Protokół modelowania rozwoju i implantacji blastocyst u ludzi

Badania nad ludzkimi embrionami są ograniczone ze względu na ich niską dostępność i względy etyczne, dlatego uzyskanie indywidualnych modeli wiernie odwzorowujących wczesny rozwój człowieka wspierałoby postęp naukowy i medyczny. Zdolność tej techniki do przewidywania rozwoju człowieka zależy od jej zdolności do skutecznego odtwarzania sekwencji determinacji i morfogenezy blastocysty, zgodnie z sekwencją i tempem rozwoju, a takie modelowanie zapewniłoby tworzenie komórek, które naprawdę odzwierciedlają stadium blastocysty. W przyszłości ludzkie blastoidy mogą być wykorzystywane do identyfikacji celów terapeutycznych i przyczyniać się do modelowania przedklinicznego, na przykład w celu ulepszenia pożywki do zapłodnienia in vitro lub opracowania niehormonalnych środków antykoncepcyjnych.

Procedurę zademonstrują Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer i Giovanni Sestini. Aby rozpocząć, przygotuj i wstępnie podgrzej pożywkę PXGL, pożywkę podstawową N2B27, bufor myjący, PBS i pożywkę agregacyjną. Wykluczyć MEF z zawiesiny hPSC do tworzenia blastoidów.

W celu wykluczenia MEF przygotuj płytkę pokrytą żelatyną, dodając jeden mililitr 0,1% żelatyny do dołka płytki sześciodołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 90 minut. Aby zebrać komórki, usuń pożywkę i umyj komórki jednym milimetrem PBS.

Dodaj 500 mikrolitrów roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka na płytce z sześcioma dołkami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby śledzić dysocjację kolonii na pojedyncze komórki. Rozcieńczyć roztwór oddzielający komórki jednym mililitrem buforu do przemywania wody.

Pobrać komórki z płytki, delikatnie pipetując od pięciu do dziesięciu razy. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Obracaj ogniwa z prędkością 200 RCF przez cztery minuty.

Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 1,5 mililitra pożywki PXGL w każdym dołku. Wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną w celu wykluczenia MEF i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 do 90 minut. Gdy naiwne komórki zostaną wysiane w celu wykluczenia MEF, usuń PBS z MicroWells i zrównoważ studzienki z 200 mikrolitrami podstawowego podłoża N2B27 dla każdego chipa MicroWell i inkubuj przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zebrać supernatant zawierający nieprzyłączone komórki naiwne. Przenieś go do 15-mililitrowej probówki i wiruj komórki w temperaturze 200 RCF przez cztery minuty. Wyrzuć pożywkę i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze podłoża podstawowego N2B27.

Policz komórki za pomocą slajdów do liczenia komórek. Obracaj ogniwa z prędkością 200 RCF przez cztery minuty. Odrzucić pożywkę i dodać odpowiednią ilość pożywki N2B27 zawierającej 10 mikromolowych Y27632, aby uzyskać gęstość komórek 30 000 komórek na 50 mikrolitrów.

Usuń pożywkę ze zrównoważonych matryc MicroWell i dodaj 25 mikrolitrów pożywki N2B27 z 10 mikromolowymi Y27632. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby komórki mogły wpaść na dno MicroWell. Następnie dodaj 125 mikrolitrów pożywki N2B27, uzupełnionej 10 mikromolami Y27632.

W ciągu 24 godzin na chipie MicroWell będą obserwowane agregaty naiwnych hPSC. Zainicjuj tworzenie się blastoidu, przygotowując pożywkę PALY. Podgrzej go w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Usuń pożywkę agregacyjną i dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki PALY do MicroWells. Umieść płytkę do hodowli komórkowej z powrotem w inkubatorze do hipoksyi w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórz zmianę nośnika pierwszego dnia.

Drugiego dnia usuń pożywkę PALY i dodaj 200 mikrolitrów pożywki N2B27, uzupełnionej LPA i 10 mikromolowym Y27632. Powtórz zmianę nośnika trzeciego dnia. Całkowite powstanie blastoidu następuje w czwartym dniu.

Przygotuj wcześniejszą zawiesinę komórek hPSC do tworzenia blastoidu, jak opisano wcześniej. Odrzucić pożywkę i dodać odpowiednią ilość pożywki N2B27 zawierającej 10 mikromolowych Y27632, aby uzyskać gęstość komórek 70 komórek na 100 mikrolitrów pożywki. Aby zgrupować komórki na dnie studzienek, odwiruj płytkę w temperaturze 200 RCF przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach hodowli niedotlenionej. W ciągu 24 godzin na odwiertach zostaną zaobserwowane agregaty naiwnych hPSC. Do studzienek dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej i podgrzanej dwukrotnie pożywki PALY.

Umieść płytkę do hodowli komórkowej z powrotem w inkubatorze do hipoksyi w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach wyrzuć połowę pożywki i zastąp ją 100 mikrolitrami podgrzanego podłoża PAL. Powtarzaj ten krok do czwartego dnia.

Przygotuj naiwną zawiesinę komórek HPSC do tworzenia troposfery, jak opisano wcześniej. Gdy po 24 godzinach utworzą się agregaty naiwnych HPSC, należy wymienić pożywkę agregacyjną na PALY bez LIF, uzupełnioną trzema mikromolowymi SC144 w celu utworzenia trofosfer reprezentujących wczesną trofektodermę. Aby utworzyć trofosfery reprezentujące dojrzałą trofektodermę, należy wymienić pożywkę agregacyjną na PALY, uzupełnioną dwoma mikromolowymi XMUMP1.

Odświeżaj podłoże codziennie. Całkowite uformowanie trofosfery następuje w czwartym dniu. Aby ocenić stan komórek, należy porównać dane transkryptomiczne z blastoidów i trofosfer z odpowiednimi kontrolami, w tym z ludzkimi komórkami macierzystymi trofoblastu podobnymi do implantacji.

Naiwne hPSC hodowane w PXGL były zagregowanymi i kawitacyjnymi strukturami, które pojawiły się między 48 a 72 godzinami po indukcji PALY i osiągnęły średnicę od 150 do 250 mikrometrów w ciągu 96 godzin. Opierając się na parametrach morfometrycznych i obecności trzech linii, wydajność indukcji osiągnęła 70 do 80%, Trofosfery zostały uformowane z wydajnością od 50 do 60% w ciągu 96 godzin od indukcji. Powstawanie blastoidów zakończyło się sukcesem w przypadku dostępnych na rynku 96-dołkowych płytek o bardzo niskim stopniu przylegania w zoptymalizowanych warunkach indukcji.

Do dokładniejszego scharakteryzowania stanu komórek blastoidalnych wykorzystano technologię sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Komórki wykazują wyraźnie powtarzalne profile grupowania, niezależnie od parametrów użytych do przeprowadzenia grupowania i wizualizacji danych, co pozwoliło na pewne rozróżnienie trzech linii blastocyst. W okresie od 24 do 60 godzin pluripotencjalne komórki macierzyste PXGL tworzą analogi epiblastu i trofektodermy.

Następnie między 60 a 96 godzinami powstają analogi polarnej trofektodermy i pierwotnej endodermy. Jest to sekwencja specyfikacji w obrębie blastocysty, dlatego blastoidy podsumowują sekwencję rozwojową specyfikacji linii. Połączenie zbiorów danych blastoidów z referencyjnym zbiorem danych komórek wyizolowanych z zarodków na różnych etapach rozwoju wykazało, że 97% komórek blastoidów grupowało się z komórkami blastocysty, ale nie z komórkami z zarodków po implantacji.

Niezależna analiza potwierdziła, że z biegiem czasu komórki macierzyste utworzyły komórki, które transkrypcyjnie pasowały do komórek ludzkich embrionów między piątym a 7,5 dniem. Jest to rzeczywiście etap rozwojowy, podczas którego tworzy się ludzka blastocysta. Potwierdzili również, że ponad 95% komórek w blastoidach ma transkryptom, który pasuje do trzech linii komórkowych blastocyst, podczas gdy 3% komórek było niewłaściwych i dopasowanych do etapów po implantacji.

Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy, że nasze początkowe hodowle 2D zawierają również około 5% komórek poza celem. Równoważny etap rozwoju można również zwizualizować, przyglądając się wzorcom ekspresji określonych markerów, takich jak CDX2 dla trofektodermy blastocysty i PRMD14 dla epiblastu blastocysty. Jakość początkowej hodowli PXGL jest absolutnie kluczowa, a liczba komórek w początkowym agregatie jest również krytyczna i może być kontrolowana za pomocą MicroWells.

Całkowity rozmiar agregatu komórkowego po 24 godzinach powinien wynosić około 50 do 70 mikrometrów. Sprawne tworzenie blastoidów fazowych w pełni toruje drogę do badania procesów implantacji i rozwoju poimplantacyjnego zarodka ludzkiego.