Name: Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół fotopromieniowania redukujący autofluorescencję tkanek przy zachowaniu sygnałów przeciwciał. Ta metoda umożliwia wielokanałowe obrazowanie próbek klinicznych FFPE w celu analizy przestrzennej komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program DIR/NIAID, NCI i NHLBI. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender na podstawie umowy licencyjnej z NIH.

<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1</a> (2023).</li>
<li>Dahl, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+of+pulmonary+infections+with+nontuberculous+mycobacteria%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review.</a> Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).</li>
<li>Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in tuberculosis.</a> Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization%3A+A+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).</li>
<li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispectral+led+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li>
<li>Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+embedding+and+LED+autofluorescence+reduction+for+rodent+spinal+cord+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology.</a> J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+profiling+of+follicular+lymphoma+reveals+changes+in+tissue+architecture+and+enhanced+stromal+remodeling+in+high-risk+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients.</a> Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IBEX+knowledge-base%3A+A+central+resource+for+multiplexed+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques.</a> PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).</li>
<li>Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaniv%2C+Z+%22ArXiv%22">ArXiv</a>. , (2024).</li>
<li>Quardokus, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+mapping+antibody+panels%3A+A+community+resource+for+standardized+multiplexed+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging.</a> Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).</li>
<li>Mcshane, P. J., Glassroth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+disease+due+to+nontuberculous+mycobacteria%3A+Current+state+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights.</a> Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).</li>
<li>Hsu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GATA2+are+associated+with+the+autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+and+mycobacterial+infection+%28monomac%29+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome.</a> Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).</li>
<li>Vinh, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+with+susceptibility+to+mycobacteria%2C+fungi%2C+papillomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses.</a> Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+susceptibility+to+mycobacteria+is+caused+by+mutations+in+nemo+impairing+CD40-dependent+IL-12+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production.</a> J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).</li>
<li>Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fluorescence+of+NAD%28P%29H+in+whole-cell+preparations+of+tumours+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues.</a> Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).</li>
<li>Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+mitochondrial+deficiencies+in+living+cells+by+microspectrofluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry.</a> J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+ceroid+formation%3A+The+cellular+recycling+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system.</a> Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Mechanisms+of+age-related+accumulation+and+influence+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function.</a> Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).</li>
<li>Jung, T., Bader, N., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Formation%2C+distribution%2C+and+metabolic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences.</a> Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).</li>
<li>Sherratt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+and+the+ageing+elastic+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity and the ageing elastic fibre.</a> Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).</li>
<li>Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+collagen%3A+More+than+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Lung collagen: More than scaffolding.</a> Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+frequency-domain+fluorescence+spectroscopy+and+applications+to+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes.</a> Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).</li>
</ol>

A.J.R. jest pracownikiem Leica Microsystems, Inc. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kliniczna patologia płuc z gruźlicy płuc charakteryzuje się martwiczym zapaleniem ziarniniakowym. Patologia płuc NTM występuje głównie w dwóch odrębnych populacjach pacjentów z dwoma odrębnymi wzorcami patologicznymi: izolowanym uszkodzeniem płuc charakteryzującym się ziarniniakowym zapaleniem z zatarciem oskrzelików i tworzeniem się jam u osób immunokompetentnych lub rozlana choroba guzkowa wpływająca na płuca i inne narządy u osób z niedoborem odporności 13,14,15,16<...

Gruźlica (TB) jest jedną z głównych przyczyn zgonów, a każdego roku z powodu zakażenia gruźlicą umiera około 1,3 miliona osób1. Chociaż nie jest tak śmiertelna jak gruźlica, w ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost zakażeń płuc i wynikających z nich chorób wywoływanych przez prątki niegruźlicze (NTM)2. Na poziomie tkanek odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) została dobrze zbadana i obejmuje tworzenie ziarniniaków, heterogenicznych agregatów limfocytów, komórek dendrytycznych, makrofagów i neutrofili3. Podczas gdy zapalenie ziarniniakowe jest również podstawową cechą odporności gospodarza na zakażenie NTM, populacje komórek odpornościowych i charakterystyka przestrzenna tej odpowiedzi pozostają niedostatecznie zbadane. Uzyskanie szczegółowego zrozumienia tkankowych składników immunopatologii w porównaniu z gojeniem się ran ma kluczowe znaczenie dla opracowania metod leczenia (np. terapii kierowanych przez gospodarza) i profilaktycznych (tj. szczepionek) strategii terapeutycznych.
W tym badaniu nasz zespół miał dostęp do rzadkich, archiwalnych próbek klinicznych pobranych podczas resekcji płuc lub sekcji zwłok od pacjentów z zakażeniem Mtb lub NTM. Większość z tych próbek miała ponad 10 lat i była zachowana jako próbki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), co ograniczyło ich użycie do testów histologicznych. Aby przezwyciężyć ograniczenia markerów tradycyjnego obrazowania immunohistochemicznego (IHC) i immunofluorescencyjnego (IF), zastosowaliśmy metodę Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX), metodę obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, wysoce multipleksowaną 4,5. Rozszerzenie metody IBEX na próbki FFPE z ludzkich płuc wymagało znacznej optymalizacji ze względu na wysoki poziom endogennej fluorescencji, która jest dobrze opisaną przeszkodą w multipleksowanym obrazowaniu opartym na przeciwciałach6.
W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół redukcji autofluorescencji przy użyciu metody fotonapromieniania zoptymalizowanej pod kątem wycinków tkanek FFPE płuc 7,8. Co ważne, opisana tutaj metoda wykorzystuje niedrogą, powszechnie dostępną kaseton, którą można rozszerzyć na inne preparaty próbek o wysokiej autofluorescencji. Oprócz zmniejszenia autofluorescencji przed akwizycją obrazu, zapewniamy wskazówki dotyczące projektowania paneli przeciwciał, takie jak parowanie markerów niskiej liczebności z jasnymi znacznikami fluoroforowymi, ocena wpływu promieniowania fotologicznego na znakowanie przeciwciał oraz amplifikacja przeciwciałami drugorzędowymi w kanałach o wysokiej fluorescencji endogennej. Średnio przetworzyliśmy pięć preparatów odpowiadających jednemu przekrojowi tkanki, każdy o długości od 37 do 114mm2. Na koniec pokazujemy, jak pozyskiwać obrazy całych slajdów za pomocą instrumentu szerokokątnego. Podsumowując, protokół ten opisuje zastosowanie IBEX do archiwizowanych próbek klinicznych, a dodatkowo oferuje wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów często spotykanych przy obrazowaniu próbek o wysokiej autofluorescencji.

<table><tbody><tr><td>0,3% Tryton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T8787 TGL</td><td>Rozwiązanie do blokowania bufora</td></tr><tr><td>1% powierzchni ciała</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503 (wersja angielska)</td><td>Rozwiązanie do blokowania bufora</td></tr><tr><td>1% ludzki blok BD Fc</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>564220</td><td>Blok Fc wymagany do blokowania bufora</td></tr><tr><td>Lampa LED o mocy 150 W</td><td>Amazonka</td><td>B07VH3CVSF</td><td>Źródło światła LED do fotonaświetlania tkanek</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10010-023</td><td>Rozwiązanie do blokowania etapów buforowania i mycia</td></tr><tr><td>Pojemnik do przechowywania o pojemności 20 galonów</td><td>Amazonka</td><td>B001B1C4G0</td><td>Pojemnik do procesu fotonaświetlania</td></tr><tr><td>Lampa LED naświetlająca RGBW o mocy 40 W&nbsp;</td><td>Amazonka</td><td>B08QFPJSMD</td><td>Źródło światła RGB do fotonapromieniania tkanek</td></tr><tr><td>Ag85B (Biblioteka Ag85B)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Zestaw blokujący awidynę/biotynę</td><td>Księga Abcam</td><td>ab64212 powiedział:</td><td>Roztwór blokujący awidynę i biotynę</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>554714</td><td>Rozwiązanie do utrwalania</td></tr><tr><td>Roztwór do usuwania wosku BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Roztwór do deparafiniowania</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu (ER1)</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2)</td></tr><tr><td>System detekcji badań BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Zautomatyzowany odczynnik do barwienia badań</td></tr><tr><td>Barwnik badawczy BOND RX</td><td>Leica Biosystems</td><td>NIE</td><td>Zautomatyzowana platforma do barwienia badawczego</td></tr><tr><td>Roztwór do mycia BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Bufor do płukania</td></tr><tr><td>Płyta CD15</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>347420/AB_400298</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>CD45 Fikoerytryna (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologie</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat. A32814/AB_2762838</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat. A32794/AB_2762834</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>System barwienia EasyDip</td><td>Zaopatrzenie dla nowicjuszy</td><td>5300KIT (ZESTAW 5300)</td><td>System barwienia szkiełek</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>00-4958-02</td><td>Nośniki montażowe</td></tr><tr><td>Hoechst powiedział:</td><td>Biot</td><td>40046</td><td>Barwienie jądrowe do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Imaris Konwerter Plików x64 10.2.0</td><td>Imaris Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td>Darmowy konwerter plików</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImarisViewer x64 10.2.0</td><td>Imaris Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td>Darmowe oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Pióro ImmEdge</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-4000</td><td>Hydrofobowy długopis barierowy</td></tr><tr><td>Bowodorek litu (1 gram)</td><td>Chemikalia STREM</td><td>93-0397</td><td>Substancja chemiczna do inaktywacji barwnika, kup małe porcje tej substancji chemicznej (1 gram)</td></tr><tr><td>Lumican Biotyna</td><td>R& Systemy D</td><td>BAF2846</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Okulary z mikro osłonką</td><td>Firma VWR</td><td>48393-241</td><td>Szklane osłony prowadnic</td></tr><tr><td>Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>System mikrofalowy PELCO BioWave Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Nienagrzewająca się naukowa kuchenka mikrofalowa</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>W pełni zautomatyzowana kontrola temperatury dla naukowej kuchenki mikrofalowej</td></tr><tr><td>SimpleITK (Prosty ITK)</td><td>Oprogramowanie typu open source</td><td></td><td>Oprogramowanie do rejestracji i przetwarzania kanałów</td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>S11227 powiedział:</td><td>Odczynnik do znakowania do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.</td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny</td><td>Mikrosystemy Leica</td><td>NIE</td><td>Imager Leica Microsystems THUNDER ze źródłem światła LED8 i oprogramowaniem LAS X (3.7.1.21655). Do obrazowania fluorescencyjnego użyto niestandardowego filtra czteropasmowego z zewnętrznym kołem filtrów (PN: 11536075) z dwoma dodatkowymi filtrami jednopasmowymi (PN: 8118215) do obrazowania siedmiu kanałów barwnika na przejście. Linie wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego filtra to (1) sześcian czteropasmowy: dichroiczny w 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, bez filtrów wzbudzenia lub emisji; (2) Zewnętrzne koło filtrowe pozycja 1: 434/32, pozycja 2: 520/40, pozycja 3: 585/20, pozycja 4: 720/60, pozycja 5: przepustowe; (3) jednopasmowy 1&mdash; 585/22 wzbudzenie, 594 dichroiczne, 625/30 emisja; (4) jednopasmowy 2&mdash; 635/20 wzbudzenie, 647 dichroiczne, 667/30 emisja.</td></tr><tr><td>Zeiss Środek do czyszczenia soczewek optycznych</td><td>Amazonka</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Środek do czyszczenia soczewek obiektywów mikroskopowych</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>przeciwciała</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B (Biblioteka Ag85B)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab43019 powiedział:</td><td>Poliklonalna IgG królika, cykl 1</td></tr><tr><td>Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, cykl 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB8165G</td><td>Poliklonalna kozia IgG, cykl 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>Legenda biologiczna</td><td>372906</td><td>C8/144B, cykl 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologie</td><td>1064135</td><td>KP1, cykl 1</td></tr><tr><td>Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>A32814 powiedział:</td><td>Osioł poliklonalny, cykl 1</td></tr><tr><td>Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>A32787</td><td>Osioł poliklonalny, cykl 1</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Numer telefonu A32794</td><td>Osioł poliklonalny, cykl 1</td></tr><tr><td>Hoechst powiedział:</td><td>Biot</td><td>40046</td><td>Etykieta jądrowa, cykl 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta CD15</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>347420</td><td>MMA, cykl 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>50-0202-82</td><td>L26, cykl 2</td></tr><tr><td>CD45 Fikoerytryna (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, cykl 2</td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020</td><td>Osioł poliklonalny, cykl 2</td></tr><tr><td>Lumican Biotyna</td><td>R& Systemy D</td><td>BAF2846</td><td>Poliklonalna kozła IgG, cykl 2</td></tr><tr><td>Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, cykl 2</td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>S11227 powiedział:</td><td>Nie dotyczy, cykl 2</td></tr><tr><td>Hoechst powiedział:</td><td>Biot</td><td>40046</td><td>Cykl 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (cykl 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T8787 TGL</td><td>0,3% objętościowo</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503 (wersja angielska)</td><td>1% objętościowo</td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>564220</td><td>1% objętościowo</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10010-023</td><td>97,7% objętościowo</td></tr><tr><td>Primary Antibody Staining Solution #1 (Cykl 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (cykl 1)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Hoechst powiedział:</td><td>Biot</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>Legenda biologiczna</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Primary Antibody Staining Solution #2 (Cykl 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (cykl 1)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Płyta CD4&nbsp; AF488 powiedział:</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B (Biblioteka Ag85B)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td><silny>wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #1 (cykl 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (cykl 1)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Osioł Anti-Goat AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat. A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Osioł anty-Królik AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat. A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszom AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Nr kat. A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Primary Antibody Staining Solution #3 (Cykl 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (cykl 1)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Płyta CD68 iF594</td><td>Caprico Biotechnologie</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T8787 TGL</td><td>0,3% objętościowo</td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>564220</td><td>1% objętościowo</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10010-023</td><td>98,7% objętościowo</td></tr><tr><td>Primary Antibody Staining Solution #4 (Cykl 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Płyta CD15</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Lumican Biotyna</td><td>R& Systemy D</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-cytokeratyna AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td><silny>Wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #2 (cykl 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz IgM AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strepowidyna AF594</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>S11227 powiedział:</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

Częstość występowania chorób płuc spowodowanych przez prątki niegruźlicze (NTM) wzrasta na całym świecie. Chociaż choroba płuc wywołana NTM często objawia się rozstrzeniem oskrzeli, guzkami płuc i chorobą jamy ustnej, odpowiedź gospodarza związana z tymi odrębnymi wzorcami uszkodzeń płuc nie została dobrze scharakteryzowana in situ. Staraliśmy się ocenić mechanizmy patologii wywołanej przez NTM, przeprowadzając głęboką analizę fenotypową populacji komórek odpornościowych w tkance płucnej od osób z chorobą NTM w porównaniu ze złotym standardem zapalenia ziarniniakowego, gruźliczej (TB) choroby płuc.
Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE) bloki płuc od pacjentów z rozsianym NTM, płucnym NTM lub gruźlicą płuc podzielono na sekcje i wybarwiono zgodnie ze zmodyfikowaną wersją metody obrazowania Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). Optymalizacja metody IBEX była najpierw konieczna, aby rozwiązać problem znaczącej endogennej fluorescencji skrawków płuc ze względu na dużą gęstość kolagenu, elastyny i erytrocytów natywnych dla tkanki płucnej, która jest pogarszana przez zachowanie FFPE i wiek bloków FFPE. W tym protokole szczegółowo opisujemy protokół fotonapromieniania i zmodyfikowaną metodę odzyskiwania antygenu, która zmniejsza autofluorescencję klinicznie zarchiwizowanych próbek.
Ponadto zapewniamy wskazówki dotyczące projektowania paneli przeciwciał, w tym typowych wyzwań, takich jak reaktywność krzyżowa, utrata epitopów po napromieniowaniu fotoelektrycznym, nakładanie się widm między sąsiednimi fluoroforami i niski stosunek sygnału do szumu dla niektórych celów. Aby ułatwić wydajne obrazowanie całych skrawków tkanki płucnej, preparaty zobrazowano za pomocą mikroskopu szerokokątnego i poddano obróbce końcowej za pomocą oprogramowania typu open source w celu poprawy jakości obrazu. Łącznie ten przepływ pracy odpowiada na krytyczną potrzebę, dokumentując sposób uzyskiwania wysoce multipleksowanych obrazów całych slajdów o wysokiej rozdzielczości z trudnych próbek przy użyciu powszechnie dostępnego oprzyrządowania i odczynników. Poza ilościowym obrazowaniem próbek klinicznych, techniki te można stosować do różnych typów próbek w celu wyeliminowania zarówno endogennych, jak i egzogennych źródeł fluorescencji.

Projektowanie multipleksowego panelu obrazowania opartego na przeciwciałach wymaga znacznej ilości czasu, wysiłku i zasobów12Wyzwania te są szczególnie widoczne podczas projektowania panelu dla zarchiwizowanych próbek FFPE z tkanek wykazujących silną autofluorescencję, opisanych w niniejszym opracowaniu (Rycina 1). Aby przezwyciężyć te trudności, w pierwszej kolejności zidentyfikowano najjaśniejsze fluorofory kompatybilne z naszym protokołem inaktywacji barwnika (<str...

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

[Narrator] Korzystając z proteomiki przestrzennej, nazwanej Metodą Roku 2024 Nature Methods, można zmapować dokładne lokalizacje komórek odpornościowych wraz z interakcjami komórka-komórka w tkankach. Ujawnia to wzorce przestrzenne powiązane z wynikami klinicznymi. Budowanie złożonych paneli przeciwciał i obrazowanie tkanek o wysokiej fluorescencji endogennej stanowi znaczne wyzwanie czasowe, finansowe i specjalistyczne dla IBEX i innych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z IBEX, zidentyfikowano cechy specyficzne dla nowotworu u pacjentów z chłoniakiem grudkowym wysokiego ryzyka oraz we współpracy z kolegami z Human Cell Atlas. Stworzono kompleksową mapę przestrzenną grasicy ludzkiej. Niewiele wiadomo na temat składu komórek odpornościowych, interakcji przestrzennych i różnic w produkcji cytokin w różnych prątkowatych patologiach płuc. Niniejszy protokół wypełnia tę lukę. Protokół ten oferuje tanią, elastyczną metodę naświetlania w celu znacznego zmniejszenia autofluorescencji tkanek o szerokim spektrum, szczególnie w trudnych próbkach FFPE, przy jednoczesnym zachowaniu sygnału przeciwciał do analizy przestrzennej. Aby rozpocząć, zanurz szkiełka z tkanką w PBS po zakończeniu pobierania antygenu. Wyjmij jedno szkiełko z PBS i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie wysuszyć nadmiar buforu bez dotykania chusteczki. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obramowanie wokół sekcji tkanki na szkiełku. Po powtórzeniu procesu dla pozostałych szkiełek pozostaw bariery hydrofobowe do wyschnięcia na 10 minut. Następnie, za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, odsuń PBS z sekcji tkanki, nie dotykając jej bezpośrednio. Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego na szkiełko i zamknij komorę wilgotnościową. Umieść komorę w nienagrzewającej się naukowej kuchence mikrofalowej z mechanizmem regulacji temperatury i uruchom wcześniej ustalony program pięć cykli. Podczas inkubacji blokującej przygotować pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała 1 z haczykami i buforem blokującym zawierającym blok Fc. Połącz przeciwciała i delikatnie wymieszaj koktajl. Po zakończeniu cyklu mikrofalowego wyjmij i otwórz komorę szkiełka i odsuń bufor blokujący od szkiełka bez dotykania tkanki. Następnie dodać 200 mikrolitrów pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała 1 do szkiełka. Umieść komorę z powrotem w kuchence mikrofalowej i ponownie wykonaj program przeciwciał pierwotnych przez około 30 minut. Po zakończeniu znakowania przeciwciał pierwotnych trzymaj szkiełko pionowo. Aby umyć szkiełko, należy nanieść pipetą 1 000 mikrolitrów PBS na chusteczkę, pozwalając jej spłynąć. Odchiąć nadmiar PBS i przymocować szkiełko 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej. Po utrwaleniu dokładnie umyj szkiełko 1,000 mikrolitrami PBS trzy do pięciu razy i pozostaw warstwę PBS na tkance do etapu fotonaświetlania. Aby przygotować pudełko do naświetlania, zbierz 150-watową lampę LED, 40-watową lampę LED RGBW, duży plastikowy pojemnik o pojemności 75,71 litra lub większej, świeży PBS i szalkę Petriego. Teraz napełnij szalkę Petriego 1x PBS, aby całkowicie zanurzyć szkiełko. Procedurę naświetlania należy przeprowadzić w chłodni, aby zminimalizować ciepło z lamp. Następnie umieść szkiełko na szalce Petriego, upewniając się, że jest całkowicie zanurzone w PBS. Następnie umieść 40-watową lampę bezpośrednio nad szalką Petriego ze źródłem światła skierowanym w dół w kierunku szkiełka i ustaw lampę w trybie światła czerwonego. Na koniec włącz zarówno 150-watowe, jak i 40-watowe lampy i przykryj cały zestaw plastikową pokrywką pojemnika. Po dwóch godzinach przełącz lampę na zielone światło i inkubuj przez 16 godzin. Zidentyfikowano najjaśniejsze fluorofory zgodne z protokołem inaktywacji barwnika i sparowano je z markerami o niskiej ekspresji, aby poprawić wykrywanie sygnału. Autofluorescencja uległa znacznemu zmniejszeniu po naświetlaniu foto i przy dłuższych długościach fal obrazowania. Bezpośrednio sprzężone przeciwciała skierowane przeciwko markerom strukturalnym o wysokiej ekspresji, aktynie alfa-mięśni gładkich i cytokeratynie, zastąpione w kanale bliskiej podczerwieni na głębokości 750 nanometrów. Sygnał tła został odjęty obliczeniowo przy użyciu niebarwionego obrazu referencyjnego i arytmetyki SimpleITK, a prawdziwe sygnały zostały wzmocnione poprzez progowanie. Obrazowanie całych szkiełek wybarwionych IBEX ujawniło ziarniniaki z martwiczymi rdzeniami i CD15-dodatnimi neutrofilami. Mycobacterium tuberculosis lub prątki niegruźlicze wykryto w pobliżu rdzenia martwiczego ziarniniaka za pomocą przeciwciała antygenowego 85B. Tkanka limfatyczna związana z ziarniniakiem zawierała limfocyty B CD20-dodatnie, limfocyty T CD4-dodatnie, kilka limfocytów T CD8-dodatnich i znakowanie CD45 wszystkich komórek odpornościowych w płucach. Obrazowanie IBEX umożliwiło również wizualizację cech anatomicznych płuc, w tym komórek nabłonka oskrzeli, mięśni gładkich tętnic i makrofagów CD68-dodatnich.

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Autofluorescencja tła próbek biologicznych często komplikuje techniki obrazowania oparte na fluorescencji, szczególnie w starszych ludzkich tkankach postmitotycznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób autofluorescencja z tych próbek może być skutecznie usunięta za pomocą dostępnego na rynku źródła światła z diodą elektroluminescencyjną do fotowybielania próbki przed barwieniem immunologicznym.

Prosta eliminacja fluorescencji tła w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej formaliną do mikroskopii immunofluorescencyjnej

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Tutaj opisujemy zastosowanie metody Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX), wykorzystującą komercyjnie dostępne, zautomatyzowane barwienia tkanek oraz rozważania optymalizacyjne dla stosowania odczynników opartych na wzmacnianiu sygnału tyramidowego.

Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Poznaj zoptymalizowany protokół fotopromieniowania redukujący autofluorescencję tkanek przy zachowaniu sygnałów przeciwciał. Ta metoda umożliwia wielokanałowe obrazowanie próbek klinicznych FFPE w celu analizy przestrzennej komórek immunologicznych.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Przeglądaj więcej filmów