Ocena przypuszczalnych właściwości antykryptokokowych surowych i klarowanych ekstraktów z

Protokół ten pozwala na izolację związków z o właściwościach antykryptokokowych. Technika ta oferuje bezstronne podejście do identyfikacji i izolowania związków z o potencjalnych właściwościach, w tym zabijaniu ludzkich patogenów grzybowych. Istnieją inne związki, takie jak inhibitory proteazy HIV, stosowane w leczeniu pacjentów z HIV.

Jednak ekspansja na inne patogeny, a także badanie źródeł naturalnych, wyznacza nowe drogi odkryć. Ostatni krok jest najtrudniejszym krokiem, ponieważ próbki mogą nie zostać przefiltrowane. W rezultacie może być konieczne rozcieńczenie próbek w celu przefiltrowania.

Zacznij od zebrania, takich jak Cipangopaludina chinensis, z wyznaczonego i zatwierdzonego obszaru naturalnego. Wybierz gatunki rodzime i inwazyjne, aby ocenić szeroki zakres potencjalnych skutków przeciwgrzybiczych. Delikatnie rozbij skorupę C.chinensis za pomocą tłuczka i moździerza i usuń stałe kawałki pęsetą.

Ogólnie rzecz biorąc, w ramach protokołu łączy się 10. Zbierz i zważ około 15 do 20 gramów próbki i użyj nożyczek, aby pociąć narządy na małe kawałki o wielkości około 0,5 do jednego centymetra. Błyskawiczne zamrożenie wypreparowanych i pociętych próbek narządów za pomocą ciekłego azotu przed zmieleniem próbek narządów na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.

Po zakończeniu dodaj około 15 gramów proszku próbki narządu do 30 mililitrów zimnej wody destylowanej, aby uzyskać stosunek jeden do dwóch. Wlej dwa mililitry próbki do dwumililitrowych probówek o dużej intensywności i dodaj około 500 mikrogramów trzymilimetrowych koralików ze stali nierdzewnej do każdej probówki. Homogenizować przez trzy minuty przy 1 200 obr./min w czterech stopniach Celsjusza za pomocą blendera kulowego lub ubijaka do kulek.

Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów i wyrzucić osad. Przefiltrować, wysterylizować supernatant za pomocą membrany o wielkości 0,22 mikrometra i przechowywać próbki na lodzie przed sklarowaniem ekstraktu.

Umieścić próbkę sklarowanego osadu w łaźni termalnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 30 minut i natychmiast ją schłodzić, przenosząc próbkę do wiadra wypełnionego lodem na 20 minut. Odwirować zimne próbki w temperaturze 15 000 G przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów i wyrzucić osad.

Filtr Wysterylizuj próbki za pomocą filtra membranowego o średnicy 0,22 mikrona, a następnie przechowuj je na lodzie. Po zakończeniu należy oznaczyć stężenie białka w surowym i sklarowanym ekstrakcie za pomocą testu ilościowego. Optymalny zakres stężenia białka wynosi od czterech do ośmiu mikrogramów na mililitr.

Próbki należy inkubować na lodzie przez maksymalnie jedną godzinę lub błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne. W 96-dołkowej płaskiej płytce dennej inkubować 10 mikrolitrów po cztery miligramy na mililitr surowego lub klarowanego ekstraktu białkowego, 10 mikrolitrów subtylizyny A o stężeniu w zmierzonym zakresie liniowym i 220 mikrolitrów 100-milimolowego chlorowodorku trisu o pH 8,6 przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie dodać 10 mikrolitrów N-sukcynyloalaniny, alaniny, proliny, fenolalaniny, p-nitroaniliny, substratu subtylizyny A, o końcowym stężeniu jednego KM, aby uzyskać końcową objętość reakcji 250 mikrolitrów.

Po zakończeniu zmierz aktywność enzymatyczną, monitorując gęstość optyczną przy 405 nanometrach co 15 sekund przez trzy minuty. Upewnij się, że studzienki bez ekstraktów wytwarzają prostą krzywą podczas odczytu. Aby określić resztkową aktywność enzymatyczną, należy obliczyć stosunek aktywności enzymatycznej w obecności ekstraktu z do aktywności w przypadku braku ekstraktu.

W przypadku zaobserwowania aktywności hamującej należy zmierzyć stężenie hamujące 50 lub wartość IC50 przy użyciu zakresu stężeń ekstraktów. Wprowadzić pojedynczą kolonię C.neoformans H99 typu dzikiego do pięciu mililitrów ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej lub pożywki YEPD za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów i inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Zbierz 500 mikrolitrów kultury w kuwecie i zmierz wzrost, odczytując gęstość optyczną przy 600 nanometrach.

Rozcieńczyć kulturę drożdżową bazą azotową lub pożywką YNB do końcowej gęstości optycznej 0,02. Wspólna hodowla komórek C. neoformans o różnych stężeniach surowych i klarowanych ekstraktów poprzez zmieszanie 10 mikrolitrów ekstraktów ze 190 mikrolitrami rozcieńczonej kultury C. neoformans na 96-dołkowej płytce. Zmierz wzrost, odczytując gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika płytek co 15 minut do jednej godziny przez 72 godziny przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza.

Ekstrakty C.chinensis były w stanie hamować aktywność proteolityczną subtylizyny A, która jest związana z wirulencją u Cryptococcus neoformans o wartości IC50 wynoszącej 5,3 mikrograma na mililitr w ekstraktach surowych i 4,53 mikrograma na mililitr w ekstraktach klarowanych. Ocena ekstraktów z C.chinensis pod kątem procesów związanych z wytwarzaniem czynnika wirulencji C.Neoformans, w tym wzrostu grzybów, wykazała, że nastąpiło znaczne zmniejszenie wzrostu grzybów w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności surowych i oczyszczonych ekstraktów z C. chinensis. Ocena ekstraktów pod kątem kapsułki, produkcji melaniny i tworzenia biofilmów wykazała, że nie było żadnych zmian w produkcji torebki lub melaniny w obecności surowych lub oczyszczonych ekstraktów z C. chinensis.

Zaobserwowano jednak znaczne zmniejszenie tworzenia biofilmu o 70 do 80% przy wysokich stężeniach ekstraktów surowych i klarowanych w porównaniu z kontrolą niepoddawaną działaniu środka. Powodzenie protokołu zależy od właściwej procedury ekstrakcji, w tym mielenia, dodania odpowiedniej ilości enzymu i samego odczytu po dodaniu substratu. Technika ta koncentruje się na tolerancji termicznej jako ważnym czynniku wirulencji kryptokokowej.

Można jednak ocenić inne czynniki wirulencji, takie jak produkcja melaniny i kapsułek, a także tworzenie biofilmu. Wyniki te otwierają nowe ścieżki, które stanowią nowe podejścia do strategii przeciwgrzybiczych z wykorzystaniem naturalnych związków, które oferują większą stabilność, specyficzność i są mniej podatne na oporność. Długoterminowym celem jest znalezienie nowych metod walki z tymi patogenami grzybowymi i zminimalizowanie mechanizmów oporności.