Name: Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z wykorzystaniem analogu tymidyny EdU. Technika nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni centrum zapasów E. coli za MG1693; Baza robaków; Centrum Genetyki Caenorhabditis finansowane przez National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40OD010440) dla szczepów; Zach Pincus za porady statystyczne; Aiping Feng za odczynniki; Luke'owi Schneiderowi, Andrei Scharf, Sandeepowi Kumarowi i Johnowi Brennerowi za szkolenie, porady, wsparcie i pomocną dyskusję; oraz laboratoriom Kornfelda i Schedla w celu uzyskania informacji zwrotnych na temat tego manuskryptu. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 do KK, R01 GM100756 do TS] oraz stypendium przeddoktoranckie National Science Foundation [DGE-1143954 i DGE-1745038 do ZK]. Ani National Institutes of Health, ani National Science Foundation nie odegrały żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu, analizie i interpretacji danych, ani w pisaniu manuskryptu.

<ol><li>Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+and+CDK-2+regulate+proliferative+cell+fate+and+cell+cycle+progression+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline.</a> Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).</li>
<li>Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analyses+of+the+mitotic+region+in+the+Caenorhabditis+elegans+adult+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line.</a> Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).</li>
<li>Seidel, H. S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+quiescence+maintains+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cells+independent+of+GLP-1%2FNotch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li>
<li>Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+accumulation+of+the+proliferating+cell+nuclear+antigen+PCN-1+transitions+from+continuous+in+the+adult+germline+to+intermittent+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+Cell+Cycle+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">elegans Cell Cycle Analysis.</a> Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).</li>
<li>ThermoFisher. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Click-iT+EdU+Imaging+Kits%22">Click-iT EdU Imaging Kits</a>. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPazdernik%2C+N+%22Germ+Cell+Development+in+C.+elegans%22">Germ Cell Development in C. elegans</a>. , Springer. 1-16 (2013).</li>
<li>Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+reproductive+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hansen, D., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferation+versus+meiotic+fate+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+S+phases%2C+X+chromosome+replication%2C+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li>
<li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li>
<li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).</li>
<li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li>
<li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3%2C+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crawley, O., Barroso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin-interacting+protein+WAPL-1+regulates+meiotic+chromosome+structure+and+cohesion+by+antagonizing+specific+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes.</a> eLife. 5 (2), 1-26 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling%2C+impairment+of+cell+cycle+progression%2C+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2%E2%80%B2-deoxyuridine+incorporated+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+C.+elegans+Germline.+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK.</a> in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).</li>
<li>Vos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVos%2C+K+%22De+Cell+Counter+Plugin%22">De Cell Counter Plugin</a>. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+W+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).</li>
<li>Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+promotes+germline+proliferation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans.</a> Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).</li>
<li>Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-autonomous+DAF-16%2FFOXO+activity+antagonizes+age-related+loss+of+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Nature communications. 6 (5), 7107(2015).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFB+and+Insulin+Signaling+Regulate+Reproductive+Aging+via+Oocyte+and+Germline+Quality+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance.</a> Cell. 143 (2), 299-312 (2010).</li>
<li>Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-18%2FPTEN+locally+antagonizes+insulin+signalling+to+couple+germline+stem+cell+proliferation+to+oocyte+needs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans.</a> Development. , 4230-4241 (2015).</li>
<li>Cinquin, A., Chiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+Stem+Cell+Cycling+Balances+Self-Renewal+and%5BTitle%5D)+AND+%22Senescence+of+the+C.+elegans+Germ+Line.+PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and.</a> Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Invitrogen+EdU+%285-ethynyl-2%E2%80%99-deoxyuridine%29%22">Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)</a>. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).</li>
<li>Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+Detection+of+Two+Thymidine+Analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+Primary+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie bakterii znakowanych EdU (krok 1) ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu i jest pierwszym punktem rozwiązywania problemów. Hermafrodyty młodego dorosłego typu dzikiego znakują bardzo niezawodnie w 4-godzinnym impulsie EdU, co czyni to przydatną kontrolą dla każdej nowej partii bakterii znakowanych EdU. Dodatkowo, nienaruszone bakterie znakowane EdU, które dostają się do jelita (u starszych zwierząt lub niektórych mutantów z wadami gardła/młynka) zostaną oznaczone chemią kliknięć i pojawią się jako jasna, ...

W rozwoju zwierząt, setki, tysiące, miliony, miliardy, a nawet biliony podziałów komórkowych są potrzebne do uformowania dorosłego organizmu. Cykl komórkowy, zestaw zdarzeń komórkowych składających się z G1 (przerwa), S (synteza), G2 (przerwa) i M (mitoza) definiuje serię zdarzeń, które są wykonywane przy każdym podziale komórki. Cykl komórkowy jest dynamiczny i najlepiej doceniać go w czasie rzeczywistym, co może być trudne technicznie. Techniki przedstawione w tym protokole pozwalają na wykonanie pomiarów faz i czasu cyklu komórkowego na podstawie nieruchomych obrazów.
Znakowanie analogami nukleozydów, takimi jak 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) lub 5-bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU) jest złotym standardem do identyfikacji fazy S w badaniach dynamiki cyklu komórkowego w dorosłej hermafrodycie Caenorhabditis elegans (C. elegans) linii zarodkowej1,2,3,4,5. Zarówno EdU, jak i BrdU mogą być stosowane w prawie każdym tle genetycznym, ponieważ nie opierają się na żadnym konstrukcie genetycznym. Wizualizacja BrdU wymaga ostrej obróbki chemicznej w celu wystawienia antygenu na barwienie przeciwciałami anty-BrdU, co często jest niezgodne z oceną innych markerów komórkowych uwidocznionych przez współbarwienie z dodatkowymi przeciwciałami. W przeciwieństwie do tego, wizualizacja EdU zachodzi przez chemię kliknięcia w łagodnych warunkach, a zatem jest zgodna z współbarwieniem przeciwciał6,7.
Specyfika etykiety jest jasna, ponieważ jądra zawierają analogi tymidyny (5-etynylo-2'- deoksyurydyny) do DNA tylko podczas fazy S. Wizualizacja odbywa się w tkance utrwalonej. Etykieta EdU jest niewidoczna sama w sobie, dopóki barwnik lub fluorofor zawierający azydek nie zareaguje kowalencyjnie z alkinem w EdU za pomocą katalizowanej miedzią chemii kliknięć8. Znakowanie EdU może dostarczyć natychmiastowych informacji o tym, które jądra są w fazie S, przy użyciu krótkiego impulsu znakowania. EdU może również dostarczać dynamiczne informacje, wykorzystując pogoń impulsową lub ciągłe etykietowanie; Na przykład w eksperymencie z pogonią za impulsami etykieta jest rozcieńczana przy każdym podziale komórki lub rozmnażana w miarę postępu rozwoju komórek niedzielących się.
Hermafrodytowa linia zarodkowa C. elegans jest potężnym modelowym systemem do badań szlaków sygnałowych, komórek macierzystych, mejozy i cyklu komórkowego. Dorosła linia zarodkowa jest spolaryzowaną linią montażową z komórkami macierzystymi znajdującymi się na dystalnym końcu, po której następuje wejście i progresja przez profazę mejotyczną, skoordynowaną z etapami gametogenezy bardziej proksymalnie (ryc. 1). Na bliższym końcu oocyty dojrzewają, ulegają owulacji i zapłodnieniu oraz rozpoczynają embriogenezę w macicy9,10,11. Obszar o średnicy komórki ~20 w pobliżu dystalnej komórki końcowej, który obejmuje mitotycznie cykliczne komórki macierzyste linii zarodkowej, komórki progenitorowe i mejotyczne komórki fazy S, ale nie komórki w mejotycznej profazie, nazywa się strefą progenitorową2,4,9,12. Błony komórkowe zapewniają niepełną separację między jądrami w dystalnej linii zarodkowej, ale komórki strefy progenitorowej przechodzą mitotyczne cykle komórkowe w dużej mierze niezależnie. Mediana czasu trwania cyklu komórkowego mitotycznego komórek strefy progenitorowej linii zarodkowej u młodych dorosłych hermafrodytów wynosi ~6,5 godziny; Faza G1 jest krótka lub nie ma jej wcale, a spoczynek nie jest obserwowany1,2,13. Różnicowanie komórek macierzystych linii zarodkowej zachodzi zasadniczo poprzez bezpośrednie różnicowanie, a zatem brak podziałów wzmacniających tranzyt4. Podczas różnicowania w stadium pachytenu około 4 z 5 jąder nie tworzy oocytów, ale zamiast tego ulega apoptozie, działając jako komórki pielęgniarskie, przekazując swoją zawartość cytoplazmatyczną rozwijającemu się oocytowi12,14,15.
Oprócz oznaczania komórek w fazie S analogami nukleozydów, można zidentyfikować komórki w mitozie i mejozie za pomocą barwienia przeciwciałami. Jądra w mitozie są immunoreaktywne na przeciwciało anty-fosfohistonu H3 (Ser10) (zwane pH3)7,16. Jądra w mejozie są immunoreaktywne na przeciwciało anty-HIM-3 (mejotyczne białko osi chromosomu)17. Jądra w strefie progenitorowej można zidentyfikować na podstawie braku HIM-3, obecności nukleoplazmatycznego REC-818, lub obecności WAPL-119. Intensywność WAPL-1 jest najwyższa w gonadzie somatycznej, wysoka w strefie progenitorowej i niska we wczesnych profazach mejotycznych19. Możliwych jest kilka pomiarów cyklu komórkowego z kilkoma wariantami protokołu: I) identyfikacja jąder w fazie S i pomiar wskaźnika fazy S; II) Zidentyfikuj jądra w fazie M i zmierz wskaźnik fazy M; III) określenie, czy jądra znajdowały się w mitotycznej czy mejotycznej fazie S; IV) zmierzyć czas trwania G2; V) zmierzyć stopień zaawansowania faz G2+M+G1; VI) zmierzyć szybkość wnikania mejotycznego; VII) oszacować tempo progresji mejotycznej.
Można wykonać wiele pomiarów cyklu komórkowego na podstawie zaledwie kilku rodzajów eksperymentów w laboratorium mokrym. Poniższy protokół opisuje 30-minutowe znakowanie impulsowe poprzez karmienie dorosłych hermafrodytów C. elegans bakteriami znakowanymi EdU i wspólne znakowanie komórek fazy M poprzez barwienie przeciwciałem anty-pH3 i komórek strefy progenitorowej przez barwienie przeciwciałem anty-WAPL-1. Do dodatkowych pomiarów wymagane są jedynie zmiany w czasie trwania paszy EdU (krok 2.5), rodzaju zastosowanych przeciwciał (krok 5) i analizach (krok 8.3).

<table><tbody><tr><td>E. coli MG1693</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6411</td><td>dobrze rośnie w standardowym, niesuplementowanym LB</td></tr><<tr><td>em>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5-etynylo-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>900584-50MG</td><td>lub użyj EdU dostarczonego w zestawie</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>D9434-500G</td><td>D-(+)-dekstroza</td></tr><tr><td>Tiamina (witamina B1)</td><td>Sigma</td><td>T4625-5G</td><td>Odczynnik klasy</td></tr><tr><td>Tymidyna</td><td>Sigma</td><td>T1895-1G</td><td>BioOdczynnik</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>M1880-1KG</td><td>MgSO4, Odczynnik</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy, bezwodny</td><td>Fisher</td><td>BP332-500G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5379-500G</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>A4514-500G</td><td>NH4Cl, odczynnik Plus</td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>US Biologiczny</td><td>C13071058</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>C3881-500G</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>LB Bulion (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3522-1KG</td><td>Używany w 25g/L</td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td>0,241g/10ml</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Calbiochem Omnipur</td><td>6506</td><td>domowy PBS działa równie dobrze</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu, ampułki klasy EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>10ml ampułki</td></tr><tr><td>100% metanol</td><td>Metanol Thermo Fisher Scientific</td><td>A454-1L</td><td>ze złotą etykietą ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej morfologii z niektórymi przeciwciałami</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>Lot 1671330</td></tr><tr><td>królika anty-WAPL-1</td><td>Novus biologiczne</td><td>49300002</td><td>Lot G3048-179A02, używany w 1:2000</td></tr><tr><td>mysi klon anty-pH3 3H10</td><td>Millipore</td><td>05-806</td><td>Lot#2680533, używany w 1:500</td></tr><tr><td>kozio-anty-królik IgG sprzężony Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Lot 1256147, stosowany w stosunku 1:400</td></tr><tr><td>kozio-anty-mysie IgG-sprzężone Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Lot 1511347, stosowany w 1:400</td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium zawierające dichlorowodorek 4',6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>zamiast tego można użyć podłoża montażowego bez DAPI, po oddzielnym lakierze do paznokci do inkubacji DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Wet n Wild</td><td>DTC450B</td><td>każdy przezroczysty lakier do paznokci powinien działać</td></tr><tr><td>S-medium</td><td>różne</td><td></td><td>zobacz wormbook.org</td></tr><tr><td>dla buforu protokołu M9</td><td>różne</td><td></td><td>patrz wormbook.org dla protokołu</td></tr><tr><td>M9 agar</td><td></td><td></td> różne <td>ten sam przepis co bufor M9, ale dodaj 1,7% agaru</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu nicieni</td><td>różne</td><td></td><td>zobacz wormbook.org dla protokołu</td></tr><tr><td>preparacji szkła zegarkowego</td><td>Carolina Biological</td><td>42300</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm folia laboratoryjna</td><td>Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego</td><td>PM-996</td><td>Folia laboratoryjna o szerokości 4 cali</td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td> Petriego o <td>średnicy 60 mm</td></tr><tr><td>Długie szklane pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1ml</td><td>MidSci Avant</td><td>2926</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>500 ml Kolba</td><td></td><td></td><td></td>Erlenmyera</tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>25G Igły 5/8"</td><td>BD PrecisionGlide&nbsp;</td><td></td><td></td>305122</tr><tr><td>5ml szklana probówka wirówkowa</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki ze szkła borokrzemianowego 1ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nr 1 szkiełka nakrywkowe 22 x 40 mm</td><td></td><td></td><td>nr 1,5 mogą pracować, również</td></tr><tr><td>37 & deg; C Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>z wytrząsarką</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stołowa Wirówka kliniczna</td><td>IEC</td><td>428</td><td>z 6 wahliwymi wirnikami kubełkowymi</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 & deg; Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>4 & stopnie; C lodówka-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& deg; C zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obserwator Z1</td><td>mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 63X 1,4 soczewka obiektywowa zanurzeniowa w oleju</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraview Vox system konfokalny z wirującą tarczą</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td></td><td>System konfokalny z wirującym dyskiem firmy Nikon działa bardzo dobrze, jak opisano tutaj: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej c. elegans z analogiem tymidyny edu

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Analiza cyklu komórkowego u eukariontów często wykorzystuje morfologię chromosomów, ekspresję i/lub lokalizację produktów genowych wymaganych w różnych fazach cyklu komórkowego, lub włączenie analogów nukleozydów. Podczas fazy S polimerazy DNA wprowadzają analogi tymidyny, takie jak EdU lub BrdU, do chromosomalnego DNA, oznaczając komórki do analizy. W przypadku C. elegans analog nukleozydu EdU jest podawany robakom podczas regularnej hodowli i jest zgodny z technikami immunofluorescencyjnymi. Linia zarodkowa C. elegans jest potężnym systemem modelowym do badań szlaków sygnałowych, komórek macierzystych, mejozy i cyklu komórkowego, ponieważ jest przezroczysta, genetycznie łatwa, a profaza mejotyczna i różnicowanie komórkowe / gametogeneza zachodzą w sposób podobny do montażu liniowego. Te cechy sprawiają, że EdU jest doskonałym narzędziem do badania dynamicznych aspektów mitotycznie cyklicznych komórek i rozwoju linii zarodkowej. Protokół ten opisuje, jak skutecznie przygotować bakterie EdU, karmić je hermafrodytami C. elegans typu dzikiego, preparować gonady hermafrodytów, barwić w celu włączenia EdU do DNA, barwieć przeciwciałami w celu wykrycia różnych markerów cyklu komórkowego i rozwoju, obrazować gonadę i analizować wyniki. Protokół opisuje zmiany w metodzie i analizie pomiaru wskaźnika fazy S, wskaźnika fazy M, czasu trwania G2, czasu trwania cyklu komórkowego, szybkości wnikania mejotycznego i szybkości progresji profazy mejozycznej. Metodę tę można dostosować do badania cyklu komórkowego lub historii komórek w innych tkankach, stadiach, tłach genetycznych i warunkach fizjologicznych.

Ponieważ do wbudowania EdU wymagana jest synteza DNA, można wywnioskować, że jądra oznakowane EdU przeszły przez fazę S w czasie trwania okna znakowania EdU. Jądra, które uległy oznakowaniu podczas 30-minutowego podawania EdU bakteriom, można interpretować jako jądra będące w fazie S w momencie sekcji. Jądra oznakowane w dłuższym, ciągłym eksperymencie podawania EdU mogły zostać oznakowane na początku okna czasowego i od tego czasu opuścić fazę S, lub mogły zostać oznakowane w późnej częś...

Opisano metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do identyfikacji fazy S i analizy dynamiki cyklu komórkowego w hermafrodytycznej linii zarodkowej C. elegans przy użyciu analogu tymidyny EdU. Ta metoda nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące cyklu komórkowego i dynamiki populacji komórek macierzystych linii rozrodczej u C. elegans. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga transgenów, jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym i może być modyfikowana w celu badania komórek w wielu różnych warunkach. Byłem bardzo podekscytowany, kiedy po raz pierwszy zobaczyłem tę metodę stosowaną w laboratorium Scheda.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w cykl komórkowy C.elegans, może być również zastosowana do szerszych pytań dotyczących starzenia się, odżywiania lub zmienionych genotypów. Ogólnie rzecz biorąc, laboratoria nowe w tej metodzie mogą zmagać się z początkową idiodysformacją lub barwieniem hematoksyliną C.elegans. Zacznij od zastosowania sterylnej techniki, aby dodać 200 mikrolitrów 10-milimolowego EdU w 100 mililitrach buforu M9 i odpowiednich suplementów do czterech mililitrów świeżo wyhodowanej przez noc kultury MG 1693 E. coli.Uczynienie idiodiscous wymaga delikatnej równowagi między suplementacją EdU a tymidyną. Ponieważ ilość tymidyny musi być wystarczająca, aby E. coli dobrze rosła, podczas gdy ilość EdU musi być wystarczająca dla solidnej tarczy przed wyrównaniem. Po nie więcej niż 24 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min użyj sterylnej techniki, aby podzielić kulturę między dwie do czterech sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania.Ponownie zawiesić pelatynę na cztery mililitry świeżego buforu M9 i użyć tej samej pipety, aby nałożyć około 8 kropli roztworu E Coli MG1693 oznaczonego EdU na środek indywidualnej 60-mililitrowej szalki Petriego M9 A o temperaturze pokojowej. Aby nakarmić nicienie bakteriami znakowanymi EdU, użyj świeżego PBS do umycia C.Elegans z naczynia na pożywkę dla nicieni do 1,5-mililitrowej probówki i pozwól zwierzętom na chwilę się uspokoić grawitacyjnie. Umyj zwierzęta od jednego do dwóch razy jednym mililitrem PBS i użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść nicienie na środek trawnika EdU w maleńkiej kropli PBS.Odczekaj kilka minut, aż płyn zostanie wchłonięty i inkubuj kulturę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Pod koniec inkubacji użyj dwóch mililitrów PBS, aby wypłukać robaki z płytki hodowlanej EdU do szklanego naczynia preparacyjnego. Po rozbiorze i utrwaleniu gonad nicieni, jak opisano wcześniej, przepłukać małą jednomililitrową probówkę ze szkła borokrzemianowego i długą szklaną pipetę Pasteura z PBS uzupełnionym 0,1% tween 20 i użyć pipety do przeniesienia ustalonych gonad do probówki w niewielkiej ilości PBS tween.Zebrać gonady przez odwirowanie i użyć długiej, ciągnącej szklanej pipety pastewnej, aby usunąć jak najwięcej supernatentu bez naruszania osadu gonad. W celu wykrycia EdU dodaj 100 mikrolitrów koktajlu EdU do gonad i przykryj probówkę folią laboratoryjną na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć gonady raz 100 mikrolitrami buforu do płukania reakcyjnego i cztery razy jednym mililitrem PBS tween.Po ostatnim myciu dodaj do próbki 25 mikrolitrów podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu uzupełnionego DAPI. Podczas gdy podłoże osiada na gonadach, umieść dużą 2,5% podkładkę agarozową na standardowym szklanym szkiełku mikroskopowym. Następnie spłaszcz za pomocą drugiego slajdu.Następnie użyj długiej szklanej pipety Pasteura i utrzymuj cały płyn i gonady w wąskiej końcówce pipety, aby zminimalizować utratę próbki podczas przenoszenia gonad do podkładki. Za pomocą rzęsy przyklejonej do wykałaczki rozprowadź gonady na podkładce agarozowej i usuń wszelkie cząsteczki kurzu. Następnie powoli opuść prostokątną szklaną osłonę na gonady, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i usuwając nadmiar roztworu za pomocą chusteczki laboratoryjnej.Niezawodne liczenie komórek w trzech wymiarach wymaga pewnej wprawy. Korzystanie z wtyczki licznika komórek Fidżi i skryptu, takiego jak zaznaczanie komórek w celu usunięcia wszelkich duplikatów, pomaga w odtwarzaniu zliczeń. Po pozostawieniu szkiełka nakrywkowego na noc, użyj wtyczki licznika komórek i Fidżi, aby ręcznie policzyć każde jądro, oznaczając każde pojedyncze jądro zgodnie z obecnością lub brakiem fosfohistonu trzy EdU lub znakowania komórek strefy pregenetorowej.Sygnał EdU kolokalizuje się z sygnałem DAPI. W niektórych jądrach sygnał EdU obejmuje wszystkie chromosomy, podczas gdy w innych jądrach sygnał EdU lokalizuje się w jednym do dwóch jasnych punktów, prawdopodobnie na chromosomie X, który replikuje się pod koniec fazy S. Sygnał EdU z udanego 30-minutowego znakowania lokalizuje się w około połowie jąder w strefie pregenetorowej.Podczas gdy technika ta działa konsekwentnie u młodych dorosłych zwierząt typu dzikiego, znaczna część pokrytych 5-dniowych hermafrodytów nie jest w stanie oznakować w ciągu 30-minutowego impulsu EdU. Czas trwania G2 można oszacować, analizując procent jąder w fazie M, które są dodatnie pod względem EdU w przebiegu czasu, co pozwala na obliczenie mediany i maksymalnego czasu trwania G2. Czas trwania G2 i G1 można oszacować na podstawie procentu wszystkich jąder strefy pregenetorowej, które są dodatnie pod względem EdU, co pozwala na obliczenie maksymalnego czasu trwania połączonych faz. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby użyć tej samej partii szalek EdU, aby zminimalizować zmienność między eksperymentami.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie dodatkowymi przeciwciałami lub odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące cyklu komórkowego, losu komórki lub szlaków sygnałowych. Nie zapominaj, że praca z analogami nukleidydów i parafermeldahydem może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek nitrolowych.

cell-cycle-analysis-c-elegans-germline-with-thymidine-analog

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.

Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z wykorzystaniem analogu tymidyny EdU. Technika nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Przeglądaj więcej filmów