Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect
19 marca 2019
Prezentujemy użycie protokołu MeshAndCollect do uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, do wykorzystania w późniejszym określaniu struktury, składającego się z częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych zebranych z wielu małych kryształów fluorescencyjnego białka Cerulean.
Zautomatyzowany protokół MeshAndCollect został opracowany w celu połączenia krystalografii szeregowej ze standardowym gromadzeniem danych o rotacji w celu pomiaru małych kryształów z próbek krążków. Metoda najpierw identyfikuje położenie kryształów zamontowanych na tym samym uchwycie próbki, aby następnie skierować zbieranie częściowego zestawu danych, który zostanie następnie połączony i wykorzystany do rozwiązania struktury. MeshAndCollect jest przekonujący, ponieważ pozwala na szybkie przeprowadzanie eksperymentów przy użyciu tej samej konfiguracji, roztworu struktury, badań przesiewowych ligandów, a wszystko to z małymi kryształami.
Metoda jest kompatybilna z VMX linii synchrotronowej, idealnie wyposażonej w wysoką elastyczność fotonów, małą średnicę wiązki i detektor szybkiego przeładowania. W pierwszej kolejności należy połączyć się z rozszerzoną bazą danych systemu informatycznego krystalografii białek i wybrać MX.Zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła z formularza A. Następnie wybierz opcję Dodaj nową przesyłkę i wprowadź wymagane informacje.
Wybierz opcję Dodaj częściową i wypełnij odpowiednie dane. Wybierz opcję Dodaj kontener, wybierz krążek SC3 i wypełnij wymagane informacje, w tym pozycje posiadaczy próbek w krążku. W klatce doświadczalnej załaduj krążek do zmieniarki próbek i zanotuj jego położenie.
Następnie zaloguj się do systemu informatycznego dla bazy danych linii krystalografii białek. Wybierz opcję Przygotuj eksperyment, znajdź przesyłkę, wybierz pozycję Dalej, a następnie wskaż linię badawczą i pozycję krążka w zmieniaczu próbek. Zaloguj się do oprogramowania sterującego linią za pomocą numeru eksperymentu i hasła podanych na formularzu A.
Naciśnij przycisk Sync, aby zsynchronizować oprogramowanie sterujące linią badawczą z systemem informacyjnym bazy danych linii krystalografii białek. Za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą zamontuj uchwyt próbki na goniometrze. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję w obszarze zmieniacza próbek i wybierz opcję Zamontuj próbkę.
Wybierz środkowy przycisk, a następnie trzy kliknięcia wyśrodkuj środek na środku krawędzi końcówki pętli. Zapisz pozycję wyśrodkowaną, wybierając opcję Zapisz. W obszarze Zaawansowane dodaj przepływ pracy Reorientacja wizualna do kolejki zbierania danych.
Następnie uruchom przepływ pracy, klikając Collect Queue. Następnie wybierz jedną z zapisanych pozycji środkowych, klikając na nią. Kliknij ponownie środkowy przycisk, a następnie trzykrotne kliknięcie środka na środku początku trzonu pętli.
Zapisz drugą pozycję, klikając Zapisz. A następnie kliknij Kontynuuj. Po tym, jak przepływ pracy wyrówna płaszczyznę uchwytu próbki z osią obrotu goniometru, ponownie wyśrodkuj uchwyt próbki gdzieś w środku siatki.
Ustawić uchwyt próbki tak, aby powierzchnia siatki była prostopadła do kierunku wiązki promieniowania rentgenowskiego, obracając oś omega za pomocą oprogramowania sterującego linią promieniowania. W oprogramowaniu sterującym linią badawczą należy kliknąć w menu rozwijane Przysłona i wybrać wartość. Następnie kliknij ikonę narzędzia siatki, aby wyświetlić okno narzędzia siatki.
W widoku próbki w oprogramowaniu sterującym linią badawczą narysuj siatkę klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając myszką nad obszarem zawierającym kryształy na uchwycie próbki. Aby zapisać siatkę, kliknij przycisk plusa w oknie narzędzia siatki. W polu rozdzielczości oprogramowania sterującego linią należy wpisać rozdzielczość, w jakiej mają być zbierane obrazy dyfrakcyjne.
Jeśli nie są znane żadne wcześniejsze informacje na temat jakości dyfrakcyjnej kryształów, zalecana jest wartość od dwóch do 2,5. Wybierz pozycję MeshAndCollect na karcie Zaawansowane zbieranie danych. Dodaj go do kolejki i kliknij przycisk Zbierz kolejkę.
W oknie parametrów należy użyć domyślnych parametrów zależnych od linii badawczej. W opisanym tutaj eksperymencie domyślne parametry to czas ekspozycji 0,037 sekundy na punkt skanowania siatki, 100% transmisja i oscylacja jednego stopnia na linię skanowania siatki. Kliknij Dalej.
Skanowanie siatki przebiega, a obrazy dyfrakcyjne zebrane w każdym punkcie siatki są analizowane i klasyfikowane według siły dyfrakcji za pomocą oprogramowania Dopycharka. Po analizie spycharki generowana jest mapa cieplna, a kolejność kolejnych częściowych zbiorów danych jest przypisywana automatycznie na podstawie siły dyfrakcji. Na koniec kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić częściowe zbieranie danych.
MeshAndCollect zaimplementowany w MXCuBE został wykorzystany do zbierania częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych z małych kryształów Cerulean znajdujących się na tym samym uchwycie próbki, w którym identyfikacja wizualna kryształów była trudna. Aby przesiać uchwyt próbki, narysowano siatkę nad środkiem pętli siatki i na podstawie mapy cieplnej punktacji spycharki automatycznie zebrano 85 zestawów danych dyfrakcji częściowej. Zostały one indywidualnie zintegrowane, a następnie połączone w celu uzyskania zestawu danych o kompletności 99,8% przy rozdzielczości 1,7 angstremów.
Zgodnie z oczekiwaniami, struktura krystaliczna Cerulean może zostać rozwiązana przez zastąpienie molekularne przy użyciu wygenerowanego zestawu danych. Po udoskonaleniu uzyskano pracę R na poziomie 22,8% i wolną od R na poziomie 25,4%. Super pozycja wcześniej wyznaczonej struktury pokazuje globalny RMSD na pozycjach c-alfa wynoszący 0,1 angstrema.
Dla projektów, w których następuje optymalizacja fazy wzrostu kryształów, MeshAndCollect zapewnia możliwość uzyskania kompletnego zestawu danych w oparciu o kombinację tych amorficznych częściowych zestawów danych uzyskanych z mniejszych kryształów. Technika ta utorowała drogę biologom strukturalnym do rozwiązania struktury z próbki części, z której nie można było wytworzyć tylko kilku dziesiątych mikrokryształów.
Przegląd
Protokół MeshAndCollect umożliwia zbieranie kompletnych zestawów danych dyfrakcyjnych z małych kryształów, specyficznie dla białka fluorescencyjnego Cerulean. Ta metoda integruje krystalografię seryjną ze standardowym zbieraniem danych rotacyjnych, ułatwiając szybkie eksperymenty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Krystalografia
- Analiza białek
Tło
- MeshAndCollect łączy dane z wielu małych kryształów.
- Jest zaprojektowany do użycia z wiązkami światła synchrotronowego.
- Protokół poprawia efektywność wyznaczania struktury.
- Rozwiązuje wyzwania w wizualnej identyfikacji małych kryształów.
Cel badania
- Opracowanie metody uzyskiwania kompletnych zestawów danych dyfrakcyjnych.
- Ułatwienie wyznaczania struktury z małych kryształów.
- Poprawa szybkości i efektywności eksperymentów.
Stosowane metody
- Automatyczne zbieranie częściowych zestawów danych z małych kryształów.
- Integracja danych za pomocą oprogramowania Dozer do analizy.
- Użycie narzędzia do optymalizacji pozycjonowania próbki.
- Zastosowanie domyślnych parametrów do zbierania danych.
Główne wyniki
- Zebrano 85 częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych o kompletności 99,8%.
- Osiągnięta rozdzielczość wyniosła 1,7 angströmów.
- Udało się rozwiązać strukturę krystaliczną Cerulean.
- Rafinancja dała R work na poziomie 22,8% i R free na poziomie 25,4%.
Wnioski
- MeshAndCollect umożliwia efektywne zbieranie danych z małych kryształów.
- Ta technika wspiera biologów strukturalnych w rozwiązywaniu złożonych struktur.
- Dostarcza rozwiązania dla projektów z ograniczoną krystalizacją.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
