Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące cyklu komórkowego i dynamiki populacji komórek macierzystych linii rozrodczej u C. elegans. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga transgenów, jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym i może być modyfikowana w celu badania komórek w wielu różnych warunkach. Byłem bardzo podekscytowany, kiedy po raz pierwszy zobaczyłem tę metodę stosowaną w laboratorium Scheda.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w cykl komórkowy C.elegans, może być również zastosowana do szerszych pytań dotyczących starzenia się, odżywiania lub zmienionych genotypów. Ogólnie rzecz biorąc, laboratoria nowe w tej metodzie mogą zmagać się z początkową idiodysformacją lub barwieniem hematoksyliną C.elegans. Zacznij od zastosowania sterylnej techniki, aby dodać 200 mikrolitrów 10-milimolowego EdU w 100 mililitrach buforu M9 i odpowiednich suplementów do czterech mililitrów świeżo wyhodowanej przez noc kultury MG 1693 E. coli.

Uczynienie idiodiscous wymaga delikatnej równowagi między suplementacją EdU a tymidyną. Ponieważ ilość tymidyny musi być wystarczająca, aby E. coli dobrze rosła, podczas gdy ilość EdU musi być wystarczająca dla solidnej tarczy przed wyrównaniem. Po nie więcej niż 24 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min użyj sterylnej techniki, aby podzielić kulturę między dwie do czterech sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania.

Ponownie zawiesić pelatynę na cztery mililitry świeżego buforu M9 i użyć tej samej pipety, aby nałożyć około 8 kropli roztworu E Coli MG1693 oznaczonego EdU na środek indywidualnej 60-mililitrowej szalki Petriego M9 A o temperaturze pokojowej. Aby nakarmić nicienie bakteriami znakowanymi EdU, użyj świeżego PBS do umycia C.Elegans z naczynia na pożywkę dla nicieni do 1,5-mililitrowej probówki i pozwól zwierzętom na chwilę się uspokoić grawitacyjnie. Umyj zwierzęta od jednego do dwóch razy jednym mililitrem PBS i użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść nicienie na środek trawnika EdU w maleńkiej kropli PBS.

Odczekaj kilka minut, aż płyn zostanie wchłonięty i inkubuj kulturę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Pod koniec inkubacji użyj dwóch mililitrów PBS, aby wypłukać robaki z płytki hodowlanej EdU do szklanego naczynia preparacyjnego. Po rozbiorze i utrwaleniu gonad nicieni, jak opisano wcześniej, przepłukać małą jednomililitrową probówkę ze szkła borokrzemianowego i długą szklaną pipetę Pasteura z PBS uzupełnionym 0,1% tween 20 i użyć pipety do przeniesienia ustalonych gonad do probówki w niewielkiej ilości PBS tween.

Zebrać gonady przez odwirowanie i użyć długiej, ciągnącej szklanej pipety pastewnej, aby usunąć jak najwięcej supernatentu bez naruszania osadu gonad. W celu wykrycia EdU dodaj 100 mikrolitrów koktajlu EdU do gonad i przykryj probówkę folią laboratoryjną na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć gonady raz 100 mikrolitrami buforu do płukania reakcyjnego i cztery razy jednym mililitrem PBS tween.

Po ostatnim myciu dodaj do próbki 25 mikrolitrów podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu uzupełnionego DAPI. Podczas gdy podłoże osiada na gonadach, umieść dużą 2,5% podkładkę agarozową na standardowym szklanym szkiełku mikroskopowym. Następnie spłaszcz za pomocą drugiego slajdu.

Następnie użyj długiej szklanej pipety Pasteura i utrzymuj cały płyn i gonady w wąskiej końcówce pipety, aby zminimalizować utratę próbki podczas przenoszenia gonad do podkładki. Za pomocą rzęsy przyklejonej do wykałaczki rozprowadź gonady na podkładce agarozowej i usuń wszelkie cząsteczki kurzu. Następnie powoli opuść prostokątną szklaną osłonę na gonady, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i usuwając nadmiar roztworu za pomocą chusteczki laboratoryjnej.

Niezawodne liczenie komórek w trzech wymiarach wymaga pewnej wprawy. Korzystanie z wtyczki licznika komórek Fidżi i skryptu, takiego jak zaznaczanie komórek w celu usunięcia wszelkich duplikatów, pomaga w odtwarzaniu zliczeń. Po pozostawieniu szkiełka nakrywkowego na noc, użyj wtyczki licznika komórek i Fidżi, aby ręcznie policzyć każde jądro, oznaczając każde pojedyncze jądro zgodnie z obecnością lub brakiem fosfohistonu trzy EdU lub znakowania komórek strefy pregenetorowej.

Sygnał EdU kolokalizuje się z sygnałem DAPI. W niektórych jądrach sygnał EdU obejmuje wszystkie chromosomy, podczas gdy w innych jądrach sygnał EdU lokalizuje się w jednym do dwóch jasnych punktów, prawdopodobnie na chromosomie X, który replikuje się pod koniec fazy S. Sygnał EdU z udanego 30-minutowego znakowania lokalizuje się w około połowie jąder w strefie pregenetorowej.

Podczas gdy technika ta działa konsekwentnie u młodych dorosłych zwierząt typu dzikiego, znaczna część pokrytych 5-dniowych hermafrodytów nie jest w stanie oznakować w ciągu 30-minutowego impulsu EdU. Czas trwania G2 można oszacować, analizując procent jąder w fazie M, które są dodatnie pod względem EdU w przebiegu czasu, co pozwala na obliczenie mediany i maksymalnego czasu trwania G2. Czas trwania G2 i G1 można oszacować na podstawie procentu wszystkich jąder strefy pregenetorowej, które są dodatnie pod względem EdU, co pozwala na obliczenie maksymalnego czasu trwania połączonych faz. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby użyć tej samej partii szalek EdU, aby zminimalizować zmienność między eksperymentami.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie dodatkowymi przeciwciałami lub odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące cyklu komórkowego, losu komórki lub szlaków sygnałowych. Nie zapominaj, że praca z analogami nukleidydów i parafermeldahydem może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek nitrolowych.