Name: Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj jednoetapową metodę oczyszczania kompleksów RNA/białkowych z wykorzystaniem biotyny i fotolabilnego łącznika. Technika ta zachowuje natywną funkcjonalność kompleksów i umożliwia ich analizę spektrometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym kolegom i współpracownikom za ich wkład w naszą pracę. Badanie to było wspierane przez grant NIH GM 29832.

1. Przygotowanie podłoża
UWAGA: Substraty RNA krótsze niż ~65 nukleotydów mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną (B) i łącznikiem fotorozszczepialnym (pc) (razem określanym jako biotyna fotorozszczepialna lub pcB) kowalencyjnie przyłączonym do końca RNA 5' (konfiguracja cis). Substraty RNA zawierające znacznie dłuższe miejsca wiązania muszą być generowane in vitro przez transkrypcję T7 (lub SP6), a następnie wyżarzane do krótkiego komplementarnego oligonukleotydu adaptorowego zawierającego ugrupowanie pcB na końcu 5' (konfiguracja trans) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>W przypadku miejsc wiązania składających się z mniej niż ~ 65 nukleotydów, użyj komercyjnego producenta (tabela materiałów) do chemicznej syntezy interesującego RNA z pcB kowalencyjnie przyłączonym do końca RNA 5' (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A i <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Rozpuścić w sterylnej wodzie do osiągnięcia pożądanego stężenia i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W przypadku miejsc wiązania znacznie dłuższych niż ~ 65 nukleotydów, utwórz częściowy dupleks interesującego nas RNA wygenerowanego in vitro i komplementarnego oligonukleotydu adaptorowego zawierającego ugrupowanie pcB na końcu 5' (<silna klasa = "xfig" >Figura 3A).
	<ol>
		<li>Wykonaj transkrypcję T7 na zlinearyzowanym plazmidowym DNA lub odpowiedniej matrycy PCR, aby wygenerować RNA z miejscem wiązania będącym przedmiotem zainteresowania przedłużonym na końcu 3' przez dowolną sekwencję ~ 20-nukleotydową.</li>
		<li>Użyj komercyjnego producenta (Tabela materiałów) do chemicznej syntezy oligonukleotydu adaptorowego, który jest komplementarny do rozszerzenia 3' w RNA generowanym przez T7 i zawiera pcB na końcu 5' (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). 
		UWAGA: Dwa 18-atomowe przekładki i 2-3 niekomplementarne nukleotydy można umieścić na końcu 5' oligonukleotydu, aby zmniejszyć potencjalną przeszkodę steryczną między związanym kompleksem a kulkami streptawidyny. Pożądane jest również, aby oligonukleotyd był równomiernie modyfikowany grupą 2'O-metylową w celu zwiększenia wytrzymałości dupleksu i zapewnienia odporności na różne nukleazy.</li>
		<li>Wyżarzanie RNA generowanego przez T7 do oligonukleotydu adaptora pcB.
		<ol>
			<li>Zmieszać 20 pmol RNA i 100 pmol oligonukleotydu adaptora pcB (stosunek molowy 1:5) w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl buforu wiążącego o następującym składzie: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glicerolu, 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). 
			UWAGA: Ważne jest, aby użyć minimalnej ilości oligonukleotydu adaptorowego, która jest wystarczająca do utworzenia dupleksu z większością (jeśli nie wszystkim) substratu pre-mRNA używanego w reakcji wyżarzania. Można to wygodnie określić, znakując substrat RNA na końcu 5' za pomocą 32P, wyżarzając znakowany substrat zwiększającymi się ilościami oligonukleotydu adaptorowego przy użyciu różnych warunków buforowych i monitorując zatrzymywanie sygnału radioaktywnego na kulkach streptawidyny po kilku płukaniach kulek buforem wiążącym.</li>
			<li>Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut.</li>
			<li>Poczekaj, aż woda ostygnie do temperatury pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Złożony montaż
<ol>
	<li>Uzupełnij 1 ml mysiego ekstraktu jądrowego (lub innego ekstraktu z wyboru) 80 mM EDTA pH 8 do końcowego stężenia 10 mM w celu zablokowania niespecyficznych nukleaz zależnych od metalu, które są obecne w ekstrakcie. 
	UWAGA: Spowoduje to dostosowanie buforu w ekstrakcie do tego samego składu, co bufor wiążący (patrz Krok 1.2.3.1). EDTA nie wpływa na przetwarzanie in vitro histonów pre-mRNA, ale może być szkodliwy w oczyszczaniu białek lub kompleksów białkowych, które gromadzą się w sposób zależny od magnezu. W takich przypadkach należy unikać EDTA.</li>
	<li>Dodać 5-10 pmol substratu RNA oznaczonego ugrupowaniem pcB w cis (patrz krok 1.1) lub trans (patrz krok 1.2.3.3) do 1 ml ekstraktu zawierającego 10 mM EDTA. 
	UWAGA: Ilość RNA musi być dokładnie oceniona w serii eksperymentów próbnych. Użycie zbyt dużej ilości substratu RNA do oczyszczenia kompleksu ograniczającego może przynieść efekt przeciwny do zamierzonego, znacznie zwiększając tło niespecyficznych białek wiążących RNA bez żadnego wpływu na wydajność określonych białek.</li>
	<li>Inkubować substrat RNA z ekstraktem przez 5 minut na lodzie, od czasu do czasu mieszając próbkę. 
	UWAGA: Zarówno czas, jak i temperatura inkubacji muszą być ustalone empirycznie i mogą się znacznie różnić, w zależności od specyficznego charakteru kompleksu RNA/białko.</li>
	<li>Mieszaninę inkubacyjną należy obracać we wstępnie schłodzonej mikrowirówce przez 10 minut przy sile 10 000 x g, aby usunąć wszelkie potencjalne osady i ostrożnie zebrać supernatant, unikając przenoszenia osadu.</li>
</ol>
3. Immobilizacja kompleksów RNA/białko na kulkach streptawidyny.
<ol>
	<li>Przenieś ~100 μl zawiesiny perełkek agarozy streptawidyny od komercyjnego dostawcy (tabela materiałów) do probówki o pojemności 1,5 ml i zwiększ objętość za pomocą buforu wiążącego (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glicerol, 10 mM EDTA). 
	UWAGA: Ten bufor powinien mieć taki sam skład, jak w mieszaninie do wyżarzania i w ekstrakcie używanym do złożonego montażu (krok 2.1).</li>
	<li>Zebrać kulki na dnie probówki, obracając przez 2-3 minuty przy 25 x g i odessać supernatant.</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę mycia/wirowania 2-3 razy, aby zrównoważyć kulki z buforem wiążącym. 
	UWAGA: Na końcu tego kroku granulka kulek powinna mieć objętość ~ 30 μL.</li>
	<li>Załadować supernatant zawierający złożony kompleks (krok 2.4) na zrównoważone kulki agarozy streptawidyny.</li>
	<li>Obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby unieruchomić RNA i związane kompleksy na kulkach.</li>
	<li>Zbierz koraliki na dnie tuby, obracając przez 2-3 minuty przy 25 x g. 
	UWAGA: Użyj odchylanego wirnika, aby uniknąć znacznej utraty koralików, jeśli mają one tendencję do przylegania do boku rury w wirnikach kątowych.</li>
	<li>Odessać supernatant i dwukrotnie przepłukać kulki 1 ml buforu wiążącego, stosując te same warunki wirowania.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu wiążącego i obracać próbkę przez 1 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ten krok można skrócić, jeśli kompleks utworzony na podłożu ma tendencję do dysocjacji.</li>
	<li>Wirować kulki przez 2-3 minuty przy 25 x g, dodać 1 ml buforu i przenieść zawiesinę do nowej probówki.</li>
	<li>Obracaj przez dodatkową 1 godzinę lub krócej, jeśli kompleks nie jest stabilny, wirować przez 2-3 minuty przy 25 x g i przenieś kulki do probówki o pojemności 500 μl w 200 μl buforu wiążącego.</li>
</ol>
4. Lucja UV.
<ol>
	<li>Włącz lampę UV o wysokiej intensywności emitującą światło UV 365 nm przez 5-10 minut, zanim osiągniesz pełną jasność. 
	UWAGA: Jest to niezbędne do osiągnięcia maksymalnej energii emisji UV na początku napromieniowania.</li>
	<li>Napełnij dno szalki Petriego (100 mm x 15 mm) szczelnie zapakowanym lodem i ułóż go na pokrywie naczynia.</li>
	<li>Krótko zawirować probówkę zawierającą unieruchomiony kompleks, umieścić ją poziomo na lodzie i przykryć wstępnie ogrzaną lampą, upewniając się, że próbka znajduje się w odległości 2-3 cm od powierzchni bańki. 
	UWAGA: Jeśli odległość jest zbyt duża, użyj dodatkowych szalek Petriego lub innych odpowiednich przedmiotów, aby zbliżyć próbkę do bańki.</li>
	<li>Naświetlać łącznie przez 30 minut, często odwracając i wirując rurkę, aby zapewnić równomierną ekspozycję zawiesiny na promieniowanie UV i zapobiec przegrzaniu. 
	UWAGA: Aby zapewnić dodatkowe chłodzenie, etap elucji UV można przeprowadzić w zimnym pomieszczeniu. Przełącz się na szalkę Petriego ze świeżym lodem w przypadku nadmiernego topnienia lodu.</li>
	<li>Wirować kulki przez 2-3 minuty przy 25 x g i zebrać supernatant.</li>
	<li>Ponownie odwiruj supernatant w tych samych warunkach i zbierz supernatant. 
	UWAGA: Pozostaw niewielką ilość supernatantu na dnie, aby uniknąć przenoszenia resztek kulek.</li>
</ol>
5. Analiza próbki za pomocą barwienia srebrem, a następnie spektrometria mas.
<ol>
	<li>Użyć elektroforezy w żelu SDS/poliakrylamidowym, aby oddzielić frakcję supernatantu eluowanego promieniami UV i tę samą frakcję materiału pozostałą na kulkach po elucji UV. 
	UWAGA: Analiza może również obejmować podwielokrotność kulek pobranych z próbki przed elucjącją.</li>
	<li>Wybarwić żel zawierający oddzielone białka za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra.</li>
	<li>Ocenić skuteczność elucji UV, porównując intensywność białek obecnych w supernatancie wymywanym promieniami UV i tych pozostawionych na kulkach po naświetlaniu promieniowaniem UV.</li>
	<li>Wytnij interesujące nas pasma białkowe i określ ich tożsamość za pomocą spektrometrii mas przy użyciu standardowych protokołów10,15.</li>
</ol>
6. Globalna analiza próbki wymytej promieniami UV za pomocą spektrometrii mas.
<ol>
	<li>Bezpośrednio przeanalizuj frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV za pomocą spektrometrii mas, aby określić cały proteom oczyszczonego materiału w sposób bezstronny. 
	UWAGA: Można to zrobić poprzez traktowanie oczyszczonych próbek trypsyną w roztworze, a następnie standardowe protokoły spektrometrii mas w celu określenia tożsamości generowanych peptydów10,15.</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
<li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases%3A+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li>
<li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+3%27+end+of+histone+mRNA%3A+getting+closer+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li>
<li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+%27-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li>
<li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+%27-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila%3A+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li>
<li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li>
<li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2%27-+O-methyl+oligoribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li>
<li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs%3A+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component%2C+Lsm11%2C+in+histone+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li>
<li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10%2C+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li>
<li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+%27-End+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li>
<li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide%3A+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5%27-end-labeling%2C+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li>
<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li>
<li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li>
<li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3+%27+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+%27+end+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li>
<li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3%27hExo%2C+a+3%27+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3%27+end+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li>
<li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+histone+mRNA+stem-loop%2C+human+stem-loop+binding+protein%2C+and+3%27hExo+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li>
<li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li>
<li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs%3A+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li>
<li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+%27+end+processing+of+histone+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Rna-a+Publication+of+the+Rna+Society%22%5BJournal%5D)">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li>
<li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li>
<li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eri1%3A+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li>
<li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3%27+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opisana tutaj metoda jest prosta i oprócz tego, że zawiera łącznik z możliwością fotorozszczepienia i etap elucji UV, nie różni się od powszechnie stosowanych metod, które wykorzystują niezwykle silne oddziaływanie między biotyną a streptawidyną. Etap elucji UV jest bardzo wydajny, zwykle uwalniając ponad 75% unieruchomionego RNA i powiązanych białek z kulek streptawidyny, pozostawiając wysokie tło białek, które niespecyficznie wiążą się z kulkami. Eliminując to tło, etap elucji UV pozwala uzyskać niezwykle czyste próbki...

U eukariontów, prekursory mRNA generowane przez polimerazę II (pre-mRNA) przechodzą kilka zdarzeń dojrzewania w jądrze, zanim staną się w pełni funkcjonalnymi matrycami mRNA do syntezy białek w cytoplazmie. Jednym z takich zdarzeń jest przetwarzanie 3' end. W przypadku zdecydowanej większości pre-mRNA przetwarzanie końca 3' obejmuje rozszczepienie sprzężone z poliadenylacją. Ta dwuetapowa reakcja jest katalizowana przez stosunkowo obfity kompleks składający się z ponad 15 białek1. Zależne od replikacji zwierzęcej histonowe pre-mRNA są przetwarzane na końcu 3' przez inny mechanizm, w którym kluczową rolę odgrywa U7 snRNP, kompleks o niskiej liczebności składający się z U7 snRNA ~60 nukleotydów i wielu białek2,3. Para zasad snRNA U7 ze specyficzną sekwencją w histonowym pre-mRNA, a jedna z podjednostek snRNP U7 katalizuje reakcję rozszczepienia, generując dojrzałe mRNA histonu bez ogona poli(A). Przetwarzanie 3' końca histonu pre-mRNA wymaga również białka wiążącego pętlę macierzystą (SLBP), które wiąże konserwatywną pętlę macierzystą znajdującą się przed miejscem cięcia i zwiększa rekrutację U7 snRNP do substratu2,3. Badania mające na celu identyfikację poszczególnych składników U7 snRNP były trudne ze względu na niskie stężenie U7 snRNP w komórkach zwierzęcych oraz skłonność kompleksu do dysocjacji lub częściowej proteolizy podczas oczyszczania w wyniku stosowania łagodnych detergentów4,5,6, płukanie o wysokiej zawartości soli i/lub wiele etapów chromatograficznych7, 8,9.
Niedawno, aby określić skład zależnej od U7 maszynerii przetwarzającej, krótki fragment histonowego pre-mRNA zawierającego biotynę na 3' lub 5' został inkubowany z ekstraktem jądrowym, a złożone kompleksy zostały wychwycone na pokrytych streptawidyną kulkach agarozy5,6,10. Ze względu na wyjątkowo silne oddziaływanie między biotyną a streptawidyną, białka unieruchomione na kulkach streptawidyny eluowano w warunkach denaturacji przez gotowanie w SDS i analizowano za pomocą barwienia srebrem i spektrometrii mas. Chociaż to proste podejście zidentyfikowało szereg składników snRNP U7, dało stosunkowo prymitywne próbki, często zanieczyszczone dużą liczbą białek tła niespecyficznie związanych z kulkami streptawidyny, potencjalnie maskując niektóre elementy maszynerii przetwórczej i uniemożliwiając ich wykrycie na żelach barwionych srebrem5,6,10. Co ważne, takie podejście wykluczyło również jakiekolwiek badania funkcjonalne z wyizolowanym materiałem i jego dalsze oczyszczanie do jednorodności za pomocą dodatkowych metod.
Z biegiem czasu zaproponowano szereg modyfikacji, aby rozwiązać problem praktycznie nieodwracalnej natury interakcji biotyna/streptawidyna, przy czym większość z nich miała na celu albo osłabienie interakcji, albo zapewnienie chemicznie rozszczepialnego ramienia dystansowego w odczynnikach zawierających biotynę11,12. Wadą wszystkich tych modyfikacji było to, że znacznie zmniejszały one skuteczność metody i/lub często wymagały warunków niefizjologicznych na etapie elucji, zagrażając integralności lub aktywności oczyszczonych białek.
Tutaj opisujemy inne podejście do rozwiązania nieodłącznego problemu strategii biotyna/streptawidyna za pomocą substratów RNA, w których biotyna jest kowalencyjnie przyłączona do końca 5' za pomocą fotorozszczepialnej grupy 1-(2-nitrofenylo)etylu, która jest wrażliwa na długie fale UV13,14. Przetestowaliśmy to podejście do oczyszczania ograniczającej zależnej od U7 maszynerii przetwarzania z ekstraktów jądrowych Drosophila i ssaków15. Po krótkiej inkubacji histonów pre-mRNA zawierających biotynę i fotorozszczepialnego łącznika z ekstraktem jądrowym, złożone kompleksy przetwórcze są unieruchamiane na kulkach streptawidyny, dokładnie myte i delikatnie uwalniane do roztworu w postaci natywnej przez ekspozycję na światło UV ~360 nm. Metoda elucji UV jest bardzo wydajna, szybka i prosta, dając wystarczające ilości snRNP U7 do wizualizacji jego składników poprzez barwienie srebrne już od 100 μl ekstraktu15. Materiał eluowany promieniami UV jest wolny od białek tła i nadaje się do bezpośredniej analizy spektrometrii mas, dodatkowych etapów oczyszczania i testów enzymatycznych. Ta sama metoda może być przyjęta do oczyszczania innych kompleksów RNA/białko, które wymagają stosunkowo krótkich miejsc wiązania RNA. Biotyna i fotorozszczepialny łącznik mogą być również kowalencyjnie przyłączane do jedno- i dwuniciowego DNA, potencjalnie rozszerzając metodę elucji UV w celu oczyszczenia różnych kompleksów DNA/białko.
Chemiczna synteza substratów RNA zawierających kowalencyjnie dołączoną biotynę i fotorozszczepialny łącznik jest praktyczna tylko w przypadku sekwencji, które nie przekraczają ~65 nukleotydów, co staje się kosztowne i nieefektywne dla znacznie dłuższych sekwencji. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy również alternatywne podejście, które jest odpowiednie dla znacznie dłuższych celów wiązania RNA. W tym podejściu RNA o dowolnej długości i sekwencji nukleotydowej jest generowane in vitro przez transkrypcję T7 lub SP6 i wyżarzane do krótkiego komplementarnego oligonukleotydu, który zawiera biotynę i fotorozszczepialny łącznik na końcu 5' (konfiguracja trans). Powstały duplex jest następnie wykorzystywany do oczyszczania pojedynczych białek wiążących lub kompleksów wielkocząsteczkowych na kulkach streptawidyny zgodnie z tym samym protokołem, który opisano dla substratów RNA zawierających fotorozszczepialną biotynę przyłączoną kowalencyjnie (konfiguracja cis). Dzięki tej modyfikacji, fotorozszczepialna biotyna może być stosowana w połączeniu z transkryptami generowanymi in vitro zawierającymi setki nukleotydów, rozszerzając metodę elucji UV do oczyszczania szerokiego zakresu RNA/białka.

<table><tbody><tr><td>Streptawidyna-Agaroza</td><td>Sigma</td><td>S1638-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Długofalowa lampa UV o wysokiej intensywności</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-00</td><td></td></tr><tr><td>Wymienna żarówka</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-19</td><td>100 watów Żarówka Mercury H44GS-100M emitująca światło UV 366 nm (Sylvania)</td></tr> <tr><td>RNA i oligonukleotydy zawierające biotynę i łącznik fotorozszczepialny w cis</td><td>Dharmacon (Lafayette, CO) lub Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td><td></td><td>Zapytaj o wycenę w Dharmacon</td></tr><tr><td>Beckman GH 3.8 wirnik kubełkowy wahadłowy</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza T7)</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza SP6)</td><td>Zestaw</td> do barwienia Promega <td>P1280</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Silver</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24612</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą rna przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Przez wiele lat, wyjątkowo silna i szybko powstająca interakcja między biotyną a streptawidyną była z powodzeniem wykorzystywana do częściowego oczyszczania biologicznie ważnych kompleksów RNA/białkowych. Strategia ta ma jednak jedną poważną wadę, która ogranicza jej szersze wykorzystanie: interakcja biotyna/streptawidyna może zostać przerwana tylko w warunkach denaturacji, które również zakłócają integralność eluowanych kompleksów, uniemożliwiając w ten sposób ich późniejszą analizę funkcjonalną i/lub dalsze oczyszczanie innymi metodami. Ponadto eluowane próbki są często zanieczyszczone białkami tła, które niespecyficznie kojarzą się z kulkami streptawidyny, co komplikuje analizę oczyszczonych kompleksów za pomocą barwienia srebrem i spektrometrii mas. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy wariant strategii biotyny/streptawidyny, w którym biotyna jest przyłączana do substratu RNA za pomocą łącznika fotorozszczepialnego, a kompleksy unieruchomione na kulkach streptawidyny są selektywnie eluowane do roztworu w postaci natywnej przez długofalowe promieniowanie UV, pozostawiając białka tła na kulkach. Krótsze substraty wiążące RNA mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną i fotorozszczepialnym łącznikiem kowalencyjnie przyłączonym do końca 5' RNA, podczas gdy dłuższe substraty RNA mogą być dostarczane z dwiema grupami przez komplementarny oligonukleotyd. Te dwa warianty metody elucji UV zostały przetestowane pod kątem oczyszczania zależnych od U7 snRNP kompleksów przetwarzających, które rozszczepiają histony pre-mRNA na końcu 3' i oba okazały się korzystne w porównaniu z innymi wcześniej opracowanymi metodami oczyszczania. Próbki eluowane promieniami UV zawierały łatwo wykrywalne ilości snRNP U7, który był wolny od głównych zanieczyszczeń białkowych i nadawał się do bezpośredniej analizy za pomocą spektrometrii mas i testów funkcjonalnych. Opisana metoda może być łatwo zaadaptowana do oczyszczania innych kompleksów wiążących RNA i stosowana w połączeniu z jedno- i dwuniciowymi miejscami wiązania DNA w celu oczyszczania białek specyficznych dla DNA i kompleksów makromolekularnych.

Metodę elucji UV przetestowano z użyciem dwóch chemicznie syntetyzowanych substratów RNA kowalencyjnie przyłączonych na końcu 5' do grupy pcB (konfiguracja cis): pcB-SL (Rysunek 1) oraz pcB-dH3/5m RNAs (Rysunek 2). 31-nukleotydowy RNA pcB-SL zawiera strukturę spinki do włosów, po której następuje 5-nukleotydowy jednoniciowy ogon, a jego sekwencja jest identyczna z końcem 3' dojrzałego mRNA histonów (t.j. po prze...

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Metoda ta powinna zainteresować badaczy, którzy próbują wyizolować kompleksy białkowe RNA i zidentyfikować ich skład za pomocą spektrometrii mas. Wierzymy, że nasz protokół będzie szczególnie przydatny do oczyszczania kompleksów, które występują w komórkach w ograniczonych ilościach i mają tendencję do dysocjacji podczas długich, wieloetapowych procedur oczyszczania. Główną zaletą tej metody jest to, że obejmuje ona tylko jeden etap oczyszczania i może być stosowana z miejscami wiązania RNA o dowolnej długości i sekwencji.Niektóre z tych kroków zademonstruje Xiao-cui Yang, który jest starszym technikiem badawczym w naszej grupie. W przypadku miejsc wiązania znacznie dłuższych niż 65 nukleotydów należy uzyskać RNA wygenerowane przez T7 i oligonukleotyd adaptorowy PCB, jak opisano w protokole tekstowym. Wymieszaj 20 pikomoli RNA ze 100 komolami oligonukleotydu adaptorowego w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 100 mikrolitrów buforu wiążącego.Umieść probówkę we wrzącej wodzie i pozwól jej inkubować przez 5 minut. Następnie pozwól wodzie ostygnąć do temperatury pokojowej. Najpierw uzupełnij 1 mililitr ekstraktu jądrowego myszy 80 milimolowym EDTA o pH 8 do końcowego stężenia 10 milimolowych.Następnie dodaj od 5 do 10 pikomoli substratu RNA, który został oznaczony ugrupowaniem PCB. Inkubować na lodzie przez 5 minut, upewniając się, że od czasu do czasu mieszasz próbkę. Następnie użyj wstępnie schłodzonej mikrowirówki w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby odwirować mieszaninę z prędkością 10 000 g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie potencjalne osady.Ostrożnie zebrać supernatant do nowej probówki na lodzie, uważając, aby uniknąć przeniesienia osadu. Przenieś około 100 mikrolitrów zawiesiny paciorkowcowej agarozy streptawidyny do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj około 1 mililitra buforu wiążącego, aby rozpocząć mycie kulek.Odwirować probówkę o ciśnieniu 25 razy g przez 2 do 3 minut i odessać supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania 2 do 3 razy, aby zrównoważyć kulki z buforem wiążącym. Załaduj wcześniej zebrany supernatant, który zawiera złożony kompleks, na zrównoważone koraliki.Za pomocą rotatora rurkowego obracaj rurkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby unieruchomić RNA i związane kompleksy na kulkach. Następnie obracaj probówkę 25 razy g przez 2 do 3 minut, aby zebrać koraliki na dnie tuby. Odessać supernatant.I dwukrotnie spłucz koraliki buforem wiążącym, stosując opisany wcześniej proces prania. Po usunięciu supernatantu z drugiego przemywania dodać 1 mililitr buforu wiążącego i obracać próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wirować próbkę 25 razy g przez 2 do 3 minut.Następnie dodaj 1 mililitr bufora wiążącego i przenieś zawiesinę do nowej tuby. Obracaj próbkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez maksymalnie 1 godzinę. Odwirować unieruchomione kompleksy 25 razy g przez 2 do 3 minut.Następnie odessać supernatant i dodać 200 mikrolitrów buforu wiążącego. Przenieś koraliki do probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Włącz lampę UV o dużej intensywności, która emituje światło UV o długości 365 nanometrów i pozwól jej osiągnąć pełny blask.Wypełnij dno szalki Petriego ciasno zapakowanym lodem, układając go na pokrywie naczynia. Krótko przekręć rurkę zawierającą unieruchomione kompleksy. Następnie umieść go poziomo na lodzie i przykryj wstępnie podgrzaną lampą, upewniając się, że próbka znajduje się od 2 do 3 centymetrów od powierzchni żarówki.Napromieniać próbkę przez łącznie 30 minut, często odwracając i wirując probówkę, aby zapewnić równomierne naświetlenie i zapobiec przegrzaniu. Następnie odwiruj kulki 25 razy g przez 2 do 3 minut i zbierz supernatant. Odwirować ten supernatant jeszcze raz, stosując te same warunki.Zebrać powstały supernatant, upewniając się, że pozostawiłeś niewielką ilość na dnie probówki, aby uniknąć przenoszenia resztek kulek. Za pomocą elektroforezy SDS-PAGE należy oddzielić frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV i odpowiednią frakcję od materiału pozostałego na kulkach po elucji UV. Następnie użyj dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra, aby zabarwić żel.Ocenić skuteczność elucji UV, porównując intensywność białek obecnych w supernatance eluowanym promieniowaniem UV i tych pozostawionych na kulkach po napromieniowaniu UV. Wyciąć interesujące nas prążki białkowe i określić ich tożsamość za pomocą spektrometrii mas. Następnie należy bezpośrednio przeanalizować frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV za pomocą spektrometrii mas, aby określić cały proteom oczyszczonego materiału w sposób bezstronny.W tym badaniu RNA pętli macierzystej oznaczone biotyną rozszczepialną foto inkubuje się z 1 mililitrem cytoplazmatycznego ekstraktu S100 uzyskanego z komórek szpiczaka myszy. A efekt i skuteczność elucji UV jest analizowana przez barwienie srebrem. Szereg białek jest wykrywanych na kulkach streptawidyny przed elucjącją.Naświetlanie długofalowym promieniowaniem UV uwalnia tylko niektóre z tych białek do supernatantu, pozostawiając niespecyficzne tło na kulkach. Podkreśla to znaczenie etapu elucji UV. Spektrometria mas identyfikuje główne białka eluowane w promieniowaniu UV jako 3'hExo i SLBP, przy czym SLBP jest reprezentowany zarówno przez białko o pełnej długości, jak i szereg krótszych produktów degradacji.Mniejsze ilości innych białek zidentyfikowanych jako różne białka wiążące RNA są również selektywnie uwalniane do roztworu przez promieniowanie UV. Elucja UV unieruchomionego histonu Drosophila pre-mRNA znakowanego fotorozszczepialną biotyną inkubowaną z ekstraktem jądrowym spowodowała selektywne uwolnienie tylko niewielkiej liczby białek do supernatantu z intensywnym tłem niespecyficznych białek pozostających na kulkach. Spektrometria mas identyfikuje te białka jako składniki U7 snRNP.Nie są one wykrywane w obecności konkurentów przetwarzających, którzy blokują wiązanie U7 snRNP z histonem pre-mRNA. Ważne jest, aby używać lampy UV o wysokiej intensywności i umieszczać ją w bliskiej odległości od napromieniowanej próbki, jednocześnie upewniając się, że nie przegrzewa się. Metoda elucji UV pozwala uzyskać natywne kompleksy białkowe RNA, które nie zawierają większych zanieczyszczeń i nadają się bezpośrednio do dodatkowych etapów oczyszczania i testów funkcjonalnych.Unikać ekspozycji oczu i skóry podczas naświetlania promieniami UV.

single-step-purification-macromolecular-complexes-using-rna-attached

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj jednoetapową metodę oczyszczania kompleksów RNA/białkowych z wykorzystaniem biotyny i fotolabilnego łącznika. Technika ta zachowuje natywną funkcjonalność kompleksów i umożliwia ich analizę spektrometryczną.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Przeglądaj więcej filmów