnik do pokonania typowych wyzwań w montażu komórek przepływowych.
- Podkreślono znaczenie procedur czyszczenia szkiełków okrywowych.
Wnioski
- Ta metoda poprawia badania interakcji DNA-białko.
- Służy jako cennej narzędzia dla badaczy w biologii molekularnej.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na różne aspekty badań genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA-protein interactions using Qdot-labeled proteins and site-specifically modified λ DNA enables direct interrogation of molecular mechanisms underlying replication and repair. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing high-resolution, quantitative insights into binding events and spatial localization. The method supports early discovery inflection points where mechanistic de-risking and functional validation are critical for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-DNA binding specificity and localization at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying functional engagement of candidate targets.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of replication and repair pathways relevant to disease models.
- Provides foundational data for triaging targets based on real-time molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule imaging systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, high-stability fluorescent labeling with Qdots for extended observation windows.
- Enables quantitative measurement of binding events, supporting assay standardization and scalability.
- Prepares robust platforms for evaluating compound effects on DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanistic findings with disease-relevant DNA replication and repair processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling detailed molecular characterization.
- Reduces translational risk by providing direct evidence of target engagement and functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development phases.
- Discovery Biology: Provides high-resolution visualization for hypothesis testing and pathway clarification in DNA-protein interaction studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables statistical comparison of binding distributions and localization patterns across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant systems by modeling replication and repair events in vitro.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse protein-DNA interaction studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows with robust, photostable Qdot labeling and reproducible flow cell assembly.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of molecular interactions and target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and flow cell assembly.
- Demands access to TIRFM instrumentation and high-sensitivity EMCCD imaging systems.
- Necessitates rigorous cleaning and functionalization protocols for coverslips to ensure reproducibility.
- Adaptation to other protein-DNA systems may require optimization of labeling and buffer conditions.
- Qdot photostability limits application in quantitative assays requiring dynamic intensity measurements.
