Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

Ta metoda może pomóc w badaniu kierunków białek z błonami lipidowymi. W naszym przypadku użyj go do analizy zależnego od wapnia wiązania aneksyn z ujemnie naładowanymi fosfolipidami. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest wolna od etykiet, czuła, ilościowa oraz że interakcje można obserwować w czasie rzeczywistym.

Pozwala to na bezpośrednią analizę rzeczywistych wyników. Technika ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak interakcja bardziej złożonych zespołów mikromolekuł, a nawet komórek. Stosować klarowne pięciomilimolowe roztwory lipidowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym w 10-mililitrowych szklanych probówkach. Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w wysokopróżniowym systemie liofilizacji na trzy godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalników.

Teraz ponownie zawieś film lipidowy w jednym mililitrze buforu cytrynianu. Zawiesinę lipidową inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej, energicznie wirując ją co pięć minut. Temperatura ta jest o około 10 stopni Celsjusza wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie.

W międzyczasie podgrzej wytłaczarkę wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy 50 nanometrów o średnicy porów powyżej temperatury przejścia przez 30 minut. Załaduj zawiesinę pęcherzyków wielopłytkowych do podgrzanej wytłaczarki. Delikatnie przepuść mieszaninę 31 razy przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe lub SUV.

Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia. Przenieś zawieszenie SUV do dwumililitrowego plastikowego naczynia reakcyjnego i dodaj bufor cytrynianu, aby doprowadzić końcową objętość do dwóch mililitrów. Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez co najmniej 30 minut.

Następnie dokładnie umyj je ultra czystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i wypróbuj je przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu. Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. W tym celu należy włożyć suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnić komorę i trzykrotnie przepłukać ją tlenem.

Następnie włącz myjkę plazmową. Użyj próżni, mocy o wysokiej częstotliwości radiowej i 10 minut czasu procesu. Po zakończeniu czyszczenia wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.

Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w czterech komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rur, które mogą powodować wycieki. Przepłukać system buforem cytrynianowym w trybie otwartego przepływu przez 10 minut.

Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozpraszania pierwszego podstawowego tonu i alikwotów za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się. Gdy linie podstawowe są stabilne, zastosuj zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym.

Za pomocą naczynia reakcyjnego usuń 1,5 mililitra martwej objętości, a następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj przesunięcie rozpraszania częstotliwości przez kolejne 10 minut. Gdy SLB jest stabilny, należy zrównoważyć układ z pracującym buforem o wymaganych stężeniach wapnia w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.

Dodać białko do buforu biegowego zawierającego wapń. Aplikację białka należy wykonywać w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi. Teraz zdysocjuj związane białko poprzez chelatację jonów wapnia z pięcioma milimolowymi EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu.

Zregeneruj układ mikrowagi za pomocą 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody w trybie ciągłego przepływu otwartego. Wyjmij rurki z pojemnika na wodę i pozostaw system do wyschnięcia. Ostrożnie wyjmij czujnik kryształkowy i wyczyść go 2% roztworem SDS za pomocą uchwytu z politetrafluoroetylenu.

Osusz widoczne części wnętrza modułu przepływowego, w którym został umieszczony czujnik. Pokazany tutaj jest zapis krzywej częstotliwości i przesunięć rozpraszania. Wyraźny spadek częstotliwości po dodaniu liposomów wskazuje na ich wchłanianie, ponieważ pęcherzyki wypełnione buforem nie są sztywne, ale lepkosprężyste, rozpraszanie wzrasta.

Następnie dochodzi do pęknięcia zlewających się pęcherzyków. Równoczesne uwalnianie buforu wewnątrz pęcherzyków zmniejsza zaadsorbowaną masę, aż do osiągnięcia stabilnego plateau. Wiązanie aneksyny A2 z lipidami zwiększa masę, co widać po wyraźnym przesunięciu częstotliwości, ale nie zakłóca struktury dwuwarstwowej, na co wskazuje jedyna niewielka zmiana w dyssypacji.

Gdy jon wapnia jest usuwany przez czynnik chelatujący, EGTA, aneksyna A2 dysocjuje od filmu lipidowego. Zapisy częstotliwości i dyssypacji przesuwają się do poziomów widocznych dla dwuwarstwy, co wskazuje tylko, że wiązanie aneksyny A2 jest całkowicie zależne od jonu wapnia i że film lipidowy pozostaje nienaruszony. Reprezentatywny eksperyment kontroli ujemnej przedstawiono tutaj.

W przypadku braku fosfatydyloseryny nie są widoczne żadne zmiany w częstości występowania lub rozproszeniu po dodaniu aneksyny A2 w obecności jonu wapnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić prawidłowe tworzenie dwuwarstwy. Użyj liposomów natychmiast, w przeciwnym razie małe pęcherzyki połączą się w większe o mniejszym napięciu powierzchniowym, co może prowadzić do niestabilnej linii podstawowej.

Po tej procedurze można przeprowadzić ilościowy opis interakcji białka błonowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wiązanie kooperatywne i niekooperatywne.