Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Weźmy szkiełko z mikromacierzy zawierające peptydy histonowe z docelowymi i niedocelowymi modyfikacjami potranslacyjnymi lub PTM.

Peptydy są unieruchamiane za pomocą sprzężonej biotyny w określonych miejscach na szkiełku podstawowym funkcjonalizowanym streptawidyną.

Plamki zawierają również unieruchomiony zielony fluorofor sprzężony z biotyną, ułatwiający identyfikację plamek.

Wprowadzić bufor blokujący, zapobiegający niespecyficznym interakcjom przeciwciał.

Usunąć bufor i odwirować w celu wysuszenia szkiełka.

Wewnątrz drukarki woskowej obramuj tablicę woskiem.

Zrównoważ tablicę za pomocą bufora hybrydyzacji.

Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla docelowego PTM.

Wprowadź przeciwciała drugorzędowe sprzężone z czerwonym fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Usunąć niezwiązane przeciwciała i odwirować w celu wysuszenia szkiełka.

Zobrazuj slajd za pomocą skanera z mikromacierzą. Zielona fluorescencja pomaga zidentyfikować plamki, podczas gdy czerwona fluorescencja wskazuje na interakcję PTM-przeciwciało, wykazując swoistość przeciwciał.

Rozpoznanie docelowego PTM wykazuje swoistość przeciwciał, podczas gdy rozpoznanie niedocelowych PTM wskazuje na reaktywność krzyżową przeciwciał.

Kierując się mapą płytki źródłowej, załaduj od 1 do 2 mikrolitrów każdej cechy peptydu do wyznaczonych dołków jednej lub więcej 384-dołkowych płytek o małej objętości. Rozcieńczyć każdą cechę dziesięciokrotnie 1x białkowym buforem drukującym mikromatrycę, uzupełnionym 1% albuminą surowicy bydlęcej i 5 mikrogramami na mikrolitr biotyny znakowanej fluoresceiną. Następnie odwiruj płytki w temperaturze pokojowej 500 razy g przez 2 minuty. Następnie opróżnij pojemnik na odpady drukarki mikromacierzowej. Napełnij roztwór myjący w pojemnikach nawilżacza sterylną wodą destylowaną. Wprowadź parametry szkiełka matrycy w oprogramowaniu drukarki mikromacierzy.

Ustaw procedurę prania na 1-sekundowe pranie z pojedynczym zanurzeniem, pranie po praniu, aby ponownie zanurzyć szpilki pięć razy, a wilgotność na 60%. Następnie włóż szkiełka szklane pokryte streptawidyną do płyt podłoża. Załaduj płyty dociskowe do podnośnika płytowego. Włóż płyty źródłowe do uchwytów płyt i załaduj uchwyty do podnośnika płyt źródłowych. Uruchom proces drukowania.

Następnie usuń płyty dociskowe podłoża z instrumentu. Zablokuj wydrukowane slajdy za pomocą buforu blokującego 1x mikromacierz białkowa na 30 minut, potrząsając. Następnie umyj szkiełka w roztworze soli fizjologicznej o pH 7,6 i roztworze soli fizjologicznej o pH 7,6 przez 10 minut. Powtórz pranie ze świeżą partią PBS. Wysuszyć szkiełka przez odwirowanie przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.

Następnie podgrzej drukarkę woskową do mikromacierzy w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez 30 minut lub do momentu, gdy wosk się rozpuści. Następnie włóż szkiełko zadrukowaną stroną do dołu do uchwytu i wyrównaj uchwyt z formą drukarki. Doprowadź formę do kontaktu ze szkiełkiem i przytrzymaj przez dwie sekundy. Następnie szybko zdejmij szkiełko z uchwytu i sprawdź obramowania wosku, aby upewnić się, że matryce są prawidłowo zamknięte. Przechowuj podzielone szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza w suchym, ciemnym miejscu.

Aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji, umieść szkiełko z podzieloną na partycje w plastikowym naczyniu i przykryj szkiełko buforem hybrydyzacyjnym. Utrzymuj równowagę szkiełka przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, potrząsając z małą prędkością. Wysuszyć szkiełko, obracając je w wirówce do szkiełek mikromacierzowych w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 5 mikrolitrów każdego roztworu przeciwciała histonowego PTM do co najmniej dwóch dołków macierzy i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała i przemyć matrycę zimnym PBS trzy razy, każdy po 5 minut, w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj matrycę w roztworze przeciwciała drugorzędowego sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, przy braku światła. Umyj szkiełko trzykrotnie zimnym PBS, tak jak poprzednio.

Zanurz matrycę w temperaturze pokojowej 0,1x PBS, aby usunąć nadmiar soli i wysusz szkiełko przez krótkie odwirowanie w temperaturze pokojowej. Zobrazuj szkiełko za pomocą skanera z mikromacierzą w rozdzielczości co najmniej 25 mikronów.