Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Węzeł i płytka struny grzbietowej są niezbędnymi organizatorami podczas rozwoju embrionalnego myszy. Dzisiaj opiszemy dwie techniki stosowane przez biologów rozwojowych do wizualizacji i badania tych struktur. W pierwszym protokole pokażemy, jak wykonać elektromikroskopię skaningową, SEM, a w drugim immunofluorescencję całej góry.

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowo obecne na powierzchni zarodka w dniu embrionalnym E7.75, z naciskiem maleńkie rzęski wystają na zewnątrz, co umożliwia ich identyfikację i wizualizację przez SEM. W obu protokołach zademonstrujemy kluczowe kroki w obchodzeniu się ze stosunkowo małymi zarodkami myszy i skupimy się na tym, jak je przenieść i pokierować. Na początek otwórz brzuch poddanej eutanazji ciężarnej myszy przez skórę i krezki.

Za pomocą nożyczek i cienkich kleszczy usuń macicę. Krótko opłucz macicę w wodzie destylowanej i umieść ją na małej szalce Petriego zawierającej PBS. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego i cienkich kleszczy, aby usunąć mięśnie macicy, aby uwolnić poszczególne decidui.

Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj każdą deciduę parą kleszczy i użyj innej pary, aby wykonać podłużne nacięcie o pełnej grubości między czerwoną częścią a białą częścią. Wykonaj powierzchowne perforacje pionowo wzdłuż białej części decidua, przylegając do nacięcia. Następnie rozsuń decidua poziomo na dwie połówki i ostrożnie wyjmij zarodek z białej części decidua.

Następnie przenieś zarodki na nową szalkę Petriego zawierającą sterylny, przefiltrowany PBS. Usuń błonę Reicherta z każdego zarodka, zaczynając od stożka ektołożyskowego. W celu przyszłego genotypowania usuń mały kawałek woreczka żółtkowego.

Pod kapturem chemicznym przenieś zarodki do probówki mikrowirówkowej zawierającej utrwalacz klasy EM złożony z 2,5% aldehydu glutarowego i sterylnego przefiltrowanego PBS. Następnie usuń utrwalacz z probówki, nie naruszając zarodków. Umyj zarodki trzy razy w sterylnym, przefiltrowanym PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Odwodnić zarodki w serii etanolowej przez pięć minut każdy, używając 50%, 70% i 85% etanolu rozcieńczonego w PBS. Umyj trzy razy w 100% etanolu. Przechowuj zarodki w 100% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub przejdź do następnego kroku.

Następnie przenieś embroyos do odpowiedniego naczynia i usuń pozostały płyn. Dodaj HMDS i etanol w stosunku jeden do jednego do zarodków przez 30 minut. Następnie usuń płyn i dodaj czysty HMDS na 30 minut.

Usuń płyn z zarodków za pomocą pipety i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut. Użyj małej szczoteczki i dwustronnej taśmy, aby zamontować wysuszone zarodki na kikutach SEM, brzuszną stroną do góry. Włóż klocki do maszyny do napylania w celu powlekania cząstkami złota.

Jednym z najdelikatniejszych etapów w cząsteczce SEM jest zamontowanie zarodków w odpowiedniej orientacji na kikutu. Gdy zarodek wyląduje na taśmie, orientacji nie można już zmienić. Następnie umieść pokryte kikuty w mikroskopie SEM, zastosuj próżnię i obserwuj węzły embrionalne i komórki płytki strunowej grzbietowej z rzęskami.

Po usunięciu zarodków w E7.75 umieść je w PBS Tween na szalce Petriego na lodzie. Pod kapturem chemicznym przenieś zarodki do probówki mikrowirówki zawierającej roztwór utrwalający. Następnie wyjmij utrwalacz z tubki, uważając, aby nie dotykać zarodków.

Następnie umyj zarodki trzykrotnie w PBS zawierającym 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce nutacyjnej. Usuń ostatnie płukanie z zarodków i dodaj roztwór blokujący zawierający PBS Triton, z 10% inaktywowaną surowicą inaktywowaną ciepłem. Zablokuj zarodki na co najmniej dwie godziny na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usuń blokadę i dodaj około jednego mililitra przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Inkubuj zarodki przez noc na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i zachowaj je do późniejszego wykorzystania.

Następnie dwukrotnie przepłucz zarodki PBS Triton. I umyj je trzy razy przez 30 minut na nutatorze. Zastąp płukanie rozcieńczonym sprzężonym z fluorescencji przeciwciałem drugorzędowym przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza.

I inkubować przez noc na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy usunąć przeciwciało drugorzędowe i dwukrotnie przepłukać zarodki PBS Triton. Przed trzykrotnym myciem przez 30 minut za pomocą PBS Triton.

Zastąp ostatnie pranie PBS Triton zawierającym rozcieńczoną fluorescencję, sprzężoną falloidynę i rozcieńczoną DAPI oraz zabarwić przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie przepłucz zarodki w PBS Triton. I umyj je PBS Triton przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zastąp PBS Triton PBS PBS i pozostaw zarodki na lodzie. Następnie przygotuj czyste, dodatnio naładowane szkiełka, szkiełka nakrywkowe i wodne media montażowe na bazie glicerolu. Umieść na szkiełku dwa kawałki przezroczystej taśmy w odległości 15 milimetrów od siebie.

Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj zmodyfikowanej pipety P200, aby przenieść zarodek do szkiełka. Za pomocą cienkich kleszczy wykonaj dwa pełne nacięcia po bocznych stronach woreczka żółtkowego, aby rozwinąć zarodek. Następnie ustaw zarodek brzuszną stroną do góry.

Dodaj 50 mikrolitrów pożywki montażowej do zarodka. Następnie dodaj odrobinę nośnika montażowego do szkiełka nakrywkowego. Umieść go okrakiem na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść go na zarodki za pomocą zgiętej igły.

Użyj chłonnej chusteczki, aby usunąć nadmiar mediów montażowych, uważając, aby nie przesunąć szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj dużej ilości lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka nakrywkowego. Na koniec użyj skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby obserwować zarodki.

Bardzo ważne jest, aby nie przesuwać szkiełka nakrywkowego po zamontowaniu go na zarodkach, ponieważ może to zniekształcić je w celu wizualizacji 3D. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej zaobserwowano tworzenie się węzła w zmutowanych zarodkach myszy typu dzikiego i paskowego w E7,75. W przeciwieństwie do węzła w kształcie dołu u typu dzikiego, zmutowane zarodki wykazywały spłaszczony i regularny węzeł oraz płytkę węzłowo-rdzeniową.

Całość do immunofluorescencji wykorzystano do zbadania defektów tworzenia węzłów i płytek strunowych w zarodkach z mutacją Strip 1 na poziomie komórkowym. Dane wykazały, że były one nieprawidłowe i skarłowaciałe w zmutowanych zarodkach. Węzeł i płytka korowo-węzłowa są tylko przejściowo obecne na powierzchni zarodka, dlatego czas ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia SEM.

Na przykład dwa do czterech zarodków somitowych są dobre do analizy SEM dojrzałego węzła z długimi rzęskami. Odczynniki czystości są również niezbędne dla powodzenia tych technik, zwłaszcza w badaniu ultrastruktury za pomocą SEM. Drobne zanieczyszczenia, które przyklejają się do zarodka, zwykle powodują ogromne artefakty.

Uważamy, że te dwie techniki dostarczają uzupełniających się informacji na temat struktury węzła i płytki węzłowo-korowej podczas normalnego rozwoju oraz u mutantów, które wykazują defekty w tworzeniu tych struktur.