Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten pozwala na identyfikację i izolację erytroidalnych komórek progenitorowych BFU-E i CFU-E bezpośrednio ze świeżo pobranych tkanek myszy, takich jak szpik kostny i śledziona. Za pomocą tej techniki możemy wyizolować czyste populacje erytroidalnych komórek progenitorowych, co nie było możliwe w przypadku poprzednich protokołów przepływu. Ta metoda znacznie zwiększa naszą zdolność do badania mysich modeli choroby erytroidalnej, umożliwiając izolację progenitorów w wielu dalszych eksperymentach.

Na początek umieść świeżo wypreparowane kości udowe i piszczelowe bezpośrednio w zimnym buforze barwiącym lub SB-5 i trzymaj probówki na lodzie, aż będą gotowe do ekstrakcji szpiku kostnego. Umieść czysty wysterylizowany moździerz na lodzie w wiadrze i przenieś kości do moździerza. Za pomocą nożyczek preparacyjnych odetnij około 1-milimetrowe końce każdej kości.

Użyj 3-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 zawierającą SB-5, aby wypłukać szpik z kości i zebrać go do moździerza i powtórzyć proces 3 do 5 razy, używając za każdym razem świeżego buforu, aż kości staną się bezbarwne. Przefiltruj przepłukany szpik przez siatkę o średnicy 100 mikrometrów i zbierz komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej umieszczonej na lodzie. Następnie użyj moździerza i tłuczka, aby zmiażdżyć zaczerwienione kości w 5 do 10 mililitrach SB-5.

Przefiltruj mieszaninę zmiażdżonych kości i buforuj przez sitko o długości 100 mikrometrów, aby połączyć się z wcześniej pobranymi komórkami. Ustaw filtr siatkowy o średnicy 100 mikrometrów na pustej 50-mililitrowej probówce wirówkowej umieszczonej na lodzie. Umieść pojedynczą śledzionę na filtrze siatkowym i dodaj 0,5 do 1 mililitra SB-5 do śledziony, aby upewnić się, że nie wyschnie.

Używając gumowej strony tłoka strzykawki o pojemności 3 lub 5 mililitrów, rozetrzyj śledzionę przez siatkę. Dodaj więcej SB-5, po 5 mililitrów na raz i kontynuuj zacieranie, aż wszystkie komórki zostaną zebrane w probówce. Przygotuj zawiesinę jednokomórkową, pipetując zebrane komórki w górę iw dół za pomocą 2 mililitrów SB-5 za pomocą końcówki z dużym otworem.

Wybarwić fluorescencję pomniejszoną o jeden lub kontrole FMO, dodając wszystkie przeciwciała z wyjątkiem przeciwciała o nazwie FMO do zawiesiny komórkowej w probówce FACS. Aby zabarwić jednokolorowe kontrole, dodaj pojedyncze przeciwciało do zawiesiny komórek w probówce FACS. Wiruj każdą rurkę kontrolną przez 2 do 3 sekund przy 3000 obr./min, a następnie inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, kołysząc się przez 2,5 godziny w ciemności.

Po inkubacji przemyć komórki SB-5 i uzupełnić objętość zawiesiny komórek do 4 mililitrów SB-5. Wirować komórki o masie 900 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i odessać supernatant. Ponownie zawieś niezabarwione i wszystkie jednokolorowe kontrolki w 300 mikrolitrach SB-5 i przefiltruj przez 40-mikrometrową siatkę filtracyjną do nowych probówek FACS.

Przygotuj roztwór DAPI SB-5, rozcieńczając zapas DAPI w stosunku od 1 do 10 000 w SB-5. Ponownie zawieś FMOS w 1,8 mililitra DAPI SB-5 i jednokolorową kontrolę DAPI w 300 mikrolitrach DAPI SB-5, a następnie przefiltruj je przez 40-mikrometrową siatkę filtracyjną do nowych probówek FACS. Po dodaniu głównej mieszanki przeciwciał do każdej próbki, wirować probówki przez 2 do 3 sekund z prędkością 3000 obr./min, a następnie inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności przez 2,5 godziny w stanie kołysania.

Po umyciu komórek, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić próbki w 1,8 mililitra DAPI SB-5 i przefiltrować przez 40-mikrometrową siatkę filtracyjną do nowej probówki FACS i przeanalizować próbki za pomocą cystometru. Użyj rozproszenia do przodu, aby usunąć zanieczyszczenia na podstawie rozmiaru, a następnie użyj histogramu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu, aby wykluczyć agregacje komórek i wybrać pojedyncze komórki. Powtórz wykluczenie z histogramem wysokości bocznego obszaru punktowego w stosunku do bocznego obszaru punktowego.

Wyklucz martwe komórki, bramkując komórki dodatnie dla DAPI. Wybierz linię ujemną TUR jedną 19 ujemnych komórek dodatnich zestawu. A spośród nich wybierz subpopulację, która wyraża CD 55.

Podziel linię ujemną TUR jeden 19, ujemny zestaw, dodatni, CD 55 dodatnie komórki na 2 podstawowe populacje, P sześć i P siedem w oparciu o ekspresję CD 49 F i CD 1 0 5. Teraz, w oparciu o ekspresję CD 150 i CD 41, podziel P 6 dalej na P 3, P 4 i P 5. Podobnie, w oparciu o ekspresję CD 150 i CD 71, podziel P 7 dalej na BFUE, wczesną CFUE i późną CFUE.

W niniejszym badaniu jednostki pękające i tworzące kolonie zostały zidentyfikowane ze świeżo pobranych komórek szpiku kostnego i śledziony. Po 72 godzinach od wstrzyknięcia erytropoetyny lub nośnika u myszy, stymulacja erytropoetyny wykazała ekspansję wczesnych i późnych populacji jednostek tworzących kolonie P 1 niskie i P 1 wysokie w pobranym szpiku kostnym i komórkach śledziony. Odpowiedź komórek progenitorowych szpiku kostnego i śledziony na erytropoetynę in vivo wykazała również większą liczbę komórek we wczesnych i późnych populacjach jednostek tworzących kolonie P 1 niskie i P 1 wysokie, w porównaniu z kontrolą nośnika.

Najważniejsze jest, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki przed znakowaniem komórek przeciwciałami. Można to osiągnąć poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół oraz poprzez włączenie EDTA do buforu. Oczyszczone komórki progenitorowe mogą być wykorzystane do dowolnej dalszej analizy komórkowej i molekularnej.

Na przykład transkryptomika pojedynczych komórek, atesque, testy kolonii i biochemia. Ta technika pomogła nam przetestować przewidywania z eksperymentów z sekwencją RNA pojedynczej komórki.