Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego
1 listopada 2018
Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół, który może być wykorzystany do określenia powinowactwa wiązania i sposobu interakcji bezznacznikowego białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z immobilizowanymi dwuwarstwami opartymi na ciele stałym (SLB) poprzez jednoczesny pomiar wychwytu masy i właściwości lepkosprężystych białka anektyny A2.
Ta metoda może pomóc w badaniu kierunków białek z błonami lipidowymi. W naszym przypadku użyj go do analizy zależnego od wapnia wiązania aneksyn z ujemnie naładowanymi fosfolipidami. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest wolna od etykiet, czuła, ilościowa oraz że interakcje można obserwować w czasie rzeczywistym.
Pozwala to na bezpośrednią analizę rzeczywistych wyników. Technika ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak interakcja bardziej złożonych zespołów mikromolekuł, a nawet komórek. Stosować klarowne pięciomilimolowe roztwory lipidowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym w 10-mililitrowych szklanych probówkach. Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w wysokopróżniowym systemie liofilizacji na trzy godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalników.
Teraz ponownie zawieś film lipidowy w jednym mililitrze buforu cytrynianu. Zawiesinę lipidową inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej, energicznie wirując ją co pięć minut. Temperatura ta jest o około 10 stopni Celsjusza wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie.
W międzyczasie podgrzej wytłaczarkę wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy 50 nanometrów o średnicy porów powyżej temperatury przejścia przez 30 minut. Załaduj zawiesinę pęcherzyków wielopłytkowych do podgrzanej wytłaczarki. Delikatnie przepuść mieszaninę 31 razy przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe lub SUV.
Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia. Przenieś zawieszenie SUV do dwumililitrowego plastikowego naczynia reakcyjnego i dodaj bufor cytrynianu, aby doprowadzić końcową objętość do dwóch mililitrów. Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez co najmniej 30 minut.
Następnie dokładnie umyj je ultra czystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i wypróbuj je przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu. Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. W tym celu należy włożyć suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnić komorę i trzykrotnie przepłukać ją tlenem.
Następnie włącz myjkę plazmową. Użyj próżni, mocy o wysokiej częstotliwości radiowej i 10 minut czasu procesu. Po zakończeniu czyszczenia wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.
Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w czterech komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rur, które mogą powodować wycieki. Przepłukać system buforem cytrynianowym w trybie otwartego przepływu przez 10 minut.
Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozpraszania pierwszego podstawowego tonu i alikwotów za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się. Gdy linie podstawowe są stabilne, zastosuj zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym.
Za pomocą naczynia reakcyjnego usuń 1,5 mililitra martwej objętości, a następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj przesunięcie rozpraszania częstotliwości przez kolejne 10 minut. Gdy SLB jest stabilny, należy zrównoważyć układ z pracującym buforem o wymaganych stężeniach wapnia w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.
Dodać białko do buforu biegowego zawierającego wapń. Aplikację białka należy wykonywać w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi. Teraz zdysocjuj związane białko poprzez chelatację jonów wapnia z pięcioma milimolowymi EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu.
Zregeneruj układ mikrowagi za pomocą 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody w trybie ciągłego przepływu otwartego. Wyjmij rurki z pojemnika na wodę i pozostaw system do wyschnięcia. Ostrożnie wyjmij czujnik kryształkowy i wyczyść go 2% roztworem SDS za pomocą uchwytu z politetrafluoroetylenu.
Osusz widoczne części wnętrza modułu przepływowego, w którym został umieszczony czujnik. Pokazany tutaj jest zapis krzywej częstotliwości i przesunięć rozpraszania. Wyraźny spadek częstotliwości po dodaniu liposomów wskazuje na ich wchłanianie, ponieważ pęcherzyki wypełnione buforem nie są sztywne, ale lepkosprężyste, rozpraszanie wzrasta.
Następnie dochodzi do pęknięcia zlewających się pęcherzyków. Równoczesne uwalnianie buforu wewnątrz pęcherzyków zmniejsza zaadsorbowaną masę, aż do osiągnięcia stabilnego plateau. Wiązanie aneksyny A2 z lipidami zwiększa masę, co widać po wyraźnym przesunięciu częstotliwości, ale nie zakłóca struktury dwuwarstwowej, na co wskazuje jedyna niewielka zmiana w dyssypacji.
Gdy jon wapnia jest usuwany przez czynnik chelatujący, EGTA, aneksyna A2 dysocjuje od filmu lipidowego. Zapisy częstotliwości i dyssypacji przesuwają się do poziomów widocznych dla dwuwarstwy, co wskazuje tylko, że wiązanie aneksyny A2 jest całkowicie zależne od jonu wapnia i że film lipidowy pozostaje nienaruszony. Reprezentatywny eksperyment kontroli ujemnej przedstawiono tutaj.
W przypadku braku fosfatydyloseryny nie są widoczne żadne zmiany w częstości występowania lub rozproszeniu po dodaniu aneksyny A2 w obecności jonu wapnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić prawidłowe tworzenie dwuwarstwy. Użyj liposomów natychmiast, w przeciwnym razie małe pęcherzyki połączą się w większe o mniejszym napięciu powierzchniowym, co może prowadzić do niestabilnej linii podstawowej.
Po tej procedurze można przeprowadzić ilościowy opis interakcji białka błonowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wiązanie kooperatywne i niekooperatywne.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wyznaczania powinowactw wiązania i trybów interakcji aneksyny A2 z dwuwarstewami lipidowymi podpartymi na podłożu stałym. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji białek z membranami lipidowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biofizyka
Tło
- Aneksyna A2 jest białkiem wiązającym fosfolipidy.
- Rozumienie jej interakcji z membranami lipidowymi jest kluczowe dla procesów komórkowych.
- Badanie koncentruje się na wiązaniu zależnym od wapnia do ujemnie naładowanych fosfolipidów.
- Metoda jest bezznacznikowa i pozwala na czułe, ilościowe pomiary.
Cel badania
- Analiza interakcji wiązania aneksyny A2 z podpartymi na podłożu stałym dwuwarstewami lipidowymi.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu eksperymentalnego dla badaczy.
- Demonstracja możliwości zastosowania metody do innych złożonych systemów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie podpartych na podłożu stałym dwuwarstew lipidowych (SLB).
- Wykorzystanie kwarcowego mikrowagi mikrobalastowego do pomiaru przyrostu masy i właściwości sprezystyczno-lepkich.
- Obserwacja w czasie rzeczywistym zmian częstotliwości i rozproszenia.
- Chelacja jonów wapnia w celu badania dysocjacji białka.
Główne wyniki
- Wiązanie aneksyny A2 z lipidami jest zależne od wapnia.
- Zmiany częstotliwości wskazują na zmiany masy po wiązaniu białka.
- Podczas interakcji utrzymuje się stabilna struktura dwuwarstwy.
- Eksperymenty kontroli ujemnej potwierdzają specyficzność wiązania.
Wnioski
- Protokół zapewnia ilościowy opis interakcji białek membranowych.
- Analiza w czasie rzeczywistym pozwala na szczegółowe wgląd w mechanizmy wiązania.
- Ta metoda może być dostosowana do badania innych interakcji białko-lipid.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This label-free, real-time technique enables quantitative assessment of protein-lipid binding dynamics, supporting target validation in membrane-associated pathways. By measuring mass and viscoelastic changes, it provides mechanistic insights into calcium-dependent interactions critical for de-risking early-stage targets. The method supports predictive confidence in screening campaigns by delivering reproducible, quantitative data on binding affinity and specificity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving phospholipid-binding proteins like annexin A2.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative measurement of binding kinetics and calcium dependence.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming specific, reversible interactions with lipid bilayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates robust, reproducible data for assay standardization in membrane protein screening.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding events, facilitating hit confirmation and SAR development.
- Scalability: Compatible with diverse lipid compositions and protein targets, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining native-like lipid environments.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific adsorption.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of target engagement in disease-relevant systems when linked to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for peripherally acting or membrane-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying calcium-dependent binding to anionic lipids.
- Screening: Delivers quantitative frequency and dissipation shifts as primary readouts for compound or mutant evaluation.
- Analytics: Enables comparison of binding affinity, stoichiometry, and reversibility across conditions.
- Translational Research: Maintains structural integrity of lipid bilayers, supporting extrapolation to cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other membrane-binding proteins and lipid systems, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-lipid interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized SLB formation and real-time monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target specificity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated binding mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation and quartz crystal microbalance operation.
- Depends on access to extrusion equipment, plasma cleaners, and fluidic flow systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, calcium concentrations, and regeneration protocols.
- Adaptation to different models requires validation of lipid composition and protein stability under assay conditions.
- Practical limitations include sensitivity to vesicle aggregation and baseline drift if SLB formation is suboptimal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Lipid Vesicle Preparation and Handling the Quartz Sensors
3:03
Microbalance Operation and Cleaning
5:17
Results: Changes in Frequency and Dissipation during Bilayer formation and the Reversible Ca2+-Dependent Interaction of Annexin A2 with the Lipid Bilayer
6:36
Conclusion
