Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych
11 lipca 2025
Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.
[Narrator] Korzystając z proteomiki przestrzennej, nazwanej Metodą Roku 2024 Nature Methods, można zmapować dokładne lokalizacje komórek odpornościowych wraz z interakcjami komórka-komórka w tkankach. Ujawnia to wzorce przestrzenne powiązane z wynikami klinicznymi. Budowanie złożonych paneli przeciwciał i obrazowanie tkanek o wysokiej fluorescencji endogennej stanowi znaczne wyzwanie czasowe, finansowe i specjalistyczne dla IBEX i innych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z IBEX, zidentyfikowano cechy specyficzne dla nowotworu u pacjentów z chłoniakiem grudkowym wysokiego ryzyka oraz we współpracy z kolegami z Human Cell Atlas. Stworzono kompleksową mapę przestrzenną grasicy ludzkiej. Niewiele wiadomo na temat składu komórek odpornościowych, interakcji przestrzennych i różnic w produkcji cytokin w różnych prątkowatych patologiach płuc. Niniejszy protokół wypełnia tę lukę. Protokół ten oferuje tanią, elastyczną metodę naświetlania w celu znacznego zmniejszenia autofluorescencji tkanek o szerokim spektrum, szczególnie w trudnych próbkach FFPE, przy jednoczesnym zachowaniu sygnału przeciwciał do analizy przestrzennej. Aby rozpocząć, zanurz szkiełka z tkanką w PBS po zakończeniu pobierania antygenu. Wyjmij jedno szkiełko z PBS i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie wysuszyć nadmiar buforu bez dotykania chusteczki. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obramowanie wokół sekcji tkanki na szkiełku. Po powtórzeniu procesu dla pozostałych szkiełek pozostaw bariery hydrofobowe do wyschnięcia na 10 minut. Następnie, za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, odsuń PBS z sekcji tkanki, nie dotykając jej bezpośrednio. Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego na szkiełko i zamknij komorę wilgotnościową. Umieść komorę w nienagrzewającej się naukowej kuchence mikrofalowej z mechanizmem regulacji temperatury i uruchom wcześniej ustalony program pięć cykli. Podczas inkubacji blokującej przygotować pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała 1 z haczykami i buforem blokującym zawierającym blok Fc. Połącz przeciwciała i delikatnie wymieszaj koktajl. Po zakończeniu cyklu mikrofalowego wyjmij i otwórz komorę szkiełka i odsuń bufor blokujący od szkiełka bez dotykania tkanki. Następnie dodać 200 mikrolitrów pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała 1 do szkiełka. Umieść komorę z powrotem w kuchence mikrofalowej i ponownie wykonaj program przeciwciał pierwotnych przez około 30 minut. Po zakończeniu znakowania przeciwciał pierwotnych trzymaj szkiełko pionowo. Aby umyć szkiełko, należy nanieść pipetą 1 000 mikrolitrów PBS na chusteczkę, pozwalając jej spłynąć. Odchiąć nadmiar PBS i przymocować szkiełko 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej. Po utrwaleniu dokładnie umyj szkiełko 1,000 mikrolitrami PBS trzy do pięciu razy i pozostaw warstwę PBS na tkance do etapu fotonaświetlania. Aby przygotować pudełko do naświetlania, zbierz 150-watową lampę LED, 40-watową lampę LED RGBW, duży plastikowy pojemnik o pojemności 75,71 litra lub większej, świeży PBS i szalkę Petriego. Teraz napełnij szalkę Petriego 1x PBS, aby całkowicie zanurzyć szkiełko. Procedurę naświetlania należy przeprowadzić w chłodni, aby zminimalizować ciepło z lamp. Następnie umieść szkiełko na szalce Petriego, upewniając się, że jest całkowicie zanurzone w PBS. Następnie umieść 40-watową lampę bezpośrednio nad szalką Petriego ze źródłem światła skierowanym w dół w kierunku szkiełka i ustaw lampę w trybie światła czerwonego. Na koniec włącz zarówno 150-watowe, jak i 40-watowe lampy i przykryj cały zestaw plastikową pokrywką pojemnika. Po dwóch godzinach przełącz lampę na zielone światło i inkubuj przez 16 godzin. Zidentyfikowano najjaśniejsze fluorofory zgodne z protokołem inaktywacji barwnika i sparowano je z markerami o niskiej ekspresji, aby poprawić wykrywanie sygnału. Autofluorescencja uległa znacznemu zmniejszeniu po naświetlaniu foto i przy dłuższych długościach fal obrazowania. Bezpośrednio sprzężone przeciwciała skierowane przeciwko markerom strukturalnym o wysokiej ekspresji, aktynie alfa-mięśni gładkich i cytokeratynie, zastąpione w kanale bliskiej podczerwieni na głębokości 750 nanometrów. Sygnał tła został odjęty obliczeniowo przy użyciu niebarwionego obrazu referencyjnego i arytmetyki SimpleITK, a prawdziwe sygnały zostały wzmocnione poprzez progowanie. Obrazowanie całych szkiełek wybarwionych IBEX ujawniło ziarniniaki z martwiczymi rdzeniami i CD15-dodatnimi neutrofilami. Mycobacterium tuberculosis lub prątki niegruźlicze wykryto w pobliżu rdzenia martwiczego ziarniniaka za pomocą przeciwciała antygenowego 85B. Tkanka limfatyczna związana z ziarniniakiem zawierała limfocyty B CD20-dodatnie, limfocyty T CD4-dodatnie, kilka limfocytów T CD8-dodatnich i znakowanie CD45 wszystkich komórek odpornościowych w płucach. Obrazowanie IBEX umożliwiło również wizualizację cech anatomicznych płuc, w tym komórek nabłonka oskrzeli, mięśni gładkich tętnic i makrofagów CD68-dodatnich.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nisko-kosztowa technikę fotoirradiacji, która poprawia obrazowanie tkanek ludzkich z natywną autofluorescencją. Protokół pozwala na wielokanałowe, pełnoslajdowe obrazowanie z zarchiwizowanych próbek klinicznych z wykorzystaniem szeroko dostępnych odczynników i oprogramowania open-source.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Mikroskopia fluorescencyjna
Tło
- Przestrzenna proteomika umożliwia mapowanie komórek odpornościowych i ich interakcji w obrębie tkanek.
- Istnieją wyzwania w budowaniu paneli przeciwciał i obrazowaniu tkanek o wysokiej endogeennej fluorescencji.
- Technika IBEX identyfikuje cechy specyficzne dla nowotworu u pacjentów z wysokim ryzykiem chłoniaka.
- Mało wiadomo o składzie komórek odpornościowych w patologiach dróg oddechowych wywołanych przez prątki.
Cel badania
- Aby zapewnić protokół, który zmniejsza autofluorescencję tkanek, zachowując sygnały przeciwciał.
- Aby ułatwić przestrzenną analizę komórek odpornościowych w złożonych próbkach tkankowych.
- Aby uzupełnić luki wiedzy na temat interakcji komórek odpornościowych w różnych patologiach.
Stosowane metody
- Slajdy z tkanką są zanurzane w PBS po pozyskiwaniu antygenu.
- Bufor blokujący i roztwory przeciwciał pierwotnych są przygotowywane i stosowane.
- Fotoirracjacja jest przeprowadzana przy użyciu specyficznych lamp LED, aby zmniejszyć autofluorescencję.
- Pełnoslajdowe obrazowanie jest przeprowadzane w celu wizualizowania interakcji komórek odpornościowych i cech tkanek.
Główne wyniki
- Uzyskano znaczne zmniejszenie autofluorescencji po fotoirradiacji.
- Granulomaty i typy komórek odpornościowych zostały zwizualizowane w tkance płucnej.
- Specyficzne przeciwciała wykryły Mycobacterium tuberculosis w pobliżu nekrotyzujących rdzeni.
- Obrazowanie IBEX ujawniło szczegółowe cechy anatomiczne tkanek płucnych.
Wnioski
- Protokół poprawia obrazowanie złożonych tkanek, minimalizując autofluorescencję.
- Zapewnia cennego narzędzia do badania interakcji komórek odpornościowych w różnych chorobach.
- Ta metoda może być dostosowana do szerokiego zakresu zastosowań klinicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
