Name: Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj mikrograwimetrię dyssypatywną do badania wiązań białka aneksyna A2 z dwuwarstwami lipidowymi. Ta bezetykietowa metoda umożliwia ilościową analizę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft w ramach grantów SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 i SFB 1348/A11.

UWAGA: powinny być filtrowane za pomocą filtra 0,22 μm i odgazowywane przez próżnię przez 1 godzinę.
1. Preparat pęcherzyków lipidowych
<ol>
	<li>Użyj szklanych probówek o pojemności 2 ml. Rozpuścić każdy lipid, 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DOPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (POPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynę (POPS) i cholesterol (Chol) w mieszaninie chloroformu/metanolu (50:50 v/v) w celu przygotowania klarownego roztworu lipidowego o stężeniu 5 mM. Rozpuścić 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inozytol-4',5'-bisfosforan) (PI(4,5)P2) w mieszaninie chloroformu/metanolu/wody (20:9:1 v/v).</li>
	<li>Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) i POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabela 1) w szklanych probówkach o pojemności 10 ml. 
	UWAGA: Ostateczna ilość lipidów ogółem wynosi 500 μg.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w systemie wysokopróżniowym (liofilizacji) na 3 godziny w celu usunięcia wszelkich pozostałości śladów rozpuszczalników. 
	UWAGA: W ten sposób powstaje suchy, przezroczysty film.</li>
	<li>Zawiesić film lipidowy w 1 ml buforu cytrynianowego (10 mM cytrynianu trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6). Zawiesinę lipidową inkubować w temperaturze 60 °C (temperatura ta jest o około 10 °C wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie) przez 30 minut w łaźni wodnej i energicznie wirować co 5 minut 
	UWAGA: Powoduje to powstawanie dużych, wielopłytkowych pęcherzyków (MLV). Utrzymać zawiesinę powyżej temperatury przejścia.</li>
	<li>Rozgrzej wytłaczarkę (w tym przypadku w temperaturze 60 °C) wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy porów o średnicy 50 nm powyżej temperatury przejścia (która w tym przypadku wynosi 40 - 50 °C) przez 30 minut.</li>
	<li>Załaduj zawieszenie MLV do podgrzanej wytłaczarki i delikatnie przepuść mieszaninę 31x przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV)14. Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę SUV do plastikowego naczynia reakcyjnego o pojemności 2 ml i dodać bufor cytrynianu (patrz krok 1.4), aby doprowadzić końcową objętość do 2 ml. 
	UWAGA: W ten sposób uzyska się końcowe stężenie lipidów 250 μg/ml.</li>
</ol>
2. Obsługa czujników kwarcowych
UWAGA: Zawsze obsługuj czujniki kwarcowe za pomocą pęsety.
<ol>
	<li>Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez ≥ 30 minut. Umyj je dokładnie ultraczystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i pozwól im wyschnąć przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu.</li>
	<li>Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Włóż suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnij komorę i przepłucz ją 3x tlenem. Włącz odkurzacz plazmowy. Użyj następujących parametrów procesu: ciśnienie 1 x 10-4 Torr, wysoka częstotliwość radiowa (RF) i 10 minut czasu procesu. Wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.</li>
</ol>
3. Obsługa mikrowagi
UWAGA: Zastosowano system mikrowagi z czterema komorami przepływowymi o kontrolowanej temperaturze w konfiguracji równoległej, podłączonymi do pompy perystaltycznej i ustawionymi na natężenie przepływu 80 μL/min. W trybie przepływu otwartego bufor był pompowany ze zbiornika zasilającego do zbiornika odbiorczego. W trybie pętli zbiornik odbiorczy został połączony ze zbiornikiem zasilającym w celu wygenerowania pętli zamkniętej. Temperaturę ustawiono na 20 °C.
<ol>
	<li>Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w 4 komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rurek, które mogą powodować wycieki.</li>
	<li>Przepłukać układ buforem cytrynianowym (10 mM cytrynian trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6) w trybie otwartego przepływu przez 10 min. 
	UWAGA: Wymaga to dokładnie 3,2 ml buforu, ale zaleca się użycie nadmiaru buforu (10 ml).</li>
	<li>Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozproszenia pierwszego tonu podstawowego (n = 1.) i alikwotów (n = 3 - 13) za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się (zajmie to około 40 - 60 minut). 
	UWAGA: Poziomy szumów o częstotliwości (międzyszczytowe) powinny być niższe niż 0,5 Hz, a dla rozpraszania niższe niż 0,1·10-6, przy maksymalnym dryfcie (w roztworze wodnym) wynoszącym 1 Hz/h w częstotliwości i 0,3·10-6/h w rozproszeniu.</li>
	<li>Gdy linie podstawowe są stabilne, nanieść zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym (2 ml w małej tubce). Za pomocą naczynia reakcyjnego usunąć 1,5 ml martwej objętości. Następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj zmianę częstotliwości/rozpraszania przez kolejne 10 minut. 
	UWAGA: W tym czasie pęcherzyki rozprzestrzenią się na powierzchnię SiO2 i połączą się, tworząc ciągłą dwuwarstwę15,16 (krok 2 na rysunkach 1, Rysunek 2 i Rysunek 3). Adsorpcja SUV-ów na powierzchni czujnika jest dwufazowa i ma typową minimalną i maksymalną częstotliwość rozpraszania. Stabilna nowa linia bazowa częstotliwości/rozpraszania z charakterystycznym przesunięciem częstotliwości (w zależności od składu lipidowego) w zakresie 26 - 29 Hz (patrz tabela 1) wskazuje na ciągłą dwuwarstwę na powierzchni.</li>
	<li>Gdy SLB jest stabilny (patrz krok 3.4), zrównoważyć układ z pracującym buforem (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy wymaganych stężeniach Ca2+ (w zakresie od 50 μM do 1 mM CaCl2, w zależności od doświadczenia) w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.</li>
	<li>Dodaj białko (tutaj AnxA2) do uruchomionego buforu zawierającego Ca2+ (patrz krok 3.5). Wykonaj aplikację białka w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi (krok 3 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Stężenie białka może wynosić od 1 do 400 nM. Adsorpcja białek powoduje zależne od stężenia przesunięcie częstotliwości odzwierciedlające adsorpcję masy (białka).</li>
	<li>Dysocjacja związanego białka przez chelatację jonów Ca2+ z 5 mM EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu (krok 4 na rysunkach 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
	UWAGA: Powrót częstości i rozpraszania do wartości wyjściowej SLB wskazuje na całkowitą odwracalność wiązania białek. Cykle asocjacji-dysocjacji można powtarzać w celu porównania różnych stężeń lub białek.</li>
</ol>
4. Czyszczenie mikrowagi
UWAGA: Wykonuj minimalną procedurę czyszczenia po każdym pomiarze.
<ol>
	<li>Zregeneruj układ mikrowagi za pomocą 50 mlddH2O w trybie ciągłego przepływu otwartego, wyjmij probówki ze zbiornika na wodę i pozostaw system do wyschnięcia.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij czujnik kryształkowy i wyczyść go 2% roztworem SDS za pomocą uchwytu z politetrafluoroetylenu (patrz krok 2.1).</li>
	<li>Osusz widoczne części wnętrza modułu przepływowego, w którym umieszczono czujnik. 
	UWAGA: Wykonaj procedurę intensywnego czyszczenia po serii 10 pomiarów.</li>
	<li>Wyczyść system 2% roztworem SDS (50 ml) w temperaturze 40 °C (konfiguracja w oprogramowaniu) w trybie ciągłego przepływu otwartego (probówka), używając natężenia przepływu 20 μl/min dla dłuższego kontaktu z detergentem.</li>
	<li>Oczyścić 250 ml ddH2O w trybie ciągłego przepływu otwartego przy natężeniu przepływu 160 μl/min. 
	UWAGA: Po 4 miesiącach przeprowadź obszerną procedurę czyszczenia zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413487">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).</li>
<li>Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexins%3A+linking+Ca2%2B+signalling+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).</li>
<li>Mim, C., Unger, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+curvature+and+its+generation+by+BAR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Membrane curvature and its generation by BAR proteins.</a> Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).</li>
<li>Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+2+is+a+phosphatidylinositol+%284%2C5%29-bisphosphate+binding+protein+recruited+to+actin+assembly+sites+at+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes.</a> Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).</li>
<li>Gerke, V., Moss, S. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11917092">Annexins: from structure to function.</a> Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).</li>
<li>Heitzig, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+promotes+demand-driven+recruitment+of+AnxA8+to+cholesterol-containing+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).</li>
<li>Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25415330">Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces.</a> Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).</li>
<li>McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+membranes+in+studies+of+cell-cell+recognition+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).</li>
<li>Anderson, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+bilayers+on+silica+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of supported bilayers on silica substrates.</a> Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).</li>
<li>Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+adsorption+and+phospholipid+bilayer+formation+on+topographically+and+chemically+nanostructured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).</li>
<li>Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+a+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
<li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25513828">Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li>
<li>Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+liposomes+of+defined+size+distribution+by+extrusion+through+polycarbonate+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).</li>
<li>Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+lipid+vesicle+deposition+on+solid+surfaces%3A+a+combined+QCM-D+and+AFM+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study.</a> Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01337937">Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung.</a> Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).</li>
<li>Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/10.1063/1.1145396">Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).</li>
<li>Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+of+annexin+A2+to+cholesterol-and+phosphatidylinositol-4%2C+5-bisphosphate-containing+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).</li>
<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+push+and+internal+pull+forces+recruit+curvature-sensing+N-BAR+domain+proteins+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane.</a> Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+membranes+doped+with+PIP2%3A+influence+of+ionic+strength+and+pH+on+bilayer+formation+and+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization.</a> Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).</li>
<li>Bianco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+as+cell-based+biosensor+to+detect+and+study+cytoskeletal+alterations+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics.</a> Biotechnology Journal. , 1700699(2018).</li>
<li>Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance%3A+Sensing+cell-substrate+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).</li>
<li>Bragazzi, N. L., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1876162315000486">Advances in Protein Chemistry and Structural Biology</a>. Donev, R., et al. 101, Academic Press. 149-211 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące relacji struktura-funkcja błon komórkowych zarówno w sposób ilościowy, jak i jakościowy, biologia komórki czerpie ogromne korzyści z zastosowania podejść biofizycznych opartych na dobrze ugruntowanych i szeroko stosowanych technikach, w tym mikroskopii sił atomowych (AFM), powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i zastosowanej tu technice QCM-D. Wykazaliśmy w poprzednich badaniach, że białka aneksyny wiążą się w sposób zależny od Ca2 + z unieruchomioną błoną z dużym powinowactwem. Używamy przesunięć częstotliwości i rozproszenia 7. alikwotu (Δf7), ponieważ stanowi to najlepszy kompromis między czułością detekcji a stabilnością oscylacji.
Technika ta pozwala również na ilościowy opis interakcji błona-białko. Wiązanie AnxA2 z błoną charakteryzuje się dodatnią kooperatywnością, w której pośredniczy konserwatywna domena rdzeniowa aneksyny i zależy od obecności cholesterolu. Dane ilościowe uzyskane dla AnxA2 i AnxA8 przedstawiono szczegółowo w innym miejscu 6,8.
W tym protokole jest wiele krytycznych kroków. Użyj liposomów natychmiast; W przeciwnym razie małe pęcherzyki mogą łączyć się w większe pęcherzyki o mniejszym napięciu powierzchniowym, co prowadzi do zahamowania tworzenia dwuwarstwy lipidowej. Podczas pomiarów utrzymuj stałą temperaturę. Każde niewielkie odchylenie temperatury powoduje niebagatelne przesunięcie częstotliwości i rozpraszania. Unikaj pęcherzyków powietrza; W przeciwnym razie system jest niestabilny i nie ustanowi punktu odniesienia.
Równanie Sauerbreya pozwala na bezpośrednie przekształcenie obserwowanych zmian częstotliwości na zmiany masy i dlatego jest szeroko stosowane. Jednak założenie liniowej korelacji między zmianą częstotliwości rezonansowej a dodaną masą jest prawdziwe tylko w przypadku komponentów tworzących sztywną i jednolitą warstwę na powierzchni czujnika. Równania Sauerbreya nie można stosować do adsorbentów lepkosprężystych, takich jak bogate w wodę folie białkowe, warstwy lipidowe z wbudowaną wodą, a nawet zaadsorbowane komórki. W tym przypadku wymagane są bardziej złożone modele matematyczne. Dlatego niezwykle ważne jest jednoczesne monitorowanie zmian częstotliwości i rozpraszania. Aby wykryć zmiany strukturalne podczas pomiaru, można wykreślić stosunek ΔD do Δf, z linią prostą wskazującą brak zmian konformacyjnych.
Dużą zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania jako podłoży bardzo szerokiej gamy materiałów. Co więcej, jest to wiarygodna i bezpośrednia metoda badania szerokiego zakresu oddziaływań makromolekularnych, ponieważ prawidłowe tworzenie się warstw powłoki powierzchniowej (takich jak SLB), a także dalsze interakcje białko-lipid, mogą być monitorowane online.
Protokół ten można zastosować do innych białek oddziałujących z błoną, na przykład białek domeny BAR19, rodziny białek ERM (ezrin, radixin i moesin), która odgrywa ważną rolę w wiązaniu błona-cytoszkielet 20,21,22 lub białek zawierających domeny C2 lub PH. Co więcej, z powodzeniem opublikowano szeroki zakres zastosowań tej techniki do badania materiałów biologicznych, co sprawia, że QCM jest dobrze dopasowaną platformą eksperymentalną do badania interakcji bardziej złożonych zespołów makromolekularnych, a nawet komórek23,24.

Błony komórkowe są bardzo dynamicznymi i złożonymi strukturami. Złożona mieszanina lipidów błonowych, wraz z obwodowo i/lub integralnie związanymi białkami błonowymi, łączy się, tworząc mikrodomeny. Skoordynowana organizacja czasowo-przestrzenna tych mikrodomen błonowych jest zaangażowana w kluczowe procesy fizjologiczne1. Dynamika mikrodomen błonowych jest napędzana przez wzajemne oddziaływanie lipidów błonowych, a także przez zdolność białek błony obwodowej do rozpoznawania i interakcji z lipidami wzbogaconymi w mikrodomeny. Rekrutacja białek do określonych lipidów jest często osiągana za pomocą modułów rozpoznawania lipidów, takich jak homologia pleckstrin (PH) lub domeny C22,3. Biofizyczne metody analityczne wykorzystujące błony modelowe są kluczem do zrozumienia podstawowych zasad rządzących tymi procesami na poziomie molekularnym.
Załączniki, duża rodzina wielogenowa, są dobrze znane ze swojej zdolności do wiązania się z ujemnie naładowanymi lipidami błonowymi, głównie fosfatydyloseryną (PS), w sposób kontrolowany przez Ca2+2. Drugą cechą charakterystyczną rodziny aneksin jest obecność konserwatywnego segmentu strukturalnego, powtórzenia aneksyny, który występuje cztery lub osiem razy i zawiera miejsca wiązania Ca2+ i fosfolipidów4. Interakcja lipidowa zależna od Ca2 + umieszcza aneksyny w idealnej pozycji do wyczuwania i przekazywania sygnalizacji za pośrednictwem Ca2 + do błon docelowych. Konsekwentnie, aneksyny są w stanie indukować tworzenie mikrodomen wzbogaconych w cholesterol, fosfatydyloinozytol-4,5-bisfosforan (PI(4,5)P2) i PS, zarówno w komórkowych, jak i / lub sztucznych systemach błonowych5. Protokół ten opisuje podejście do analizy interakcji aneksyna-membrana przy użyciu rozpraszania mikrowagi kryształu kwarcu (QCM-D)6,7,8.
Podstawowym elementem tej mikrowagi jest oscylujący kryształ, który służy jako powierzchnia czujnika. Adsorpcja i/lub wiązanie cząsteczek z powierzchnią czujnika zmniejsza częstotliwość rezonansową (f) proporcjonalnie do wzrostu masy. Jeśli powierzchnia jest równomiernie pokryta folią, wiązanie dodatkowych substancji może zakłócać integralność strukturalną tej warstwy, a takie zmiany lepkosprężystości (współczynnik rozpraszania energii D) mogą być dodatkowo monitorowane. Jest to szeroko rozpowszechniona technika badania interakcji białek z dwuwarstwami lipidowymi. W tym podejściu pęcherzyki lipidowe są absorbowane na odpowiednio pokrytą powierzchnię czujnika. Tworzenie dwuwarstwowych warstw lipidowych jest korzystne w przypadku materiałów na bazie krzemionki9,10, ponieważ pęcherzyki często nie pękają na innych powierzchniach hydrofilowych, takich jak gold11 utlenione po ekspozycji na promieniowanie UV, TiO212, lub Al2O313. Pęknięcie koalescencyjnych pęcherzyków uwalnia fazę wodną, prowadząc do charakterystycznych zmian masy i dysprosacji. Wytwarzanie dwuwarstw podpartych ciałem stałym (SLB) przez fuzję pęcherzyków jest proste i wytrzymałe i może być wykorzystywane do generowania złożonych modeli naśladujących błony komórkowe.
Rozpraszająca mikrowaga kryształu kwarcu jest techniką bezetykietową i czułą. Dużą zaletą jest możliwość powlekania dowolnego materiału, który generuje wystarczająco cienką warstwę na powierzchni, zapewniając tym samym szeroki zakres zastosowań w różnych obszarach badawczych. Interakcja białko-błona jest obserwowana w czasie rzeczywistym, a wyniki mogą być analizowane bezpośrednio. Ta sama powierzchnia czujnika może być wykorzystana w kolejnych pomiarach (po wykonaniu minimalnego czyszczenia zgodnie z opisem w niniejszym protokole), co pozwala na dokładne kontrole wewnętrzne i porównywalność między analitami.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Merck</td><td>017-013-00-2</td><td>99%</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth</td><td>4432.1</td><td>99%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0878</td><td>99%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3493</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850155P</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>840034P</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>183</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extruder Liposofast</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qsense E4 Analyzer</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QSense Dfind</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump IPC 4</td><td>Ismatec</td><td>ISM 930</td><td></td></tr><tr><td>QSX 303 SiO2 Dwutlenek krzemu 50nm</td><td>Qsense</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>PC Membrany 0,05&mu; m</td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>610003</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>wersja 8 i 9</td></tr></tbody></table>

mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny a2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Technika dyssypatywnego mikrobalansu kryształu kwarcu to proste i bezznacznikowe podejście do jednoczesnego pomiaru absorpcji masy i właściwości lepkosprężystych wchłoniętej/unieruchomionej masy na powierzchniach czujników, co pozwala na pomiary interakcji białek z powierzchniami opartymi na ciałach stałych, takimi jak dwuwarstwy lipidowe, w czasie rzeczywistym i z wysoką czułością. Aneksyny są wysoce konserwatywną grupą białek wiążących fosfolipidy, które oddziałują odwracalnie z ujemnie naładowanymi grupami głowy poprzez koordynację jonów wapnia. W tym miejscu opisujemy protokół, który został zastosowany do ilościowej analizy wiązania aneksyny A2 (AnxA2) z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi przygotowanymi na powierzchni czujnika kwarcowego. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem uzyskiwania solidnych i powtarzalnych danych i zawiera szczegółowy opis krok po kroku. Metodę tę można zastosować do innych białek wiążących błonę i kompozycji dwuwarstwowych.

Spadek częstotliwości rezonansowej (Δf) koreluje liniowo z masą zaadsorbowaną (Δm), zgodnie z równaniem Sauerbreya.17
<img alt="Wzór na zmianę częstotliwości Δf=-Cf(Δm/A), związany z czułością masy; ilustracja równania." src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
W tym równaniu f jest częstotliwością rezonansową, Cf to stała zależna od charakterystyki geometrycznej i fizycznej danego kwarcu oraz częstotliwości rezonansowej, a A to powierzchnia czujnika.
W większości zastosowań warstwa zaadsorbowana nie jest całkowicie sztywna, lecz wykazuje właściwości wiskoelastyczne. Wynikające z tego tłumienie oscylacji czujnika kwarcowego określa się jako dyssypację (D). Monitorowane zmiany dyssypacji (ΔD) korelują z właściwościami wiskoelastycznymi związanej masy18 i są definiowane w następujący sposób8.
<img alt="Równanie współczynnika tłumienia (D=E_dissipated/2πE_stored), równowaga statyczna, schemat formuły." src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
Tutaj Edissipated to energia utracona podczas jednego okresu oscylacji, a Estored to całkowita energia swobodnie oscylującego czujnika.
Aby przeanalizować i określić ilościowo parametry wiązania, wyznacza się izotermy częstotliwości poprzez wykreślenie równowagowych przesunięć częstotliwości (ΔΔfe) w funkcji stężenia białek. ΔΔfe definiuje się jako
<img alt="Wzór na równowagę statyczną ΔΔfe=[(Δft2−Δftt)]; wyrażenie matematyczne dla analizy fizycznej." src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">
W tym przypadku Δft1 reprezentuje początek adsorpcji białek, a Δft2 stan równowagi. Nieliniowe dopasowanie krzywej można przeprowadzić, stosując rozwinięcie równania Langmuira według modelu Hilla w następujący sposób6,8.
<img alt="Równanie wiązania białek; formuła ilustrująca dynamikę oddziaływań białko-ligand; schemat edukacyjny." src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4">
W tym przypadku ΔΔfmax to ΔΔfe dla stężenia białka skutkującego maksymalnym (nasycającym) wiązaniem, Kd to pozorna stała dysocjacji dla kompleksu białko/błona, a n to współczynnik Hilla.
Współczynnik Hilla (n) opisuje kooperatywność wiązania. Dla n = 1 model adsorpcji Hilla jest prostą izotermą Langmuira (miejsca wiązania są równoważne, a wszystkie cząsteczki wiążą się z dwuwarstwą lipidową niezależnie od siebie). Jeśli n ≠ 1, związany ligand zmienia powinowactwo wiązania błonowego dla innych ligandów, zwiększając (n &gt; 1, kooperatywność dodatnia) lub zmniejszając (n &lt; 1, kooperatywność ujemna) to powinowactwo.
Rysunek 1 przedstawia schemat przepływu eksperymentalnego stosowanego w naszym laboratorium do pomiaru przesunięć rezonansu i częstotliwości podczas zależnego od Ca2+ wiązania oraz uwalniania AnxA2 do dwuwarstwy lipidowej w fazie ciekłej. Przykładowy zapis przedstawiono na Rysunku 2. Rysunek 2A pokazuje zapis krzywej częstotliwości, a Rysunek 2B pokazuje przesunięcia dyssypacji. Wyraźny spadek częstotliwości po dodaniu liposomów (Rysunek 2A [krok 1]) wskazuje na ich adsorpcję. Ponieważ pęcherzyki wypełnione buforem nie są sztywne, lecz wiskoelastyczne, dyssypacja wzrasta (Rysunek 2B [krok 1]). Następnie scalające się pęcherzyki pękają. Towarzyszące temu uwalnianie buforu z wnętrza pęcherzyków zmniejsza masę zaadsorbowaną, aż do osiągnięcia stabilnego plateau (Rysunek 2A [krok 2]). Należy zauważyć, że dodanie pęcherzyków powoduje wysokie przesunięcie dyssypacji, podczas gdy przesunięcie w odpowiedzi na dwuwarstwę jest znacznie mniejsze ze względu na sztywną, jednorodną naturę SLB (Rysunek 2B [krok 2]). Krok 3 na Rysunku 2A i 2B rejestruje wiązanie AnxA2 do lipidów, co zwiększa masę, co widać po wyraźnym przesunięciu częstotliwości, ale nie zakłóca struktury dwuwarstwy, co wskazuje jedynie niewielka zmiana dyssypacji. Po usunięciu Ca2+ przez czynnik chelatujący EGTA (Rysunek 1 oraz Rysunek 2 [krok 4]), AnxA2 dysocjuje z filmu lipidowego. Zapisy częstotliwości, jak i dyssypacji, przesuwają się do poziomów obserwowanych dla samej dwuwarstwy (porównaj kroki 2 i 4 na Rysunku 2A i 2B), co wskazuje, że wiązanie AnxA2 jest całkowicie zależne od Ca2+, a film lipidowy pozostaje nienaruszony.
AnxA2, podobnie jak większość anneksyn, zależy od lipidów o ładunku ujemnym, takich jak PS. Jest to wyraźnie widoczne w przypadku braku POPS w dwuwarstwie lipidowej (Rycina 3). Rycina 3A przedstawia zapis krzywej częstotliwości, a Rycina 3B pokazuje przesunięcia dyssypacji. Należy zauważyć, że częstotliwość przesuwa się do stabilnej linii bazowej przy -25 Hz, podczas gdy dyssypacja pozostaje niezmieniona (Rycina 3B [krok 2]), co wskazuje na prawidłowy proces tworzenia dwuwarstwy. Jednak po dodaniu AnxA2 w obecności Ca2+ (Rycina 3A i 3B [krok 3]) lub EGTA (Rycina 3A i 3B [krok 4]) nie obserwuje się zmian częstotliwości (Rycina 3A) ani dyssypacji (Rycina 3B), ponieważ AnxA2 nie może oddziaływać z filmem lipidowym.
<img alt="Proces fuzji dwuwarstwy lipidowej z jonami wapnia, EGTA; schemat badania błony." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Model graficzny schematu eksperymentalnego. Schemat ten przedstawia adsorpcję pęcherzyków do hydrofilowej powierzchni sensora (krok 1), fuzję/rozpad pęcherzyków prowadzący do powstania SLB (krok 2), a następnie zależną od Ca2+ adsorpcję (krok 3) i zależną od EGTA desorpcję AnxA2 (krok 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Częstotliwość i dyssypacja w czasie, wykres przedstawia proces dynamiczny w eksperymencie spektroskopowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykładowy zapis. Panele te przedstawiają (A) monitorowanie zależne od czasu częstotliwości rezonansowej 7. alikwotu oraz (B) przesunięcia dyssypacji czujników kwarcowych podczas pomiaru. Aplikacja liposomów powoduje gwałtowny spadek linii bazowej częstotliwości, podczas gdy linia bazowa dyssypacji wzrasta (krok 1). Stabilizacja linii bazowych wskazuje na formowanie się dwuwarstwy (krok 2). Adsorpcja AnxA2 (200 nM) (w obecności Ca2+) na dwuwarstwie lipidowej zawierającej POPS powoduje przyrost masy bez istotnej zmiany dyssypacji, co wskazuje, że film lipidowy nie został zaburzony (krok 3). Powrót linii bazowej częstotliwości po chelatowaniu Ca2+ za pomocą EGTA wskazuje na całkowną desorpcję białka (krok 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres spektroskopowy przedstawiający Δf i ΔD w funkcji czasu dla analizy absorpcji i emisji optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Eksperyment z kontrolą negatywną, wykazujący, że AnxA2 nie wiąże się z SLB w przypadku braku POPS. Panele te przedstawiają dodawanie liposomów i tworzenie SLB (kroki 1 i 2). Po dodaniu AnxA2 (krok 3; 200 nM, w obecności Ca2+) lub EGTA (krok 4) nie obserwuje się zmian w (A) częstotliwości ani (B) dyssypacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Skład</td>
			<td>ΔΔF/Hz po utworzeniu SLB</td>
			<td>ΔΔD*10-6 po utworzeniu SLB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS 
			(80 : 20)</td>
			<td>26.3 ± 0.2</td>
			<td>0.26 ± 0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/PI(4,5)P22 
			(95 : 5)</td>
			<td>26.5 ± 0.5</td>
			<td>0.31 ± 0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS/Chol 
			(60 : 20 : 20)</td>
			<td>29.2 ± 0.2</td>
			<td>0.45 ± 0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS/PI(4,5)P22/Chol 
			(60 : 17 : 3 : 20)</td>
			<td>29.6 ± 0.6</td>
			<td>0.43 ± 0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol 
			(37 : 20 : 20 : 3 : 20)</td>
			<td>29.4 ± 0.4</td>
			<td>0.39 ± 0.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Dane dotyczące składu lipidowego i tworzenia SLB7.

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół, który może być wykorzystany do określenia powinowactwa wiązania i sposobu interakcji bezznacznikowego białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z immobilizowanymi dwuwarstwami opartymi na ciele stałym (SLB) poprzez jednoczesny pomiar wychwytu masy i właściwości lepkosprężystych białka anektyny A2.

Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Ta metoda może pomóc w badaniu kierunków białek z błonami lipidowymi. W naszym przypadku użyj go do analizy zależnego od wapnia wiązania aneksyn z ujemnie naładowanymi fosfolipidami. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest wolna od etykiet, czuła, ilościowa oraz że interakcje można obserwować w czasie rzeczywistym.Pozwala to na bezpośrednią analizę rzeczywistych wyników. Technika ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak interakcja bardziej złożonych zespołów mikromolekuł, a nawet komórek. Stosować klarowne pięciomilimolowe roztwory lipidowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym w 10-mililitrowych szklanych probówkach. Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w wysokopróżniowym systemie liofilizacji na trzy godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalników.Teraz ponownie zawieś film lipidowy w jednym mililitrze buforu cytrynianu. Zawiesinę lipidową inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej, energicznie wirując ją co pięć minut. Temperatura ta jest o około 10 stopni Celsjusza wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie.W międzyczasie podgrzej wytłaczarkę wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy 50 nanometrów o średnicy porów powyżej temperatury przejścia przez 30 minut. Załaduj zawiesinę pęcherzyków wielopłytkowych do podgrzanej wytłaczarki. Delikatnie przepuść mieszaninę 31 razy przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe lub SUV.Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia. Przenieś zawieszenie SUV do dwumililitrowego plastikowego naczynia reakcyjnego i dodaj bufor cytrynianu, aby doprowadzić końcową objętość do dwóch mililitrów. Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez co najmniej 30 minut.Następnie dokładnie umyj je ultra czystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i wypróbuj je przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu. Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. W tym celu należy włożyć suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnić komorę i trzykrotnie przepłukać ją tlenem.Następnie włącz myjkę plazmową. Użyj próżni, mocy o wysokiej częstotliwości radiowej i 10 minut czasu procesu. Po zakończeniu czyszczenia wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w czterech komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rur, które mogą powodować wycieki. Przepłukać system buforem cytrynianowym w trybie otwartego przepływu przez 10 minut.Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozpraszania pierwszego podstawowego tonu i alikwotów za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się. Gdy linie podstawowe są stabilne, zastosuj zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym.Za pomocą naczynia reakcyjnego usuń 1,5 mililitra martwej objętości, a następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj przesunięcie rozpraszania częstotliwości przez kolejne 10 minut. Gdy SLB jest stabilny, należy zrównoważyć układ z pracującym buforem o wymaganych stężeniach wapnia w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.Dodać białko do buforu biegowego zawierającego wapń. Aplikację białka należy wykonywać w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi. Teraz zdysocjuj związane białko poprzez chelatację jonów wapnia z pięcioma milimolowymi EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu.Zregeneruj układ mikrowagi za pomocą 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody w trybie ciągłego przepływu otwartego. Wyjmij rurki z pojemnika na wodę i pozostaw system do wyschnięcia. Ostrożnie wyjmij czujnik kryształkowy i wyczyść go 2% roztworem SDS za pomocą uchwytu z politetrafluoroetylenu.Osusz widoczne części wnętrza modułu przepływowego, w którym został umieszczony czujnik. Pokazany tutaj jest zapis krzywej częstotliwości i przesunięć rozpraszania. Wyraźny spadek częstotliwości po dodaniu liposomów wskazuje na ich wchłanianie, ponieważ pęcherzyki wypełnione buforem nie są sztywne, ale lepkosprężyste, rozpraszanie wzrasta.Następnie dochodzi do pęknięcia zlewających się pęcherzyków. Równoczesne uwalnianie buforu wewnątrz pęcherzyków zmniejsza zaadsorbowaną masę, aż do osiągnięcia stabilnego plateau. Wiązanie aneksyny A2 z lipidami zwiększa masę, co widać po wyraźnym przesunięciu częstotliwości, ale nie zakłóca struktury dwuwarstwowej, na co wskazuje jedyna niewielka zmiana w dyssypacji.Gdy jon wapnia jest usuwany przez czynnik chelatujący, EGTA, aneksyna A2 dysocjuje od filmu lipidowego. Zapisy częstotliwości i dyssypacji przesuwają się do poziomów widocznych dla dwuwarstwy, co wskazuje tylko, że wiązanie aneksyny A2 jest całkowicie zależne od jonu wapnia i że film lipidowy pozostaje nienaruszony. Reprezentatywny eksperyment kontroli ujemnej przedstawiono tutaj.W przypadku braku fosfatydyloseryny nie są widoczne żadne zmiany w częstości występowania lub rozproszeniu po dodaniu aneksyny A2 w obecności jonu wapnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić prawidłowe tworzenie dwuwarstwy. Użyj liposomów natychmiast, w przeciwnym razie małe pęcherzyki połączą się w większe o mniejszym napięciu powierzchniowym, co może prowadzić do niestabilnej linii podstawowej.Po tej procedurze można przeprowadzić ilościowy opis interakcji białka błonowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wiązanie kooperatywne i niekooperatywne.

dissipative-microgravimetry-to-study-binding-dynamics-phospholipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Ten film demonstruje technikę dyssypatywnej mikrograwimetrii do badania wiązania białek z dwuwarstwami lipidów. Małe pęcherzyki jednowarstwowe są dodawane w celu pokrycia powierzchni czujnika kwarcowego mikrowagi. Wykorzystując zależne od jonów wapnia wiązanie docelowego białka wiążącego fosfolipidy z dwuwarstwą, monitorowane są zmiany częstotliwości oscylacji czujnika i rozproszenie oscylacji w celu określenia charakteru wiązania dwuwarstwy białkowo-lipidowej.

Technika mikrograwimetrii dyssypatywnej do badania interakcji białkowo-lipidowej dwuwarstwowej

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Mikrowaga kryształu kwarcu może zapewnić dokładne właściwości masy i lepkosprężystości dla folii w zakresie mikronów lub submikronów, co jest istotne dla badań w zakresie czujników biomedycznych i środowiskowych, powłok i nauki o polimerach. Grubość próbki ma wpływ na to, jakie informacje można uzyskać z materiału mającego kontakt z czujnikiem.

Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj mikrograwimetrię dyssypatywną do badania wiązań białka aneksyna A2 z dwuwarstwami lipidowymi. Ta bezetykietowa metoda umożliwia ilościową analizę w czasie rzeczywistym.

Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego (Wideo) | JoVE Journal

Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

Przeglądaj więcej filmów