Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zdolności ligandów estrogenowych do regulacji receptora estrogenowego alfa i mechanizmów selektywnych modulatorów receptora estrogenowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta metoda. Wykazuje zależną od ligandu aktywność dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego alfa w komórkach.

Procedurę zademonstruje Tanner Jefferson, doktorant z naszej grupy. Metoda ta wykorzystuje trzy różne plazmidy do wykrywania aktywności dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego w komórkach. pG5-Luc jest plazmidem reporterowym lucyferazy do wykrywania skuteczności aktywności dimeryzacyjnej.

Mysi receptor estrogenowy alfa EF pBIND jest czynnikiem transkrypcyjnym reagującym na galaktozę, wiążącym DNA GAL4 z głównym plazmidem o ekspresji domeny wiążącym ligand estrogenowy alfa myszy z nim, który wiąże się z elementem reagującym na GAL4 na reporterze pG5-Luc. mysi receptor estrogenowy pACT alfa EF jest transaktywującym białko segmentowe wirusa opryszczki pospolitej VP16 aktywowane w domenie połączonego mysiego receptora estrogenowego alfa liganda wiążącego plazmid ekspresji domeny, który nie wiąże się bezpośrednio z reporterem pG5-Luc. Gdy obecny jest właściwy ligand, białka pochodzące z plazmidów receptora estrogenowego alfa EF myszy pBIND i plazmidów receptora estrogenowego alfa EF pACT wiążą się przez domenę wiążącą ligand receptora estrogenowego alfa.

Skuteczność dimeryzacji zależy od aktywności lucyferazy. Najważniejszym krokiem jest kontrolowanie aktywności białka pochodzącego z mysiego receptora estrogenowego alfa EF pBIND. Aktywność domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa ligand pochodzącej z pBIND w każdym ligandzie bez plazmidu receptora estrogenowego alfa EF pACT musi zostać oceniona przed analizą aktywności dimeryzacji liganda liganda wiążącego ligand receptora estrogenowego zależnej od liganda.

Zacznij od dodania odpowiednich kombinacji plazmidów do dwóch 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek na kombinację. Przygotuj dwie kombinacje mieszaniny DNA. Pierwsza probówka zawiera pG5-Luc, pBIND-receptor estrogenowy-alfa EF i puste plazmidy pACT.

Druga probówka zawiera plazmidy pG5-Luc, pBIND-receptor estrogenowy-alfa EF i pACT-receptor estrogenowy-alfa EF. Aby wytrącić DNA, dodaj 1/9 objętości mieszaniny DNA trzech molowych octanów sodu i 20X trzymolową objętość octanu sodu 100% etanolu do mieszaniny DNA w każdej probówce i odwiruj probówki. Przechowuj mieszaniny w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc przed odwirowaniem z maksymalną prędkością następnego ranka.

Wyrzuć supernatanty i ponownie zawieś niewidoczne granulki w 120 mikrolitrach 75% etanolu na probówkę, uważając, aby spłukać wszelkie DNA przyklejone do wnętrza probówek. Po drugim odwirowaniu w tych samych warunkach wyrzucić supernatanty i wysuszyć DNA w koncentratorze próżniowym przez 30 minut. W celu transfekcji umyj przygotowane ludzkie komórki raka wątrobowokomórkowego dwa razy 0,5 mililitra PBS o temperaturze pokojowej na studzienkę na mycie i nakarm komórki 0,5 mililitra świeżego MEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej 10% pozbawioną węgla drzewnego, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i dwiema milimolowymi L-glutaminami.

Następnie zawiesić wysuszoną mieszaninę DNA plazmidu i odczynnik do transfekcji w odpowiedniej objętości DMEM na liczbę dołków w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Dodać równą objętość pożywki odczynnika do transfekcji do każdej probówki z mieszaniną plazmidowego DNA zawieszonego w DMEM. Po 5-10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 25 mikrolitrów mieszaniny DNA do odpowiednich dołków doświadczalnych 24-dołkowej płytki do hodowli komórek ludzkiego raka wątrobowokomórkowego w celu sześciogodzinnej transfekcji w inkubatorze hodowli komórkowej.

Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę transfekcyjną 0,5 mililitra świeżego fenolu MEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wolnego od czerwieni, uzupełnionego 10% pozbawionym węgla drzewnego, inaktywowanym termicznie FBS, dwiema milimolowymi L-glutaminą, 1% streptomycyną penicyliny i ligandem na studzienkę i zwróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne 16 do 18 godzin. Następnego ranka umyj komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę i dołącz komórki z każdej studzienki 100 mikrolitrami pasywnego buforu do lizy na studzienkę i energicznie wytrząsaj mieszaczem wirowym. Następnie zamroź lizaty komórkowe w ciekłym azocie.

W dniu podwójnego testu lucyferazy potrząśnij lizatami na wytrząsarce, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową i przenieś 10 mikrolitrów lizatu do indywidualnych dołków 96-dołkowej białej płytki z tworzywa sztucznego. Następnie odczytaj aktywność lucyferazy każdej próbki lizatu komórkowego na czytniku mikropłytek. Traktowanie transfekowanych plazmidów plazmidów pACT myszy pBIND z plazmidami alfa EF i pACT 10 nanomolowym estradiolem stymuluje aktywność lucyferazy, ponieważ domena wiążąca ligand receptora estrogenowego alfa zawiera zależną od ligandu domenę funkcyjną transaktywacji, AF-2.

Stężenia jedno- i 10-nanomolowe indukują jednak aktywność lucyferazy w komórkach transfekowanych kombinacją plazmidów pBIND i pACT mysiego receptora estrogenowego alfa EF, co sugeruje wykonalność tej procedury do oceny aktywności dimeryzacji domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa liganda przy maksymalnie jednym nanomolowym traktowaniu estradiolem. Leczenie 4-hydroksy-tamoksyfenem nie wywołuje aktywności lucyferazy w komórkach transfekowanych plazmidu pBIND receptora estrogenowego alfa EF i pACT myszy pBIND, co sugeruje, że funkcja AF-2 receptora estrogenowego alfa nie jest aktywowana przez ten ligand. Jednak do 10 stężeń nanomolowych indukuje aktywność lucyferazy w komórkach transfekowanych kombinacją plazmidów pBIND i pACT mysiego receptora estrogenowego alfa EF, co sugeruje, że procedura ta jest wykonalna do oceny aktywności dimeryzacji domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa ligand przy maksymalnie 10 nanomolach leczenia 4-hydroksy-tamoksyfenem.

Aktywność z połączenia plazmidów ekspresji domeny receptora alfa receptora estrogenowego myszy pBIND i pACT z 4-hydroksy-tamoksyfenem jest znacznie wyższa niż połączenie plazmidów o ekspresji domeny receptora alfa receptora estrogenowego pBIND i pACT dla ludzi. Wskazuje to, że zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego myszy jest silniejsza niż domena wiążąca ligand alfa receptora estrogenowego. Co więcej, zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego myszy zawierającej ludzką domenę F jest znacznie niższa niż w przypadku domeny wiążącej ligand receptora alfa estrogenowego typu dzikiego.

W przeciwieństwie do tego, zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa ludzkiego receptora estrogenowego zawierającej mysią domenę F jest znacznie wyższa niż w przypadku domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego typu dzikiego. Sugeruje to, że domena F ma wpływ na specyficzną dla gatunku aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej receptor alfa liganda receptora estrogenowego zależny od 4-hydroksytamoksyfenu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przetestowaniu podstawowej aktywności domeny wiążącej DNA GAL4 w połączonej lidandowej domenie receptora estrogenowego alfa z ligandem.

Działanie to powinno być takie samo jak postępowanie z podłożem.