Synteza, charakterystyka i zastosowanie superparamagnetycznych nanosond tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej

Na całym świecie rozpoznanie gruźlicy pozapłucnej jest często opóźnione, ponieważ wymaga interwencji chirurgicznej w celu potwierdzenia z powodu niespecyficznego obrazu klinicznego i słabych wyników w testach diagnostycznych. Aby usprawnić serologiczne testy diagnostyczne na obecność antygenów Mycobacterium tuberculosis, opracowaliśmy superparamagnetyczne nanosondy tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej. Nanosondy TB-SPIO mogą dostarczać precyzyjne obrazy rezonansu magnetycznego przy niskich stężeniach ze względu na swoje właściwości paramagnetyczne bez wywoływania odpowiedzi autoimmunologicznej.

Nanosondy TB-SPIO umożliwiają celowanie i wykrywanie zakażenia Mycobacterium tuberculosis. Mogą być również stosowane jako środek kontrastowy MRI do wykrywania innych chorób. Pamiętaj, aby dokładnie zapoznać się z protokołem przed przystąpieniem do protokołu, ponieważ każda część eksperymentu wykorzystuje określoną podstawową technologię.

Wizualna demonstracja metody może pomóc uczniom zrozumieć, jak wdrożyć proces, zwłaszcza w przypadku niektórych bardziej skomplikowanych eksperymentów. Aby przygotować nanocząstki magnetyczne tlenku żelaza pokryte dektranem, energicznie połącz pięć mililitrów dekstranu T40 z 45 miligramami sześciowodnego roztworu chlorku żelaza i 32 miligramami czterowodnych roztworów chlorku żelazawego w temperaturze pokojowej. Szybko dodaj 10 mililitrów wodorotlenku amonu i użyj mieszadła, aby mieszać powstałą czarną zawiesinę przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji z mieszaniem odwirować roztwór i usunąć agregaty. Aby oddzielić końcowe produkty SPIO od niezwiązanego dekstranu T40, należy załadować całą pięciomililitrową mieszaninę reakcyjną do kolumny chromatografii z filtracją żelową o wymiarach 2,5 na 33 centymetry i wymyć dekstran 0,1-molowym octanem sodu i 0,15-molowym roztworem buforowym chlorku sodu. Następnie zbierz oczyszczone nanocząstki magnetyczne tlenku żelaza pokryte dekstranem w pustej przestrzeni i oznacz wymywanie kolumny na obecność żelaza i dekstranu na głębokości 330 i 490 nanometrów zgodnie ze standardowymi protokołami.

Aby wytworzyć przeciwciała powierzchniowe Mycobacterium tuberculosis sprzężone z SPIO, najpierw zsyntetyzuj bezwodnik bursztynowy SPIO-EDBE, mieszając 10 mililitrów alkalicznego roztworu SPIO-EBDE z jednym gramem bezwodnika bursztynowego przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnego dnia użyj od 12 000 do 4 000 rurek z porowatą membraną molekularną o masie cząsteczkowej do dializowania roztworu z 26-godzinnymi zmianami dwóch litrów wody destylowanej na zmianę. Po ostatniej zmianie dodać 100 mikrolitrów powstałego roztworu do 400 mikrolitrów 4,5 miligrama na mililitr TB przeciwciała powierzchniowego, a następnie dodać 1-hydroksybenzotriazol i heksafluorofosforan benzotriazolu-1-yloksytrirolidinofosfonium jako katalizatory w temperaturze pokojowej przez 24 godziny z mieszaniem.

Oddzielić roztwory od niezwiązanego przeciwciała za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej, używając PBS jako buforu. Aby określić średnią wielkość cząstek, morfologię i rozkład wielkości, odlew dyspersję kompozytową na miedzianą siatkę o oczkach 200 i wysusz próbkę na powietrzu w temperaturze pokojowej przed załadowaniem do transmisyjnego mikroskopu elektronowego w celu obrazowania przy 100 kilowoltach. Aby zmierzyć wartości czasu relaksacji nanosond, użyj relaksometru magnetycznego rezonansu jądrowego o częstotliwości 20 megaherców i temperaturze 37 stopni Celsjusza plus minus jeden stopień.

W przypadku obrazowania komórek pulsacyjnych za pomocą nanosondy, najpierw hoduj ludzkie monocyty THP-1 zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną odpowiedni etap aktywacji, należy przeprowadzić preinkubację jeden razy 10 do siedmiu monocytów z jednym razy 10 do szóstych jednostek tworzących kolonię Mycobacterium bovis BCG przez jedną godzinę. Pod koniec inkubacji przenieś komórki do jednomililitrowych probówek mikrowirówek i dodaj dwa milimole SPIO Mycobacterium tuberculosis powierzchniowo sprzężonych z przeciwciałami nanosondy do każdej probówki na godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach świeżej pożywki. Następnie zeskanuj próbki za pomocą szybkiej sekwencji impulsów echa gradientowego za pomocą rezonansu magnetycznego 3,0-T, aby określić specyficzność i czułość nanosond. Aby zaszczepić zwierzęta doświadczalne M.bovis BCG, należy najpierw rozpuścić liofilizowaną szczepionkę lub materiał bakteryjny w pożywce Saautona i rozcieńczyć odtworzony roztwór podstawowy solą fizjologiczną.

Następnie załaduj 100 mikrolitrów roztworu do jednej mililitrowej strzykawki na zwierzę i wstrzyknij śródskórnie całą objętość bakterii w lewą lub prawą skórę łopatki grzbietowej każdej myszy. W przypadku obrazowania metodą rezonansu magnetycznego in vivo żywych zwierząt, którym wstrzyknięto nanosondę, należy uzyskać podstawowe obrazy szybkiego echa spinowego T2 każdego znieczulonego zwierzęcia doświadczalnego przed wstrzyknięciem dwóch nanomolowych sond przeciwciał SPIO-TB zawieszonych w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej do żyły ogonowej każdej myszy. Następnie należy ponownie zobrazować zwierzęta natychmiast po wstrzyknięciu i co pięć minut przez następne 30 minut.

Pod koniec sesji obrazowania przeanalizuj ilościowo wszystkie obrazy rezonansu magnetycznego, wykorzystując intensywność sygnału jako pomiar zdefiniowanych obszarów zainteresowania w porównywalnych lokalizacjach centrum ziarniniaka M. tuberculosis i mięśnia tylnego przylegającego do obszaru ziarniniaka. Następnie użyj wzoru do obliczenia względnych wzmocnień sygnału za pomocą pomiaru natężenia sygnału przed i od zera do trzech godzin po wstrzyknięciu środków kontrastowych. Miesiąc po inokulacji należy pobrać tkankę z śródskórnego miejsca inokulacji każdego zwierzęcia i zabarwić próbki tkanek o grubości od 5 do 10 mikrometrów zatopione w formalinie parafiną hematoksyliną i eozyną, barwnikami Ziehl-Neelsen dla bakterii kwasoodpornych i błękitem berlińskim dla żelaza.

Obrazowanie powierzchniowej nanosondy przeciwciał SPIO-TB za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawnia, że nanosondy wykazują dobrze zdyspergowany wygląd o średniej wielkości 3,8 plus minus 0,4 nanometra na rdzeń. M.bovis BCG i kwasoodporny szczep bakteryjny można wykryć za pomocą barwienia Ziehl-Neelsen. Po wyizolowaniu i wyhodowaniu za pomocą sond zawierających żelazo, bakterie można zidentyfikować za pomocą barwienia berlińskiego błękitu.

Stopień ukierunkowania nanosond powierzchniowych przeciwciał SPIO-TB na gruźlicę można określić za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego zależnego od T2, na co wskazuje spadek intensywności sygnału w obecności nanosond, który zachodzi w sposób zależny od stężenia. U zwierząt, którym wstrzyknięto nanosondę, poprawa T2-zależna od wpływu redukcji sygnału w obszarach ziarniniaków M. tuberculosis jest około 14-krotnie wyższa niż w miejscach kontrolnych. Miesiąc po zakażeniu można zaobserwować zorganizowanego ziarniniaka podskórnego u myszy C57 black 6, którym wstrzyknięto nanosondę, z nowym unaczynieniem krwi i agregatami makrofagów limfocytów i nabłonka odnotowanymi w tych zmianach.

Dodatnią ekspresję M. tuberculosis obserwuje się również w obszarach ziarniniakowych, w których pałeczki kwasoodporne są zabarwione dodatnio w miejscu uszkodzenia. Błękit berliński, dodatnia plama żelazowo-żelazowa, może być również użyta do określenia wrażliwości sond na gruźlicę. W przypadku obrazu życia metodą rezonansu magnetycznego in vivo, zwierzętom, którym wstrzyknięto nanosondę, uzyskuje wyjściowy T2-zależny obraz szybkiego echa spinowego każdego znieczulonego zwierzęcia doświadczalnego przed wstrzyknięciem sond przeciwciał SPIO-TB. Teraz, gdy opracowaliśmy technikę SOP do wykrywania gruźlicy pozapłucnej, przeciwciała te mogą być stosowane do specyficznego diagnozowania gruźlicy pozapłucnej.