Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Metoda ta powinna zainteresować badaczy, którzy próbują wyizolować kompleksy białkowe RNA i zidentyfikować ich skład za pomocą spektrometrii mas. Wierzymy, że nasz protokół będzie szczególnie przydatny do oczyszczania kompleksów, które występują w komórkach w ograniczonych ilościach i mają tendencję do dysocjacji podczas długich, wieloetapowych procedur oczyszczania. Główną zaletą tej metody jest to, że obejmuje ona tylko jeden etap oczyszczania i może być stosowana z miejscami wiązania RNA o dowolnej długości i sekwencji.

Niektóre z tych kroków zademonstruje Xiao-cui Yang, który jest starszym technikiem badawczym w naszej grupie. W przypadku miejsc wiązania znacznie dłuższych niż 65 nukleotydów należy uzyskać RNA wygenerowane przez T7 i oligonukleotyd adaptorowy PCB, jak opisano w protokole tekstowym. Wymieszaj 20 pikomoli RNA ze 100 komolami oligonukleotydu adaptorowego w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 100 mikrolitrów buforu wiążącego.

Umieść probówkę we wrzącej wodzie i pozwól jej inkubować przez 5 minut. Następnie pozwól wodzie ostygnąć do temperatury pokojowej. Najpierw uzupełnij 1 mililitr ekstraktu jądrowego myszy 80 milimolowym EDTA o pH 8 do końcowego stężenia 10 milimolowych.

Następnie dodaj od 5 do 10 pikomoli substratu RNA, który został oznaczony ugrupowaniem PCB. Inkubować na lodzie przez 5 minut, upewniając się, że od czasu do czasu mieszasz próbkę. Następnie użyj wstępnie schłodzonej mikrowirówki w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby odwirować mieszaninę z prędkością 10 000 g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie potencjalne osady.

Ostrożnie zebrać supernatant do nowej probówki na lodzie, uważając, aby uniknąć przeniesienia osadu. Przenieś około 100 mikrolitrów zawiesiny paciorkowcowej agarozy streptawidyny do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj około 1 mililitra buforu wiążącego, aby rozpocząć mycie kulek.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 25 razy g przez 2 do 3 minut i odessać supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania 2 do 3 razy, aby zrównoważyć kulki z buforem wiążącym. Załaduj wcześniej zebrany supernatant, który zawiera złożony kompleks, na zrównoważone koraliki.

Za pomocą rotatora rurkowego obracaj rurkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby unieruchomić RNA i związane kompleksy na kulkach. Następnie obracaj probówkę 25 razy g przez 2 do 3 minut, aby zebrać koraliki na dnie tuby. Odessać supernatant.

I dwukrotnie spłucz koraliki buforem wiążącym, stosując opisany wcześniej proces prania. Po usunięciu supernatantu z drugiego przemywania dodać 1 mililitr buforu wiążącego i obracać próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wirować próbkę 25 razy g przez 2 do 3 minut.

Następnie dodaj 1 mililitr bufora wiążącego i przenieś zawiesinę do nowej tuby. Obracaj próbkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez maksymalnie 1 godzinę. Odwirować unieruchomione kompleksy 25 razy g przez 2 do 3 minut.

Następnie odessać supernatant i dodać 200 mikrolitrów buforu wiążącego. Przenieś koraliki do probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Włącz lampę UV o dużej intensywności, która emituje światło UV o długości 365 nanometrów i pozwól jej osiągnąć pełny blask.

Wypełnij dno szalki Petriego ciasno zapakowanym lodem, układając go na pokrywie naczynia. Krótko przekręć rurkę zawierającą unieruchomione kompleksy. Następnie umieść go poziomo na lodzie i przykryj wstępnie podgrzaną lampą, upewniając się, że próbka znajduje się od 2 do 3 centymetrów od powierzchni żarówki.

Napromieniać próbkę przez łącznie 30 minut, często odwracając i wirując probówkę, aby zapewnić równomierne naświetlenie i zapobiec przegrzaniu. Następnie odwiruj kulki 25 razy g przez 2 do 3 minut i zbierz supernatant. Odwirować ten supernatant jeszcze raz, stosując te same warunki.

Zebrać powstały supernatant, upewniając się, że pozostawiłeś niewielką ilość na dnie probówki, aby uniknąć przenoszenia resztek kulek. Za pomocą elektroforezy SDS-PAGE należy oddzielić frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV i odpowiednią frakcję od materiału pozostałego na kulkach po elucji UV. Następnie użyj dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra, aby zabarwić żel.

Ocenić skuteczność elucji UV, porównując intensywność białek obecnych w supernatance eluowanym promieniowaniem UV i tych pozostawionych na kulkach po napromieniowaniu UV. Wyciąć interesujące nas prążki białkowe i określić ich tożsamość za pomocą spektrometrii mas. Następnie należy bezpośrednio przeanalizować frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV za pomocą spektrometrii mas, aby określić cały proteom oczyszczonego materiału w sposób bezstronny.

W tym badaniu RNA pętli macierzystej oznaczone biotyną rozszczepialną foto inkubuje się z 1 mililitrem cytoplazmatycznego ekstraktu S100 uzyskanego z komórek szpiczaka myszy. A efekt i skuteczność elucji UV jest analizowana przez barwienie srebrem. Szereg białek jest wykrywanych na kulkach streptawidyny przed elucjącją

Naświetlanie długofalowym promieniowaniem UV uwalnia tylko niektóre z tych białek do supernatantu, pozostawiając niespecyficzne tło na kulkach. Podkreśla to znaczenie etapu elucji UV. Spektrometria mas identyfikuje główne białka eluowane w promieniowaniu UV jako 3'hExo i SLBP, przy czym SLBP jest reprezentowany zarówno przez białko o pełnej długości, jak i szereg krótszych produktów degradacji.

Mniejsze ilości innych białek zidentyfikowanych jako różne białka wiążące RNA są również selektywnie uwalniane do roztworu przez promieniowanie UV. Elucja UV unieruchomionego histonu Drosophila pre-mRNA znakowanego fotorozszczepialną biotyną inkubowaną z ekstraktem jądrowym spowodowała selektywne uwolnienie tylko niewielkiej liczby białek do supernatantu z intensywnym tłem niespecyficznych białek pozostających na kulkach. Spektrometria mas identyfikuje te białka jako składniki U7 snRNP.

Nie są one wykrywane w obecności konkurentów przetwarzających, którzy blokują wiązanie U7 snRNP z histonem pre-mRNA. Ważne jest, aby używać lampy UV o wysokiej intensywności i umieszczać ją w bliskiej odległości od napromieniowanej próbki, jednocześnie upewniając się, że nie przegrzewa się. Metoda elucji UV pozwala uzyskać natywne kompleksy białkowe RNA, które nie zawierają większych zanieczyszczeń i nadają się bezpośrednio do dodatkowych etapów oczyszczania i testów funkcjonalnych.

Unikać ekspozycji oczu i skóry podczas naświetlania promieniami UV.