Name: Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj wizualizację węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry. Metody te pozwalają na szczegółowe badanie morfogenezy tych kluczowych struktur organizujących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

H.B. jest wspierany przez fundusze start-upowe z Wydziału Medycznego i SFB829 Uniwersytetu w Kolonii. C.X. jest wspierany przez grant DFG BA 5810/1-1. Serdecznie dziękujemy Zakładom Obrazowania w centrum badawczym CECAD oraz Memorial Sloan Kettering Cancer Center (Nowy Jork, USA). Dziękujemy Joaquínowi Grego-Bessa (Hiszpańskiemu Narodowemu Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych, Madryt, Hiszpania) za jego spostrzeżenia na temat montowania embrionów do WMIF.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze w Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV-NRW).
1. Skaningowa mikroskopia elektronowa węzła embrionalnego myszy
<ol>
	<li>Poświęć ciężarną samicę myszy w ~ E7,5 (stadium 2-4 somitów) przez zwichnięcie szyjki macicy. Szczegółowe wyjaśnienie wraz ze schematami kroków 1.1 - 1.7 jest dostępne w podręcznikach laboratoryjnych zarodków myszy13.</li>
	<li>Otwórz brzuch przez skórę i krezki i usuń macicę za pomocą nożyczek i cienkich kleszczy.</li>
	<li>Krótko opłucz macicę w wodzie destylowanej i umieść ją na małej, czystej szalce Petriego (6 cm) zawierającej 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą cienkich kleszczy usuń mięśnie macicy, aby uwolnić poszczególne deciduae lub miejsca implantacji.</li>
	<li>Przytrzymaj każdą deciduę jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary, aby wykonać podłużne nacięcie na całej grubości między czerwoną częścią (przyszłe łożysko) a białą częścią (gdzie znajduje się zarodek). Wykonaj powierzchowne perforacje pionowo wzdłuż białej części decidua przylegającej do nacięcia. Rozsuń decidua poziomo na dwie połówki i ostrożnie zgarnij zarodek w białej części decidua.</li>
	<li>Przenieść zarodek na nową szalkę Petriego (35 mm) ze świeżym, sterylnie przefiltrowanym PBS. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich zarodków.</li>
	<li>Usuń błonę Reicherta, stosunkowo nieprzezroczystą błonę otaczającą zarodek, z każdego zarodka, drażniąc ją jak skarpetę, zaczynając od stożka ektołożyskowego (czerwonawe miejsce implantacji). Do genotypowania należy na tym etapie pobrać mały kawałek (~ 0,1 mm2) woreczka żółtkowego.</li>
	<li>Pod kapturem chemicznym i przy użyciu odpowiednich rękawiczek ochronnych przenieś zarodki do utrwalacza klasy EM składającego się z 2,5% aldehydu glutarowego w sterylnie przefiltrowanym PBS w probówce do mikrowirówki (1,5 ml) w temperaturze pokojowej. Utrwalić zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć utrwalacz aldehydu glutarowego z probówki, nie dotykając zarodków, i wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady. Umyj zarodki trzy razy w sterylnie przefiltrowanym PBS, każdy przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwodnić zarodki w serii etanolowej przez 5 minut każdy: 50%, 70%, 85% i trzy razy w 100% lub absolutnym etanolu. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C w etanolu lub przejść bezpośrednio do następnego etapu.</li>
	<li>Przenieś zarodki w etanolu do koszy w celu suszenia w punkcie krytycznym (CPD) w suszarce do punktów krytycznych. Napełnij komorę etanolem, aby całkowicie przykryć kosze.</li>
	<li>Wymienić etanol, ostrożnie przepłukując ciekłym CO2 dziesięć razy w temperaturze 10 °C. Po ostatnim etapie odcedzić ciekły CO2 do momentu, aż komora będzie wypełniona do połowy. Podgrzewać do 40 °C, aż ciśnienie osiągnie 80 barów (punkt krytyczny), a ciekły CO2 zmieni się w gaz. Odczekaj 10 minut, a następnie powoli zdmuchnij gaz przez około 45 minut.</li>
	<li>Jako łatwiejszą alternatywę dla CPD do suszenia, dodaj heksametyldisilazan (HMDS) w stosunku 1:1 do zarodków w etanolu przez 30 minut. Następnie przenieś zarodki do czystego gogli HMDS na 30 minut. Wyjmij zarodki z płynu za pomocą pipety i pozostaw je do wyschnięcia na 30 minut. 
	UWAGA: Obie metody suszenia sprawdziły się równie dobrze w naszych dłoniach.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej szczoteczki zamontuj wysuszone zarodki stroną brzuszną (węzłem) do góry na kikutu SEM z dwustronną taśmą.</li>
	<li>Włóż kikuty z zarodkami do maszyny do napylania w celu powlekania cząstek złota, która jest preferowana do ładowania długich, cienkich rzęsek. Nałożyć warstwę 120-150 A; Czas zależy od prądu, który będzie się różnił w zależności od próbki.</li>
	<li>Umieść pokryte kikuty z zarodkami w mikroskopie SEM, zastosuj próżnię i obserwuj komórki węzła embrionalnego i płytki struny grzbietowej z rzęskami w powiększeniach od 1000X do 15 000X.</li>
</ol>
2. Immunofluorescencja całego węzła myszy i płytki struny grzbietowej
<ol>
	<li>Używając lodowatego PBS z 0,05% Tween 20 (PBSTw), wykonaj kroki 1.1-1.7 powyżej, aby usunąć zarodki w E7.75 i umieść je w PBSTw na szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie.</li>
	<li>Pod kapturem chemicznym i przy założeniu odpowiedniej ochrony (rękawice) przenieś zarodki do utrwalającego roztworu 4% paraformaldehydu w PBS w probówce do mikrowirówki. Utrwalić zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij utrwalacz paraformaldehydu z tubki, nie dotykając zarodków i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady. Umyj zarodki trzykrotnie w PBS zawierającym 0,2% Triton X-100 (PBSTr) przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej. Wykonaj wszystkie etapy mycia i następnej inkubacji na wytrząsarce do nutacji.</li>
	<li>Usunąć ostatnie płukanie i dodać roztwór blokujący zawierający PBSTr z 10% surowicą inaktywowaną termicznie (z gatunku gospodarza przeciwciała drugorzędowego). Blokować od 2 godzin do nocy (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć blokadę i dodać ~ 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym, na przykład przeciwciała anty-T w rozcieńczeniu 1:500. Inkubować przez noc (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i zachowaj je do późniejszego wykorzystania, dodając azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (1 μl 20% zapasu na 1 ml roztworu przeciwciała). Przeciwciało może być ponownie użyte ~ 10 razy. Przepłukać zarodki dwukrotnie PBSTr, a następnie przepłukać je trzykrotnie przez 30 minut każdy na nutatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastąp płukanie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją, przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza, rozcieńczonym w stosunku ~ 1:1000 przez noc (lub dłużej) na nutatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało wtórne i przepłukać dwukrotnie PBSTr, a następnie przemyć trzy razy przez 30 minut PBSTr.</li>
	<li>Zastąp ostatnie pranie PBSTr zawierającym falloidynę sprzężoną z fluorescencją w proporcji 1:500, w celu wybarwienia F-aktyny, i 1:1000 DAPI, w celu wybarwienia jąder, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie w PBSTr i raz umyć PBSTr przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp PBSTr PBS i pozostaw zarodki na lodzie. Przygotować czyste, dodatnio naładowane szkiełka podstawowe (60 x 24 mm) i szkiełka nakrywkowe (24 x 24 mm) oraz wodne podłoża mocujące na bazie glicerolu, na przykład 90% glicerolu w 1xPBS i odczynnika zapobiegającego blaknięciu, w celu zamontowania zarodków.</li>
	<li>Umieść dwa kawałki przezroczystej taśmy w odległości ~ 15 mm od siebie na przezroczystej części szkiełka. Stworzy to wystarczającą ilość przestrzeni 3D (w wymiarze Z), która pozwoli na spłaszczenie zarodków, ale nie ich całkowite zgniecenie.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przesunąć zarodki za pomocą przeciętej pipety P200 (aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na przeniesienie zarodka i nie uszkodzić go) do szkiełka.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wykonaj dwa pełne nacięcia po bocznych stronach woreczka żółtkowego, aby rozwinąć zarodek. Umieść zarodek stroną brzuszną (węzeł i płytka struny grzbietowej) do góry (grzbietem cewy nerwowej w dół na szkiełku).</li>
	<li>Dodać 50 μl pożywki montażowej na zarodek. Umieść 4-5 zarodków na szkiełku. Dodaj odrobinę podłoża montażowego po stronie szkiełka nakrywkowego, która najpierw dotknie szkiełka nakrywkowego (górna lub dolna strona), a następnie umieść go okrakiem na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść na zarodki za pomocą cienkich kleszczyków lub wygiętej cienkiej igły, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wyczyść nadmiar mediów montażowych za pomocą chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie przesunąć szkiełka nakrywkowego w tym procesie.</li>
	<li>Używając dużej ilości lakieru do paznokci, uszczelnij boki szkiełka nakrywkowego, nie przesuwając go.</li>
	<li>Obserwuj pod skaningowym mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li>
<li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+node+and+notochord%3A+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li>
<li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+morphogenesis+in+mice%3A+Current+understanding+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li>
<li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li>
<li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morpholog%22%5BJournal%5D)">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li>
<li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li>
<li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li>
<li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRIP1%2C+a+core+component+of+STRIPAK+complexes%2C+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li>
<li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li>
<li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li>
<li>McMullan, D. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/sca.4950170309">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li>
<li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization%2C+cell+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Manipulating-Mouse-Embryo-Laboratory-Manual/dp/1936113015">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+a+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, Pt 1 84-87 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej pracy pokazujemy, jak wykonać SEM i WMIF w celu wizualizacji węzła embrionalnego myszy i płytki struny grzbietowej. Niewielki rozmiar gastrulatujących zarodków myszy ~ E7,5 i obecność tych struktur na powierzchni sprawiają, że idealnie nadają się do badania przy użyciu technik opisanych 2,7,8. Dostępność dobrych przeciwciał, takich jak markery T i rzęsek, dostarcza doskonałych informacji 3D przy użyciu WMIF na temat struktury, organizacji i tworzenia tych niezbędnych organizatorów embrionalnych8.
Ponieważ rozwój embrionalny myszy przebiega w bardzo szybkim tempie, a węzeł i płytka struny grzbietowej są tylko przejściowo obecne na powierzchni zarodka, czas ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów 2,3. Na przykład 2-4 zarodki somitowe są dobre do analizy SEM dojrzałego dołu węzłowego z długimi rzęskami. W znacznie wcześniejszych lub późniejszych zarodkach (na przykład 12 godzin przed lub po) węzeł może nie być obecny na powierzchni. WMIF jest pod tym względem nieco bardziej elastyczny, ale same struktury są również przejściowe podczas rozwoju, a czas w tym przypadku zależy od zainteresowań badaczy.
Czystość odczynników jest również niezbędna dla powodzenia tych technik, zwłaszcza w badaniu ultrastruktury za pomocą SEM. Drobne zanieczyszczenia, które przyklejają się do zarodków, zwykle skutkują ogromnymi artefaktami.
Przetestowaliśmy dwie różne metody utrwalania zarodków pod kątem SEM, jedną przy użyciu połowy utrwalacza Karnovsky'ego (2,5% aldehydu glutarowego, 2% paraformaldehydu i 0,1 M buforu kakodylowego) i prostszej 2,5% aldehydu glutarowego w 1x PBS. Wolimy używać aldehydu glutarowego i utrwalacza PBS, jak opisano w kroku 1, jednak my i inni z powodzeniem zastosowaliśmy również utrwalacz połowy Karnovsky'ego do SEM.
Porównaliśmy również dwie metody suszenia zarodków pod kątem SEM i nie znaleźliśmy różnicy w jakości próbki przy użyciu suszarki w punkcie krytycznym lub HMDS, jak opisano w kroku 1 i opisano w innym miejscu14.
W Kroku 2 przetestowaliśmy osadzanie zarodków po końcowych etapach mycia w 1% niskotopliwej agarozie zamontowanej na naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, a następnie posypanie jej ~ 10 μL podłoża montażowego. Ta metoda osadzania działa i zachowuje oryginalną strukturę 3D zarodka i powiązanych struktur; Jednak do zobrazowania próbki wymagany jest mikroskop wielofotonowy, ponieważ zwykły mikroskop konfokalny nie może sięgać tak głęboko w nienaruszone zarodki (~ 1 mm).
Uważamy, że zastosowanie tych dwóch technik daje uzupełniające się informacje na temat struktury węzła i płytki struny grzbietowej podczas normalnego rozwoju oraz u mutantów, które wykazują defekty w tworzeniu tych struktur.

Gastrulacja i towarzyszące jej ruchy morfogenetyczne są kluczowe dla kształtowania zarodka myszy1. Zmiany w kształcie i organizacji komórek podczas morfogenezy dyktują informacje o położeniu w celu regulowania losu komórki, a także pozwalają powstałym szlakom sygnałowym precyzyjnie wykonywać swoje funkcje w celu dywersyfikacji nowo powstałych listków zarodkowych1. Tworzenie przejściowych struktur organizacyjnych i centrów sygnalizacyjnych, takich jak węzeł i struna grzbietowa, jest niezbędne do realizacji programu rozwojowego2. Biolodzy rozwojowi wykorzystali różne techniki do badania morfogenezy tych struktur, z których najbardziej godną uwagi jest wykorzystanie reporterów komórkowych i obrazowania na żywo ex vivo w celu śledzenia dynamiki zachowania komórkowego i subkomórkowego2,3,4. W tym raporcie skupiamy się na opisaniu szczegółów naszych zoptymalizowanych protokołów dla dwóch z tych technik: skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i immunofluorescencji całej góry (WMIF), które były i nadal odgrywają zasadniczą rolę w badaniu morfogenezy węzła i płytki struny grzbietowej, prekursora struny grzbietowej.
Węzeł embrionalny myszy to miseczka komórek w kształcie łzy, która znajduje się na brzusznej powierzchni zarodka myszy wokół wczesnych do późnych etapów fałdowania głowy podczas gastrulacji i morfogenezy (dzień embrionalny, E7.5-E8)2,5,6,7. Płytka struny grzbietowej morfologicznie emanuje z przodu z węzła3. Każda komórka w węźle i płytce struny grzbietowej charakteryzuje się pojedynczą rzęską, która wystaje na zewnątrz, która jest dłuższa w komórkach węzłowych, ale której długość zmienia się w zależności od etapu rozwoju2. Wykazano, że rotacja rzęsek w dole węzła jest ważna dla sygnalizacji, która określa asymetrię lewo-prawo4. Płytka struny grzbietowej jest prekursorem struny grzbietowej, centrum sygnalizacyjnego, które jest ważne dla tworzenia wzorów sąsiednich somitów i leżącej nad nią cewy neuronowej3.
Ze względu na atrybuty lokalizacji (powierzchnia), kształt (kubek) i posiadanie odrębnych zewnętrznych struktur komórkowych (rzęsek), SEM jest tradycyjnie używany do wizualizacji węzła i płytki struny grzbietowej oraz badania ich powstawania i struktury2,7. SEM jest również używany do badania zmian w strukturze samego węzła lub rzęsek na jego komórkach w mutacjach, które wpływają na gastrulację, morfogenezę, a także tworzenie rzęsek8,9,10. SEM to technika, która wykorzystuje skupioną wiązkę elektronów do badania topologicznej ultrastruktury zewnętrznej powierzchni materiałów takich jak próbki biologiczne11. Próbka jest zwykle utrwalana, suszona, a następnie napylana metalami w celu obserwacji pod skaningowym mikroskopem elektronowym, jak opisaliśmy w kroku 1.
WMIF to technika barwienia służąca do wizualizacji produktów genów, takich jak białka, w trzech wymiarach (3D). WMIF tkanek, narządów, a nawet całych organizmów dostarcza informacji przestrzennych o rozkładzie sygnału i kształcie powstałej struktury w 3D. Technika opiera się na utrwaleniu próbki, a następnie barwieniu jej fluorescencyjnymi koniugatami. Zarodki myszy ~ E7,5 są małe i przezroczyste, dlatego idealnie nadają się do protokołów WMIF do wizualizacji węzła i płytki struny grzbietowej. Na przykład czynnik transkrypcyjny Barchyury (T) ulega ekspresji w jądrach węzła i płytki struny grzbietowej, a w mniejszym stopniu w prążku pierwotnym, wokół E7,5-E8 rozwoju embrionalnego, a dobrze działające przeciwciała przeciwko T firmy WMIF są dostępne na rynku i umożliwiają procedurę barwienia. Komórki węzła i płytki struny grzbietowej charakteryzują się również zwężonymi powierzchniami wierzchołkowymi, które są skierowane na zewnątrz, a zatem mogą być barwione falloidyną sprzężoną z fluorescencją w celu oznaczenia F-aktyny w zwężeniach wierzchołkowych. Używając tych odczynników jako przykładów, kombinacja barwienia T i F-aktyny przez WMIF zapewnia reprezentację węzła i płytki struny grzbietowej w 3D u gastrulatujących zarodków myszy, jak pokazujemy w kroku 2 8. Jednak markery rzęsek, takie jak ARL13B lub acetylowana tubulina, a także inne markery węzła i płytki struny grzbietowej, takie jak FOXA2, mogą być również używane do wykonywania WMIF na rozwijających się zarodkach myszy3,4.
Wykazaliśmy, że białko 1 (STRIP1) oddziałujące z prążkowiem jest niezbędne do prawidłowego gastrulacji i morfogenezy u zarodka myszy<klasa sup="xref">8. STRIP1 jest kluczowym składnikiem kompleksów fosfataz i kinaz oddziałujących z prążkowiem (STRIPAK), które my i inni zaangażowaliśmy w organizację cytoszkieletu aktynowego8,12. Główną wadą zarodków z mutacją Strip1 jest tworzenie mezodermy osiowej (węzeł i płytka struny grzbietowej) oraz wydłużenie przednio-tylnej osi ciała. Użyliśmy SEM i WMIF do analizy węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach z mutacją typu dzikiego (WT) i Strip1, jak pokazujemy w reprezentatywnych wynikach i odpowiednich rysunkach.

<table><tbody><tr><td>1,1,1,3,3,3 Heksametylodylazan (HMDS)</td><td>Carl Roth</td><td>3840</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-T</td><td>R& D Systems</td><td>AF2058</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Blazers Union</td><td>CPD 020</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099,0005</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dialdehydu glutarowego 25%</td> <td>Merck</td><td>1042390250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka powlekająca SEM Pomoce</td><td>agarowe PS3 do mikroskopii elektronowej</td><td>Mikroskop PS3</td><td></td></tr><tr><td>SEM Quantum FEG 250</td><td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td><td>Quantum FEG 250</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Zambrion myszy po implantacji ulega poważnym zmianom kształtu po rozpoczęciu gastrulacji i morfogenezy. Cechą charakterystyczną morfogenezy jest tworzenie przejściowych organizatorów, węzła i płytki struny grzbietowej, z komórek, które przeszły przez prymitywną smugę. Prawidłowe tworzenie tych centrów sygnalizacyjnych jest niezbędne do rozwoju planu ciała, a techniki ich wizualizacji są bardzo interesujące dla biologów zajmujących się rozwojem myszy. Węzeł i płytka struny grzbietowej leżą na brzusznej powierzchni gastrulujących zarodków myszy około 7,5 dnia rozwoju embrionalnego (E). Węzeł jest strukturą w kształcie miseczki, której komórki posiadają pojedynczą smukłą rzęskę. Właściwa subkomórkowa lokalizacja i rotacja rzęsek w jamie węzłowej decyduje o asymetrii lewo-prawo. Komórki płytki struny grzbietowej również posiadają pojedyncze rzęski, choć krótsze niż komórki węzłowe. Płytka struny grzbietowej tworzy strunę grzbietową, która działa jako ważny organizator sygnalizacji dla somitogenezy i wzorców neuronalnych. Ponieważ komórki węzła i płytki struny grzbietowej są przejściowo obecne na powierzchni i posiadają rzęski, można je uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wśród innych technik stosowanych do wizualizacji tych struktur na poziomie komórkowym jest immunofluorescencja całego wierzchowca (WMIF) z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom, które są silnie eksprymowane w węźle i płytce strunowej grzbietowej. W tym raporcie opisujemy nasze zoptymalizowane protokoły wykonywania SEM i WMIF węzła i płytki struny grzbietowej w rozwijających się zarodkach myszy, aby pomóc w ocenie kształtu tkanki i organizacji komórkowej w zarodkach ze zmutowanymi zarodkami typu dzikiego i gastrulacji.

Aby zbadać tworzenie się węzła w embrionach typu WT oraz mutantach Strip1 w ok. E7.5, zastosowano SEM zgodnie z opisem w Kroku 1, co przedstawiono na Ryc. 18. Szczegóły ultrastrukturalne topologii zewnętrznej uzyskane za pomocą SEM były bardzo informacyjne i od razu stało się jasne, że w przeciwieństwie do węzła w kształcie wgłębienia w embrionach WT, embriony mutantów miały węzeł spłaszczony i nieregularny. Większe powiększenie embrionów ujawniło charakterystyczne rzęski na komórkach węzła, co pozwoliło na ich jednoznaczną identyfikację. Pozornie niższa gęstość rzęsek u mutantów może wynikać z utraty struktury wgłębienia i zakrzywienia węzła lub z mniejszej liczby komórek węzła. Płyta strunowa, która wydaje się wyłaniać z węzła, była również nieregularna w embrionach mutantów. Można je było zidentyfikować po krótszych rzęskach. Zatem SEM miało kluczowe znaczenie dla ujawnienia defektów morfogenezy węzła u mutantów Strip18. W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy również SEM, aby wykazać brak rzęsek w węźle embrionalnym mutantów pozbawionych centrioli, które stanowią matrycę dla rzęsek9.
Aby zbadać defekty tworzenia mezo dermo osiowego w zarodkach mutantów Strip1 na poziomie komórkowym, zastosowano WMIF zgodnie z opisem w Kroku 2, co przedstawiono na Rysunku 2. Dzięki tej technice węzeł oraz płytka notochordalna zostały łatwo zidentyfikowane poprzez barwienie na F-aktynę oraz białko T. Komórki węzła i płytki notochordalnej typu WT posiadają zwężone domeny apikalne, w których wzbogacona była F-aktyna, a barwienie jądrowe na białko T było wyraźne. Płytka notochordalna rozciągała się w kierunku rostralnym w typie WT, natomiast u mutanta była krótka i nieregularna. Dane wykazały, że organizacja F-aktyny jest nieprawidłowa w różnych warstwach zarodkowych embrionów mutantów, w tym w mezo dermo osiowym8. Zatem WMIF okazało się pomocne w badaniu defektów tworzenia węzła i płytki notochordalnej w zarodkach mutantów Strip1.
<img alt="SEM embrionalnego węzła i notochordy; WT vs Strip1. Diagram porównawczy biologii rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawnia defekty morfogenezy węzła w embrionach myszy z mutacją Strip1. (Góra) Analizy SEM brzusznych węzłów embrionalnych i płytek notochordalnych (Noto)8 u myszy WT i mutantów Strip1. Po lewej stronie przedstawiono przykład obrazu przy niskim powiększeniu embrionu WT. (Dół) Większe powiększenia centrów węzłów pokazanych powyżej, ujawniające długie monocylia wystające z komórek węzła. Kierunek przedni skierowany jest w górę na wszystkich panelach. Paski skali: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii konfokalnej WT vs Strip1 w rozwoju węzła komórkowego, podkreślający wzorce F-aktyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Immunofluorescencja całych zarodków wykazuje nieprawidłowości węzła i płytki notochordalnej na poziomie komórkowym w embrionach mutantów Strip1. (Góra) Brzuszna wizualizacja 3D (oprogramowanie Volocity) WMIF embrionów WT i mutantów Strip1 z zastosowaniem kombinacji barwienia faloidyną sprzężoną z fluorescencją (F-aktyna, czerwony) oraz przeciwciałem T (zielony). (Dół) Więcej przykładów powyższego barwienia z większym powiększeniem skupionym na węźle, obejmujących również DAPI. Strona przednia znajduje się u góry na wszystkich panelach. Paski skali: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Węzeł i płytka struny grzbietowej są niezbędnymi organizatorami podczas rozwoju embrionalnego myszy. Dzisiaj opiszemy dwie techniki stosowane przez biologów rozwojowych do wizualizacji i badania tych struktur. W pierwszym protokole pokażemy, jak wykonać elektromikroskopię skaningową, SEM, a w drugim immunofluorescencję całej góry.Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowo obecne na powierzchni zarodka w dniu embrionalnym E7.75, z naciskiem maleńkie rzęski wystają na zewnątrz, co umożliwia ich identyfikację i wizualizację przez SEM. W obu protokołach zademonstrujemy kluczowe kroki w obchodzeniu się ze stosunkowo małymi zarodkami myszy i skupimy się na tym, jak je przenieść i pokierować. Na początek otwórz brzuch poddanej eutanazji ciężarnej myszy przez skórę i krezki.Za pomocą nożyczek i cienkich kleszczy usuń macicę. Krótko opłucz macicę w wodzie destylowanej i umieść ją na małej szalce Petriego zawierającej PBS. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego i cienkich kleszczy, aby usunąć mięśnie macicy, aby uwolnić poszczególne decidui.Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj każdą deciduę parą kleszczy i użyj innej pary, aby wykonać podłużne nacięcie o pełnej grubości między czerwoną częścią a białą częścią. Wykonaj powierzchowne perforacje pionowo wzdłuż białej części decidua, przylegając do nacięcia. Następnie rozsuń decidua poziomo na dwie połówki i ostrożnie wyjmij zarodek z białej części decidua.Następnie przenieś zarodki na nową szalkę Petriego zawierającą sterylny, przefiltrowany PBS. Usuń błonę Reicherta z każdego zarodka, zaczynając od stożka ektołożyskowego. W celu przyszłego genotypowania usuń mały kawałek woreczka żółtkowego.Pod kapturem chemicznym przenieś zarodki do probówki mikrowirówkowej zawierającej utrwalacz klasy EM złożony z 2,5% aldehydu glutarowego i sterylnego przefiltrowanego PBS. Następnie usuń utrwalacz z probówki, nie naruszając zarodków. Umyj zarodki trzy razy w sterylnym, przefiltrowanym PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Odwodnić zarodki w serii etanolowej przez pięć minut każdy, używając 50%, 70% i 85% etanolu rozcieńczonego w PBS. Umyj trzy razy w 100% etanolu. Przechowuj zarodki w 100% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub przejdź do następnego kroku.Następnie przenieś embroyos do odpowiedniego naczynia i usuń pozostały płyn. Dodaj HMDS i etanol w stosunku jeden do jednego do zarodków przez 30 minut. Następnie usuń płyn i dodaj czysty HMDS na 30 minut.Usuń płyn z zarodków za pomocą pipety i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut. Użyj małej szczoteczki i dwustronnej taśmy, aby zamontować wysuszone zarodki na kikutach SEM, brzuszną stroną do góry. Włóż klocki do maszyny do napylania w celu powlekania cząstkami złota.Jednym z najdelikatniejszych etapów w cząsteczce SEM jest zamontowanie zarodków w odpowiedniej orientacji na kikutu. Gdy zarodek wyląduje na taśmie, orientacji nie można już zmienić. Następnie umieść pokryte kikuty w mikroskopie SEM, zastosuj próżnię i obserwuj węzły embrionalne i komórki płytki strunowej grzbietowej z rzęskami.Po usunięciu zarodków w E7.75 umieść je w PBS Tween na szalce Petriego na lodzie. Pod kapturem chemicznym przenieś zarodki do probówki mikrowirówki zawierającej roztwór utrwalający. Następnie wyjmij utrwalacz z tubki, uważając, aby nie dotykać zarodków.Następnie umyj zarodki trzykrotnie w PBS zawierającym 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce nutacyjnej. Usuń ostatnie płukanie z zarodków i dodaj roztwór blokujący zawierający PBS Triton, z 10% inaktywowaną surowicą inaktywowaną ciepłem. Zablokuj zarodki na co najmniej dwie godziny na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usuń blokadę i dodaj około jednego mililitra przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Inkubuj zarodki przez noc na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i zachowaj je do późniejszego wykorzystania.Następnie dwukrotnie przepłucz zarodki PBS Triton. I umyj je trzy razy przez 30 minut na nutatorze. Zastąp płukanie rozcieńczonym sprzężonym z fluorescencji przeciwciałem drugorzędowym przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza.I inkubować przez noc na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy usunąć przeciwciało drugorzędowe i dwukrotnie przepłukać zarodki PBS Triton. Przed trzykrotnym myciem przez 30 minut za pomocą PBS Triton.Zastąp ostatnie pranie PBS Triton zawierającym rozcieńczoną fluorescencję, sprzężoną falloidynę i rozcieńczoną DAPI oraz zabarwić przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie przepłucz zarodki w PBS Triton. I umyj je PBS Triton przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zastąp PBS Triton PBS PBS i pozostaw zarodki na lodzie. Następnie przygotuj czyste, dodatnio naładowane szkiełka, szkiełka nakrywkowe i wodne media montażowe na bazie glicerolu. Umieść na szkiełku dwa kawałki przezroczystej taśmy w odległości 15 milimetrów od siebie.Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj zmodyfikowanej pipety P200, aby przenieść zarodek do szkiełka. Za pomocą cienkich kleszczy wykonaj dwa pełne nacięcia po bocznych stronach woreczka żółtkowego, aby rozwinąć zarodek. Następnie ustaw zarodek brzuszną stroną do góry.Dodaj 50 mikrolitrów pożywki montażowej do zarodka. Następnie dodaj odrobinę nośnika montażowego do szkiełka nakrywkowego. Umieść go okrakiem na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść go na zarodki za pomocą zgiętej igły.Użyj chłonnej chusteczki, aby usunąć nadmiar mediów montażowych, uważając, aby nie przesunąć szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj dużej ilości lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka nakrywkowego. Na koniec użyj skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby obserwować zarodki.Bardzo ważne jest, aby nie przesuwać szkiełka nakrywkowego po zamontowaniu go na zarodkach, ponieważ może to zniekształcić je w celu wizualizacji 3D. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej zaobserwowano tworzenie się węzła w zmutowanych zarodkach myszy typu dzikiego i paskowego w E7,75. W przeciwieństwie do węzła w kształcie dołu u typu dzikiego, zmutowane zarodki wykazywały spłaszczony i regularny węzeł oraz płytkę węzłowo-rdzeniową.Całość do immunofluorescencji wykorzystano do zbadania defektów tworzenia węzłów i płytek strunowych w zarodkach z mutacją Strip 1 na poziomie komórkowym. Dane wykazały, że były one nieprawidłowe i skarłowaciałe w zmutowanych zarodkach. Węzeł i płytka korowo-węzłowa są tylko przejściowo obecne na powierzchni zarodka, dlatego czas ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia SEM.Na przykład dwa do czterech zarodków somitowych są dobre do analizy SEM dojrzałego węzła z długimi rzęskami. Odczynniki czystości są również niezbędne dla powodzenia tych technik, zwłaszcza w badaniu ultrastruktury za pomocą SEM. Drobne zanieczyszczenia, które przyklejają się do zarodka, zwykle powodują ogromne artefakty.Uważamy, że te dwie techniki dostarczają uzupełniających się informacji na temat struktury węzła i płytki węzłowo-korowej podczas normalnego rozwoju oraz u mutantów, które wykazują defekty w tworzeniu tych struktur.

visualizing-node-notochordal-plate-gastrulating-mouse-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Źródło: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodysekcja i wizualizacja skaningowej mikroskopii elektronowej myszy z całego mocowania. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie i obrazowanie tkanki splotu naczyniówkowego z mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Proces obejmuje utrwalanie, odwadnianie i powlekanie tkanki przewodzącą warstwą platyny w celu stabilizacji i przygotowania próbki do obrazowania. SEM rejestruje szczegółowe obrazy komórek nabłonka z...

Wizualizacja splotu naczyniówkowego mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Poznaj wizualizację węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry. Metody te pozwalają na szczegółowe badanie morfogenezy tych kluczowych struktur organizujących.

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Przeglądaj więcej filmów