Standaryzowane przetwarzanie kontroli immunohistochemicznych osadów komórkowych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie

Dobrze scharakteryzowane pozytywne i ujemne kontrole osadów komórkowych ze zdefiniowanymi poziomami ekspresji białka lub transkryptu są niezbędne do opracowania testów immunohistochemicznych. Protokół ten opisuje proces tworzenia i przetwarzania utrwalonych w formule, zatopionych w parafinie kontrolek komórkowych. Takie kontrole można wykorzystać do scharakteryzowania swoistości wiązania podczas opracowywania nowego testu immunohistochemicznego.

Testy IHC mają kluczowe znaczenie dla naszych odkryć i wysiłków związanych z rozwojem biomarkerów w różnych obszarach terapeutycznych, a opracowanie zwalidowanych kontroli jest niezbędne do opracowania tych testów. Konieczne jest podgrzanie żelu na bazie hydroksyetyloagarozy do co najmniej 40 stopni Celsjusza przed dodaniem go do osadu komórkowego. Żel musi być dobrze wymieszany z komórkami przed zestaleniem.

Rozpocznij utrwalanie osadzacza komórek 293T, dodając 30 mililitrów 10% neutralnej buforowanej formaliny do trzymililitrowej osadki komórkowej, aby uzyskać stosunek utrwalacza do komórki 10 do jednego. Ponownie zawieś komórki, wielokrotnie odwracając szczelnie zakręconą rurkę o pojemności 50 mililitrów i pozwól im osiąść przez noc w temperaturze pokojowej. Aby poprawić utrwalenie, zwiększ stosunek powierzchni do objętości, odwracając rurkę następnego dnia i ponownie zawieszając komórki.

Po 24 godzinach od utrwalenia odwirować probówkę pod ciśnieniem 930 razy G w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Upewnij się, że osad komórkowy jest widoczny i usuń utrwalacz, dekantując go lub ostrożnie odsysając za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia. Dodaj stopiony żel na bazie hydroksyetyloagarozy w temperaturze od 40 do 60 stopni Celsjusza do osadu w stosunku jeden do czterech żelu do komórki.

Użyj czystej sondy sterling o średnicy pięciu cali i dwóch milimetrów z oczkiem przepłukanym wodą z kranu, aby delikatnie wymieszać zawartość stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, tworząc równomierną zawiesinę stałych komórek w stopionym żelu na dole. Po równomiernym zawieszeniu utrwalonych komórek w stopionym żelu, zakryj probówkę kroniki i umieść ją na mokrym lodzie na pięć do 10 minut. Gdy granulka żelu zastygnie, ostrożnie umieść czystą mikroszpatułkę wzdłuż boku rurki i delikatnie podważ granulkę, nie przebijając jej.

Umieścić zestaloną osadkę na bibułce biopsyjnej. Za pomocą czystej mikroszpatułki przytnij osad komórkowy na plastry o grubości od czterech do pięciu milimetrów, aby zmieściły się w kasecie tkankowej o wymiarach 26 milimetrów na 26 milimetrów na pięć milimetrów. Umieść pojedyncze plasterki żelu na środku kawałka bibuły do biopsji.

Złóż dwie przeciwległe strony i zawiń plasterek w papier przed umieszczeniem go w kasecie na chusteczki o wymiarach 26 na 26 na pięć milimetrów. Zamknij pokrywę. Umieść kasetę z przyciętymi komórkami w retorcie procesora tkanek wypełnionej 10% neutralną buforowaną formaliną i uruchom zgodnie z krótkim harmonogramem przetwarzania.

W celu zatopienia granulki komórkowej należy umieścić przetworzone kasety w obszarze przechowywania centrum zatapiania. Otwórz pokrywę kasety z bibułkami i ostrożnie rozłóż bibułę biopsyjną. Umieść granulki komórkowe w małej jednorazowej formie do zatapiania o wymiarach 15 na 15 milimetrów w przeciętej stronie do dołu.

Delikatnie przytrzymując granulkę komórkową na dnie formy za pomocą kleszczy, dodaj infiltrację tkanek o temperaturze 62 stopni Celsjusza lub zatapianie parafiny w formie, przykrywając osad komórkowy. Przenieś formę do zimnego bloku, aby zestalić parafinę. Wyreguluj granulkę komórkową, gdy parafina krzepnie, i zamocuj ją w odpowiedniej pozycji na dnie formy.

Zdejmij pokrywę z kasety. Umieść kasetę dolną stroną do dołu na wierzchu formy do zatapiania i dodaj dodatkową stopioną parafinę, aby przykryć kasetę. Gdy parafina zostanie napełniona kasetą na tkanki, włóż formę z powrotem do zimnego bloku w celu zestalenia.

Skrawki parafiny przygotowane za pomocą mikrotomu rotacyjnego pobrać z kąpieli flotacyjnej na dodatnio naładowane szkiełka. Umieść pierwszą sekcję w górnej części szkiełka w obrębie szkiełka nakrywkowego i granicy barwienia, a następnie kolejno umieść kolejne sekcje jedna pod drugą. Po zakończeniu susz szkiełka początkowo w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie w 60 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Osadzony osad komórkowy przygotowany tą metodą wykazał równomierne rozmieszczenie komórek w całym przekroju, przy minimalnym zbrylaniu się komórek i interakcjach w pastylce. Gdy znakowanie immunologiczne zostało zwizualizowane za pomocą brązowego diaminobenzenu, chromogenu i trzech linii komórkowych zaobserwowano różne poziomy ekspresji czynnika transkrypcyjnego TEAD w jądrze, od zera, przez słaby, do silnej ekspresji. Włączenie osadów komórkowych do mikromacierzy pozwoliło na ocenę kontroli o różnych poziomach ekspresji na tym samym slajdzie bez różnic w procedurach.

Jak pokazano w tym przykładzie, można zaobserwować negatywną kontrolę embrionalnych komórek macierzystych myszy z niedoborem PEG 10 oraz pozytywną kontrolę limfocytów 293T z nadekspresją PEG 10. Zapewnienie, że komórki są odpowiednio zamocowane i jednorodnie rozmieszczone w całej granulce żelu, tworzy jednolitą, znormalizowaną kontrolę testu. Granulki komórkowe mogą być używane jako kontrole w dalszych testach immunohistochemicznych i hybrydyzacji NC2 ze standardowymi metodami pobierania i znakowania antygenu.

Kontrola osadów komórkowych umożliwiła opracowanie wielu testów immunohistochemicznych, szczególnie dla nowych lub minimalnie scharakteryzowanych białek. Służą jako dobrze zdefiniowane kontrole, które mogą pomóc w scharakteryzowaniu swoistości przeciwciał.