Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

[Narrator] Korzystając z proteomiki przestrzennej, nazwanej Metodą Roku 2024 Nature Methods, można zmapować dokładne lokalizacje komórek odpornościowych wraz z interakcjami komórka-komórka w tkankach. Ujawnia to wzorce przestrzenne powiązane z wynikami klinicznymi. Budowanie złożonych paneli przeciwciał i obrazowanie tkanek o wysokiej fluorescencji endogennej stanowi znaczne wyzwanie czasowe, finansowe i specjalistyczne dla IBEX i innych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z IBEX, zidentyfikowano cechy specyficzne dla nowotworu u pacjentów z chłoniakiem grudkowym wysokiego ryzyka oraz we współpracy z kolegami z Human Cell Atlas. Stworzono kompleksową mapę przestrzenną grasicy ludzkiej. Niewiele wiadomo na temat składu komórek odpornościowych, interakcji przestrzennych i różnic w produkcji cytokin w różnych prątkowatych patologiach płuc. Niniejszy protokół wypełnia tę lukę. Protokół ten oferuje tanią, elastyczną metodę naświetlania w celu znacznego zmniejszenia autofluorescencji tkanek o szerokim spektrum, szczególnie w trudnych próbkach FFPE, przy jednoczesnym zachowaniu sygnału przeciwciał do analizy przestrzennej. Aby rozpocząć, zanurz szkiełka z tkanką w PBS po zakończeniu pobierania antygenu. Wyjmij jedno szkiełko z PBS i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie wysuszyć nadmiar buforu bez dotykania chusteczki. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obramowanie wokół sekcji tkanki na szkiełku. Po powtórzeniu procesu dla pozostałych szkiełek pozostaw bariery hydrofobowe do wyschnięcia na 10 minut. Następnie, za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, odsuń PBS z sekcji tkanki, nie dotykając jej bezpośrednio. Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego na szkiełko i zamknij komorę wilgotnościową. Umieść komorę w nienagrzewającej się naukowej kuchence mikrofalowej z mechanizmem regulacji temperatury i uruchom wcześniej ustalony program pięć cykli. Podczas inkubacji blokującej przygotować pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała 1 z haczykami i buforem blokującym zawierającym blok Fc. Połącz przeciwciała i delikatnie wymieszaj koktajl. Po zakończeniu cyklu mikrofalowego wyjmij i otwórz komorę szkiełka i odsuń bufor blokujący od szkiełka bez dotykania tkanki. Następnie dodać 200 mikrolitrów pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała 1 do szkiełka. Umieść komorę z powrotem w kuchence mikrofalowej i ponownie wykonaj program przeciwciał pierwotnych przez około 30 minut. Po zakończeniu znakowania przeciwciał pierwotnych trzymaj szkiełko pionowo. Aby umyć szkiełko, należy nanieść pipetą 1 000 mikrolitrów PBS na chusteczkę, pozwalając jej spłynąć. Odchiąć nadmiar PBS i przymocować szkiełko 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej. Po utrwaleniu dokładnie umyj szkiełko 1,000 mikrolitrami PBS trzy do pięciu razy i pozostaw warstwę PBS na tkance do etapu fotonaświetlania. Aby przygotować pudełko do naświetlania, zbierz 150-watową lampę LED, 40-watową lampę LED RGBW, duży plastikowy pojemnik o pojemności 75,71 litra lub większej, świeży PBS i szalkę Petriego. Teraz napełnij szalkę Petriego 1x PBS, aby całkowicie zanurzyć szkiełko. Procedurę naświetlania należy przeprowadzić w chłodni, aby zminimalizować ciepło z lamp. Następnie umieść szkiełko na szalce Petriego, upewniając się, że jest całkowicie zanurzone w PBS. Następnie umieść 40-watową lampę bezpośrednio nad szalką Petriego ze źródłem światła skierowanym w dół w kierunku szkiełka i ustaw lampę w trybie światła czerwonego. Na koniec włącz zarówno 150-watowe, jak i 40-watowe lampy i przykryj cały zestaw plastikową pokrywką pojemnika. Po dwóch godzinach przełącz lampę na zielone światło i inkubuj przez 16 godzin. Zidentyfikowano najjaśniejsze fluorofory zgodne z protokołem inaktywacji barwnika i sparowano je z markerami o niskiej ekspresji, aby poprawić wykrywanie sygnału. Autofluorescencja uległa znacznemu zmniejszeniu po naświetlaniu foto i przy dłuższych długościach fal obrazowania. Bezpośrednio sprzężone przeciwciała skierowane przeciwko markerom strukturalnym o wysokiej ekspresji, aktynie alfa-mięśni gładkich i cytokeratynie, zastąpione w kanale bliskiej podczerwieni na głębokości 750 nanometrów. Sygnał tła został odjęty obliczeniowo przy użyciu niebarwionego obrazu referencyjnego i arytmetyki SimpleITK, a prawdziwe sygnały zostały wzmocnione poprzez progowanie. Obrazowanie całych szkiełek wybarwionych IBEX ujawniło ziarniniaki z martwiczymi rdzeniami i CD15-dodatnimi neutrofilami. Mycobacterium tuberculosis lub prątki niegruźlicze wykryto w pobliżu rdzenia martwiczego ziarniniaka za pomocą przeciwciała antygenowego 85B. Tkanka limfatyczna związana z ziarniniakiem zawierała limfocyty B CD20-dodatnie, limfocyty T CD4-dodatnie, kilka limfocytów T CD8-dodatnich i znakowanie CD45 wszystkich komórek odpornościowych w płucach. Obrazowanie IBEX umożliwiło również wizualizację cech anatomicznych płuc, w tym komórek nabłonka oskrzeli, mięśni gładkich tętnic i makrofagów CD68-dodatnich.