Name: Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego alfa za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów działania selektywnych modulatorów receptora estrogenowego w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Sueyoshi i Wang z Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) za ich krytyczne odczytanie manuskryptu, a Tannerowi Jeffersonowi za przeprowadzenie procedur na filmie. Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant 1ZIAES070065 (dla K.S.K.) z Wydziału Badań Wewnętrznych NIEHS.

1. Przygotowanie plazmidów do testu dwuhybrydowego u ssaków
<ol>
	<li>Użyj następujących plazmidów: pG5-Luc, pBIND-ERαEF i pACT-ERαEF. 
	UWAGA: Plazmidy są dostępne u autorów na życzenie i są wysyłane na bibule filtracyjnej. pG5-Luc jest plazmidem reporterowym, który zawiera pięć powtórzeń elementów reagujących na GAL4 połączonych z jednostką ekspresji lucyferazy (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). pBIND-ERαEF jest plazmidem ekspresji białka dla GAL4DBD skondensowanych białek ERα LBD. pBIND-ERαEF zawiera jednostkę ekspresji lucyferazy Renilla do normalizacji skuteczności transfekcji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). pACT-ERαEF jest plazmidem ekspresji białka dla białek ERα LBD z fuzją VP16AD (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C). Schemat wyrażonej struktury białka z plazmidów jest pokazany na Rysunek 2.</li>
	<li>Przygotuj plazmidowe DNA.
	<ol>
		<li>Wytnij obszar obciążony plazmidem z papieru za pomocą czystych nożyczek i włóż go do probówki o pojemności 1,5 ml. Załóż rękawiczki i użyj czystej pęsety, aby podnieść papier załadowany plazmidem. Dodać 100 μl buforu Tris-EDTA (TE) (pH 8,0) i dobrze odwirować.</li>
		<li>Dodać 1 μl roztworu plazmidowego DNA z kroku 1.2.1 do właściwych komórek Escherichia coli (patrz tabela materiałów) i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Wstrząs termiczny kompetentnych komórek z dodatkiem plazmidu; inkubować probówkę (probówki) w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 s, a następnie trzymać je na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 250 μl super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitów (SOC) (o temperaturze pokojowej) do probówki (probówek) i wyhodować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Umieścić 100 μl hodowli E. coli na wstępnie podgrzanej płytce bulionu Luria (LB) ze 100 μg/ml ampicyliny (naczynie o średnicy 10 cm) i wyhodować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Wybierz jedną kolonię z talerza i dodaj ją do 14 ml probówki zawierającej 2 ml wspaniałego bulionu (TB) ze 100 μg/ml ampicyliny. Hodowlę należy przeprowadzić z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C aż do uzyskania lekkiego zmętnienia podłoża.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki z etapu 1.2.6 do autoklawizowanej szklanej kolby o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml gruźlicy ze stężeniem 100 μg/ml ampicyliny. Hodowla z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.</li>
		<li>Przenieść wyhodowaną bakterię E. coli do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 450 x g w temperaturze pokojowej przez 30 minut za pomocą wirnika z odchylanym kubełkiem. Wyrzuć pożywkę. Przechowywać granulki E. coli w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Dodać 3 ml roztworu do ponownego zawieszania komórek (patrz tabela materiałów) do osadu E. coli i całkowicie go zawiesić. Dodać 3 ml roztworu do lizy komórek (patrz tabela materiałów), delikatnie wymieszać probówkę, odwracając ją 10 razy i trzymać na lodzie przez 5 minut (punktualnie utrzymywać czas). Dodać 6 ml roztworu neutralizującego (patrz tabela materiałów), wymieszać probówkę równomiernie, stukając, a następnie trzymać ją na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 3 450 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut za pomocą wirnika kubełkowego. Przenieść roztwór zawierający DNA do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 10 ml żywicy oczyszczającej DNA (patrz tabela materiałów). Delikatnie zawieś żywicę.</li>
		<li>Odwirować probówkę o masie 625 x g przez 1 minutę za pomocą wirnika uchylno-kubełkowego. Wyrzuć roztwór i trzymaj żywicę na dnie.</li>
		<li>Dodaj 15 ml roztworu do przemywania kolumny (80 mM octanu potasu, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 μM EDTA i 55% etanolu) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i delikatnie potrząśnij, aby zawiesić żywicę. Powtórz krok 1.2.11. 
		UWAGA: Roztwór do płukania kolumny należy przygotować przy użyciu wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC) lub wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu do przemywania kolumny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zawiesić żywicę za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Nałóż żywicę na kolumnę (patrz Tabela materiałów), która jest ustawiona na kolektorze próżniowym. Odkurz kolumnę, aż żywica wyschnie. Dodać 6 ml roztworu do przemywania kolumny do kolumny i odkurzyć.</li>
		<li>Gdy żywica wizualnie wyschnie, odłącz zbiornik od kolumny. Przenieś dolną część kolumny (żywicy) do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki, aby całkowicie wysuszyć żywicę.</li>
		<li>Przenieś dolną część kolumny (żywicy) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 300 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny i poczekaj, aż cała żywica nasiąknie.</li>
		<li>Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu zebrania roztworu zawierającego plazmidowe DNA (200 - 250 μl).</li>
		<li>Potraktować roztwór zawierający DNA chloroformem fenolowym (1:1), a następnie chloroformem w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Dodać taką samą objętość chloroformu fenolowego (1:1) do roztworu zawierającego DNA (200-250 μl), dobrze wstrząsnąć i odwirować z maksymalną prędkością przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki. Zebrać górną warstwę (roztwór zawierający DNA) i dodać ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz ten krok 1x.</li>
			<li>Dodać taką samą objętość chloroformu do roztworu zawierającego DNA (200 - 250 μl), dobrze wstrząsnąć i odwirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Zebrać górną warstwę (roztwór zawierający DNA) i dodać ją do probówki o pojemności 1,5 ml. 
			UWAGA: Endotoksyna (lipopolisacharyd) indukuje sygnalizację komórkową w niektórych komórkach. Aby uniknąć takiego nieprzewidywalnego efektu, zaleca się wykonanie kroku 1.2.17, który może zmniejszyć zanieczyszczenie endotoksynami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wytrącić plazmidowe DNA za pomocą techniki wytrącania etanolu w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Do roztworu zawierającego DNA dodać 1/9 objętości mieszaniny DNA 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 20 razy objętość 3M octanu sodu 100% etanolu do roztworu zawierającego DNA. Na przykład do 250 μl roztworu DNA (końcowa objętość to 555,8 μl 3 M octanu sodu i 278 μl 100% etanolu) dodać 27,8 μl roztworu DNA.</li>
			<li>Utrzymywać roztwór w temperaturze -80 °C przez co najmniej 20 minut. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić roztwór i zachować osad. Dodaj 200 μl 75% etanolu i wypłucz wnętrze tubki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić roztwór i zachować osad. Wysuszyć osad DNA za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
			<li>Dodać 100 - 250 μl buforu TE (pH 8,0) do probówki. Rozpuścić osad DNA i sprawdzić stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm. Utrzymuj stężenie DNA na poziomie około 0,5 mg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test dwuhybrydowy u ssaków
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki.
	<ol>
		<li>Hodowla ludzkich komórek HepG2 raka wątrobowokomórkowego w kolbie do hodowli tkankowej o pojemności 750 ml i długości 175cm2 z minimalną ilością niezbędnych pożywek (MEM) wolnych od czerwieni fenolowej uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; inaktywowaną termicznie), 2 mM L-glutaminą i 1% roztworem penicyliny-streptomycyny (antybiotyki) w celu utrzymania komórek.</li>
		<li>Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 , aż komórki zlewają się w około 90%. 
		UWAGA: Aby zmniejszyć aktywność tła estrogenowego, we wszystkich eksperymentach M2H należy stosować pożywkę wolną od czerwieni fenolowej. Ten krok powinien być wykonywany wewnątrz czystej ławki/szafy bezpieczeństwa biologicznego. Komórki powinny być utrzymywane zgodnie z ogólnym protokołem hodowli komórek ssaków7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki do transfekcji. 
	UWAGA: Następujące czynności proceduralne należy wykonać wewnątrz czystej ławki/szafy bezpieczeństwa biologicznego. Na tym etapie komórki są za każdym razem hodowane/inkubowane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Ponownie przełóż 90% zlewających się komórek na płytki 24-dołkowe; przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Dodać 7 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do kolby hodowlanej i moczyć komórki przez 1 - 2 minuty, trzymając kolbę hodowlaną w czystej ławce w temperaturze pokojowej. Usunąć część roztworu trypsyny-EDTA i pozostawić 1 - 2 ml roztworu w kolbie hodowlanej. Inkubować kolbę hodowlaną w inkubatorze przez 1 - 2 minuty.</li>
		<li>Uderz w dno kolby, aby odłączyć komórki i sprawdzić je pod mikroskopem. 
		UWAGA: Jeśli komórki są nadal podłączone do kolby, inkubować przez kolejne 1-2 minuty, a następnie powtórzyć krok 2.2.3.</li>
		<li>Zawieś komórki w MEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS (inaktywowany termicznie) węglem drzewnym), 2 mM L-glutaminy i 1% roztworu penicyliny i streptomycyny. 
		UWAGA: FBS pozbawiony węgla drzewnego musi być stosowany w celu zmniejszenia wpływu endogennego estrogenu pochodzącego z surowicy.</li>
		<li>Policz liczbę komórek i komórki nasienne na 24-dołkowej płytce o gęstości 1,2 x 105 komórek/dołek. Przypisz trzy dołki do każdego punktu danych (trzykrotnie).</li>
		<li>Hoduj komórki przez noc. Przejdź do kroku 2.4.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę DNA do transfekcji. 
	UWAGA: Następujące plazmidowe DNA są transfekowane w jednym dołku: 100 ng plazmidu reporterowego pG5-Luc, 50 ng plazmidów ekspresyjnych dla białek fuzyjnych GAL4DBD (pBIND) i 50 ng plazmidów ekspresyjnych dla białek fuzyjnych VP16AD (pACT).
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować zależną od liganda aktywność dimeryzacji ERα LBD, przygotuj następujące kombinacje (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Kombinacja (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT oraz pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT. Kombinacja (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF oraz pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF. Kombinacja (iii): pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF oraz pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF. 
		UWAGA: Kombinacja (i) reprezentuje podstawowy poziom doświadczalny odpowiednio ludzkiego ERα LBD i mysiego ERα LBD. Jeśli wynik wykazuje niezwykle wysoki poziom z samym ligandem, metoda ta jest niewykonalna do stosowania z tym ligandem (np. dietylstilbestrolem [DES]). Kombinacja (ii) reprezentuje odpowiednio poziomy dimeryzowanego ludzkiego ERα LBD i dimeryzowanego mysiego ERα LBD. Kombinacja (iii) oznacza kontrole ujemne; Tego zestawu należy używać tylko wtedy, gdy eksperyment jest wykonywany po raz pierwszy w celu oceny poziomu tła systemu.</li>
		<li>Przed zmieszaniem należy obliczyć całkowitą wymaganą ilość DNA na podstawie liczby studzienek do transfekcji. W przypadku eksperymentów przeprowadzanych w trzech powtórzeniach i w pięciu punktach danych, należy zmieszać następujące plazmidowe DNA w dwóch probówkach o pojemności 1,5 μl dla kombinacji (i) i (ii): pG5-Luc, 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 100 ng = 1,500 ng (15 μL); pBIND-mERαEF, 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 50 ng = 750 ng (7,5 μL); pACT (dla kombinacji i) lub pACT-mERαEF (dla kombinacji ii), 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 50 ng = 750 ng (7,5 μL). 
		UWAGA: Stężenie każdego roztworu plazmidowego DNA wynosi 0,1 μg/μL.</li>
		<li>Wytrącić mieszaninę DNA za pomocą techniki wytrącania etanolu. Do mieszaniny DNA dodać 1/9 objętości mieszaniny DNA 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 20 razy objętość 3M octanu sodu 100% etanolu do mieszaniny DNA. Następnie przekręć rurkę. 
		UWAGA: Na przykład dodać 3,4 μl 3 M octanu sodu i 34 μl 100% etanolu do 30 μl mieszaniny plazmidowego DNA, której przykładem jest krok 2.3.2. Ten krok pomaga utrzymać niezmienny stan transfekcji i nie jest konieczne wykonywanie tego kroku w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Przechowywać mieszaninę przez noc w temperaturze -20 °C. Odwirowywać ją z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić roztwór (osad jest niewidoczny). Dodać 120 μl 75% etanolu do probówki; Następnie wypłucz wnętrze tuby. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić roztwór i suszyć mieszaninę DNA za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj transfekcję. 
	UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać na czystej ławce lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Następnego ranka opłucz komórki wysiane na 24-dołkowej płytce (z kroku 2.2.6) 2x 0,5 ml PBS (temperatura pokojowa).</li>
		<li>Dodaj ciepły (37 °C) świeży fenol MEM bez czerwieni uzupełniony 10% FBS (inaktywowany termicznie) i 2 mM L-glutaminy bez antybiotyków do każdej studzienki (0,5 ml pożywki/dołek). Komórki należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 .</li>
		<li>Zawiesić wysuszoną mieszaninę plazmidowego DNA (z kroku 2.3.4) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco (bez surowicy, bez czerwieni fenolowej, bez glutaminy; 13 μl/basenik). Oblicz ilości DMEM na podstawie liczby dołków do transfekcji. 
		UWAGA: 15 dołków dla kombinacji (i) x 13 μL = 195 μL i 15 dołków dla kombinacji (ii) x 13 μL = 195 μL.</li>
		<li>Zawiesić odczynnik do transfekcji (patrz tabela materiałów; 1,5 μl/studzienkę) w DMEM (12,5 μl/basenik) w innej probówce o pojemności 1,5 ml. Obliczyć ilości odczynnika do transfekcji i DMEM na podstawie liczby dołków do transfekcji. 
		UWAGA: 30 [15 dołków dla kombinacji (i) i 15 dołków dla kombinacji (ii)] x 1,5 μl odczynnika do transfekcji + 30 x 12,5 μl DMEM = 420 μL.</li>
		<li>Dodać równą ilość pożywki odczynnika do transfekcji (z kroku 2.4.4) do każdej probówki (z kroku 2.4.3). Inkubować probówki przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: 200 μl pożywki odczynnikowej do transfekcji + 195 μl kombinacji (i) mieszaniny DNA = 395 μL i 200 μl pożywki odczynnika do transfekcji + 195 μl mieszaniny (ii) mieszaniny DNA = 395 μL. Ważne jest, aby dodać równą objętość odczynnika do transfekcji do probówek z kombinacją (i) i (ii). Na tym etapie nie jest konieczne zużywanie pożywki.</li>
		<li>Dodać połączoną mieszaninę (z etapu 2.4.5) do każdego dołka (25 μl/basenik) płytki 24-dołkowej (z etapu 2.4.2) i inkubować komórki przez 6 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2</li> .
		<li>Usunąć podłoże do transfekcji z płytki 24-dołkowej. Dodaj ciepły (37 °C) świeży MEM bez czerwieni fenolowej uzupełniony 10% FBS (inaktywowany termicznie) węglem drzewnym, 2 mM L-glutaminy, 1% roztworu penicyliny i streptomycyny oraz liganda (zawieszonego w etanolu) (0,5 ml podłoża / studzienkę). Hodować komórki przez 16 - 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz próbki.
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki 1 ml PBS, a następnie dodać 100 μl 1x pasywnego buforu do lizy (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Energicznie potrząśnij 24-dołkowymi płytkami za pomocą mieszalnika wirowego, aby odłączyć komórki.</li>
		<li>Płytki (lizaty komórkowe) zamrozić 1x ciekłym azotem lub zachować je w temperaturze -80 °C przed analizą. Bezpośrednio przed badaniem energicznie potrząśnij płytkami na wytrząsarce, aż osiągną temperaturę pokojową. 
		UWAGA: Proces ten zapobiega nieregularnie pojawiającym się anomalnym wartościom aktywności lucyferazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test podwójnej lucyferazy.
	<ol>
		<li>Przygotować odczynniki do systemu testów podwójnej lucyferazy (patrz tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Aby zrobić bufor substratu do testu lucyferazy (LAS), dodaj cały bufor do testu lucyferazy do substratu do testu lucyferazy, który znajduje się w szklanej brązowej butelce. Przechowywać bufor LAS w temperaturze -20 °C. 
			UWAGA: Przed użyciem bufor LAS należy ogrzać do temperatury pokojowej.</li>
			<li>Aby zrobić bufor substratu lucyferazy Renilla (RLS), wymieszaj substrat lucyferazy Renilla i bufor lucyferazy Renilla w stosunku 1:50. Przygotuj świeży bufor RLS dla każdego testu i użyj czarnej probówki lub probówki zacienionej folią aluminiową. Obliczanie ilości buforu zabezpieczeń na poziomie wiersza tworzącego nowy bufor. 
			UWAGA: Przed użyciem bufor RLS należy ogrzać do temperatury pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić odczynniki w czytniku mikropłytek.
		<ol>
			<li>Przewody iniekcyjne umyć 2x 70% etanolem, a następnie przewody 2x umyć wodą. 
			UWAGA: Jest to ważne, aby zapobiec zakłóceniu wyników testu.</li>
			<li>Ustawić bufor LAS na linię wtryskiwacza P (pierwsze wstrzyknięcie) i ustawić bufor RLS na linię wtryskiwacza M (drugie wstrzyknięcie). Nie mieszaj tych. Bufor zabezpieczeń wiersza hamuje aktywność lucyferazy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nałożyć 10 μl pobranych próbek (z etapu 2.5.3) na 96-dołkową białą płytkę z tworzywa sztucznego.</li>
		<li>Zastosuj następujące ustawienia do czytnika mikropłytek. W przypadku wtryskiwacza P należy użyć objętości 50 μl, opóźnienia 2 s i prędkości 50 μL/s. W przypadku wtryskiwacza M należy użyć objętości 50 μl, opóźnienia 2 s i prędkości 50 μL/s. Ustaw czas integracji na 15 s. Ustaw temperaturę na 25 °C.</li>
		<li>Uruchomić czytnik mikropłytek.</li>
		<li>Zapisz wartości aktywności lucyferazy (IPValue) i wartości aktywności lucyferazy Renilla (IMValue) za pomocą programu do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Po zebraniu danych umyć przewody iniekcyjne (patrz krok 2.6.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie analizy danych.
	<ol>
		<li>Użyj znormalizowanych wartości (IPValue/IMValue) do analizy danych.</li>
		<li>Ustawić znormalizowaną wartość kombinacji (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pACT] z nośnikiem (ligand 0 nM) jako 1 w celu obliczenia poziomu podstawowego i homodimeryzowanego poziomu ERα LBD. Poziomy są reprezentowane jako "Aktywność względna".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F+domain+of+estrogen+receptor+%CE%B1+is+involved+in+species-specific%2C+tamoxifen-mediated+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li>
<li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li>
<li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+estrogen+receptor%2Fcoactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li>
<li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li>
<li>Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor%3A+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).</li>
<li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+%CE%B1+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li>
<li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitry%2C+RR+%22Human+Cell+Culture+Protocols%22">Human Cell Culture Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+%CE%B1+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li>
<li>Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).</li>
<li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries%3A+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li>
<li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+L543A%2C+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists%2C+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

W niniejszym artykule opisaliśmy protokół testu M2H, koncentrując się na warunkach testu do wykrywania aktywności homodimeryzacyjnej ERα LBD jako przykładu. Ogólnie rzecz biorąc, test M2H nie jest popularny w ocenie zależnej od ligandu aktywności dimeryzacji ERα LBD. Wynika to z faktu, że ERα LBD posiada funkcję aktywacji transkrypcji; których aktywność w niektórych przypadkach zakłóca wyniki testu M2H. Jednak, jak pokazujemy tutaj, test M2H może być stosowany do analizy aktywności dimeryzacji LBD niektórych substancji, ...

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja aminokwasowa ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Ze względu na większą homologię między ludzkim i mysim ERα, funkcja tych receptorów jest uważana za identyczną, a zróżnicowana aktywność substancji estrogenowych (np. tamoksyfenu) u tych gatunków jest spowodowana różnicami w metabolizmie chemicznym gatunku, a nie różnicami strukturalnymi ERα. ERα ma wysoce konserwatywne struktury domenowe, które są powszechne w nadrodzinie receptorów jądrowych (NR), oznaczonych domenami od A do F. Domena E lub domena wiążąca ligand (LBD) obejmuje kieszeń wiążącą ligand i funkcję aktywacji transkrypcji 2, nazwaną AF-2. Domena F jest zlokalizowana bezpośrednio przylegająca do domeny E i jest najbardziej zmienną domeną spośród NR. Nawet między człowiekiem a myszą ERα homologia domeny F jest znacznie niższa niż w innych domenach1. Związany z ligandem LBD ERα zwiększa homodimeryzację białka ERα w celu bezpośredniego związania specyficznego elementu DNA reagującego na estrogen w celu regulacji transkrypcji genu zależnego od liganda (klasyczne działanie ERα). Badania krystalograficzne ujawniły różnicowe pozycjonowanie helisy 12 (domena rdzenia AF-2) z dimerami LBD związanymi z estradiolem (E2) lub 4-hydroksy-tamoksyfenem (4OHT)2,3. Domena ERα F (45 aminokwasów) łączy helisę 12 bezpośrednio. Nie ma jednak informacji dotyczących wpływu tego rozszerzenia 45 aminokwasów (domena F) z helisy 12 na dimeryzację ERα LBD. W tym badaniu wykazujemy wkład domeny F w specyficzną dla gatunku homodimeryzację ERα LBD zależną od 4OHT za pomocą testu dwuhybrydowego (M2H) u ssaków.
Test M2H to metoda demonstrowania interakcji białko-białko w komórkach ssaków, wprowadzająca trzy różne plazmidowe DNA: dwa plazmidy o ekspresji białek, które wyrażają fuzję domeny wiążącej DNA GAL4 (DBD) ERα LBD i fuzję VP16AD ERα LBD, oraz plazmid reporterowy o ekspresji lucyferazy sfuzji GAL4RE. Kiedy fuzja GAL4DBD ERα LBD i fuzja VP16AD ERα LBD oddziałują (tworzą dimer) w komórkach, ten kompleks białkowy wiąże się z GAL4RE, a następnie aktywuje ekspresję genu lucyferazy poprzez funkcję transaktywacji zależną od VP16AD. Poziom homodimeryzacji LBD można ocenić na podstawie aktywności lucyferazy.
Test dwuhybrydowy (Y2H) drożdży jest alternatywną metodą opartą na tej samej zasadzie, która wykorzystuje drożdże jako środowisko gospodarza. Poprzednie doniesienia z użyciem systemu Y2H wykazały, że ludzki ERα LBD z obciętą domeną F zwiększa rekrutację koaktywatora zależnego od E2, stwierdzając, że domena F zapobiega transkrypcji za pośrednictwem E24. Wynik ten jest niespójny z innymi raportami, które wykazały osłabioną aktywność transkrypcyjną ludzkiego ERα obciętego w domenie F w komórkach ssaków5,6. Niedawno nasze badanie, przy użyciu systemu M2H, wykazało, że zależna od E2 aktywność rekrutacji koaktywatora ludzkiego ERα LBD jest zmniejszana przez skrócenie domeny F w komórkach ssaków i jest zgodna z aktywnością transkrypcyjną1. Obserwacje te sugerują, że fizjologiczna rola interakcji białko-białko różni się w zależności od typu komórki i kontekstu. Test M2H może wykazać aktywność interakcji białko-białko w tym samym kontekście komórkowym, który jest używany do określania aktywności transkrypcyjnej. Daje to przewagę testu M2H w porównaniu z Y2H lub innymi analizami interakcji białko-białko in vitro.
Pozostają pytania dotyczące molekularnych mechanizmów częściowej agonistycznej aktywności selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (SERM) (np. 4OHT) do regulacji transkrypcji za pośrednictwem ERα. Testy M2H oparte na ERα LBD mogą być stosowane do badania mechanizmu częściowej aktywności agonistycznej SERM w różnych typach komórek ssaków.

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków szach-mat</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik</td> wirówki <td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>Wiadra wahadłowe</td><td>SORVALL</td><td>75006441</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do ponownego zawieszania komórek (CRA)</td><td>Promega</td><td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy komórek (CLA)</td><td>Promega</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizacyjny (NSA)</td><td>Promega</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania kolumn (CWB)</td><td>Promega</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midipreps Żywica oczyszczająca DNA</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>Węgiel inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>: dekstran usuwający płodową surowicę bydlęcą</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>31053028 Gibco</td><td></td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Pasywny bufor do lizy 5X</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>System testów reporterowych z podwójną lucyferazyą</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax L</td><td>Urządzenia molekularne Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja białka ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Uważa się, że funkcja ERαs człowieka i myszy jest identyczna. Wykazujemy różnicowy wpływ 4-hydroksy-tamoksyfenu (4OHT) na aktywność dimeryzacji domeny wiążącej ligand (LBD) u myszy i człowieka za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków (M2H). Test M2H może wykazać skuteczność aktywności homodimeryzacji LBD w komórkach ssaków, wykorzystując transfekcję dwóch plazmidów ekspresji białek (fuzja domeny wiążącej DNA GAL4 [DBD] LBD i fuzja domeny transaktywacji VP16 [VP16AD] LBD) oraz plazmidu reporterowego lucyferazy reagującego na element GAL4 (GAL4RE). Kiedy LBD fuzji GAL4DBD i fuzji VP16AD LBD wytwarzają dimer w komórkach, ten kompleks białkowy wiąże się z GAL4RE, a następnie aktywuje ekspresję genu lucyferazy poprzez aktywność transkrypcyjną zależną od VP16AD. Aktywacja lucyferazy za pośrednictwem 4OHT jest wyższa w komórkach HepG2, które zostały transfekowane mysim plazmidami ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD, niż w ludzkich komórkach transfekowanych plazmidem o ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD. Wynik ten sugeruje, że skuteczność zależnej od 4OHT mysiej aktywności homodimerycznej ERα LBD jest wyższa niż ludzkiego ERα LBD. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie testu M2H nie jest idealne do oceny aktywności dimeryzacji receptora jądrowego LBD, ponieważ agonistyczne ligandy zwiększają podstawowy poziom aktywności LBD, co utrudnia wykrycie aktywności dimeryzacji LBD. Stwierdziliśmy, że 4OHT nie zwiększa podstawowej aktywności ERα LBD. Jest to kluczowy czynnik umożliwiający określenie i wykrycie zależnej od 4OHT aktywności dimeryzacji LBD w celu pomyślnego zastosowania testu M2H. Testy M2H oparte na ERα LBD mogą być stosowane do badania częściowej aktywności agonistycznej selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (np. 4OHT) w różnych typach komórek ssaków.

Rysunek 3 przedstawia schemat możliwych odpowiedzi w komórkach transfected plazmidami w kombinacji (i) i kombinacji (ii). Wyniki eksperymentalne przedstawiono na Rysunku 4. Aktywność kombinacji (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT) wykazuje stymulację przez 10 nM E2 (Rysunek 4A), ponieważ ERα LBD zawiera ligandowo-zależną funkcjonalną domenę transaktywacyjną AF-2. Agonista (np.</em...

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zdolności ligandów estrogenowych do regulacji receptora estrogenowego alfa i mechanizmów selektywnych modulatorów receptora estrogenowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta metoda. Wykazuje zależną od ligandu aktywność dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego alfa w komórkach.Procedurę zademonstruje Tanner Jefferson, doktorant z naszej grupy. Metoda ta wykorzystuje trzy różne plazmidy do wykrywania aktywności dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego w komórkach. pG5-Luc jest plazmidem reporterowym lucyferazy do wykrywania skuteczności aktywności dimeryzacyjnej.Mysi receptor estrogenowy alfa EF pBIND jest czynnikiem transkrypcyjnym reagującym na galaktozę, wiążącym DNA GAL4 z głównym plazmidem o ekspresji domeny wiążącym ligand estrogenowy alfa myszy z nim, który wiąże się z elementem reagującym na GAL4 na reporterze pG5-Luc. mysi receptor estrogenowy pACT alfa EF jest transaktywującym białko segmentowe wirusa opryszczki pospolitej VP16 aktywowane w domenie połączonego mysiego receptora estrogenowego alfa liganda wiążącego plazmid ekspresji domeny, który nie wiąże się bezpośrednio z reporterem pG5-Luc. Gdy obecny jest właściwy ligand, białka pochodzące z plazmidów receptora estrogenowego alfa EF myszy pBIND i plazmidów receptora estrogenowego alfa EF pACT wiążą się przez domenę wiążącą ligand receptora estrogenowego alfa.Skuteczność dimeryzacji zależy od aktywności lucyferazy. Najważniejszym krokiem jest kontrolowanie aktywności białka pochodzącego z mysiego receptora estrogenowego alfa EF pBIND. Aktywność domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa ligand pochodzącej z pBIND w każdym ligandzie bez plazmidu receptora estrogenowego alfa EF pACT musi zostać oceniona przed analizą aktywności dimeryzacji liganda liganda wiążącego ligand receptora estrogenowego zależnej od liganda.Zacznij od dodania odpowiednich kombinacji plazmidów do dwóch 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek na kombinację. Przygotuj dwie kombinacje mieszaniny DNA. Pierwsza probówka zawiera pG5-Luc, pBIND-receptor estrogenowy-alfa EF i puste plazmidy pACT.Druga probówka zawiera plazmidy pG5-Luc, pBIND-receptor estrogenowy-alfa EF i pACT-receptor estrogenowy-alfa EF. Aby wytrącić DNA, dodaj 1/9 objętości mieszaniny DNA trzech molowych octanów sodu i 20X trzymolową objętość octanu sodu 100% etanolu do mieszaniny DNA w każdej probówce i odwiruj probówki. Przechowuj mieszaniny w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc przed odwirowaniem z maksymalną prędkością następnego ranka.Wyrzuć supernatanty i ponownie zawieś niewidoczne granulki w 120 mikrolitrach 75% etanolu na probówkę, uważając, aby spłukać wszelkie DNA przyklejone do wnętrza probówek. Po drugim odwirowaniu w tych samych warunkach wyrzucić supernatanty i wysuszyć DNA w koncentratorze próżniowym przez 30 minut. W celu transfekcji umyj przygotowane ludzkie komórki raka wątrobowokomórkowego dwa razy 0,5 mililitra PBS o temperaturze pokojowej na studzienkę na mycie i nakarm komórki 0,5 mililitra świeżego MEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej 10% pozbawioną węgla drzewnego, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i dwiema milimolowymi L-glutaminami.Następnie zawiesić wysuszoną mieszaninę DNA plazmidu i odczynnik do transfekcji w odpowiedniej objętości DMEM na liczbę dołków w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Dodać równą objętość pożywki odczynnika do transfekcji do każdej probówki z mieszaniną plazmidowego DNA zawieszonego w DMEM. Po 5-10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 25 mikrolitrów mieszaniny DNA do odpowiednich dołków doświadczalnych 24-dołkowej płytki do hodowli komórek ludzkiego raka wątrobowokomórkowego w celu sześciogodzinnej transfekcji w inkubatorze hodowli komórkowej.Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę transfekcyjną 0,5 mililitra świeżego fenolu MEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wolnego od czerwieni, uzupełnionego 10% pozbawionym węgla drzewnego, inaktywowanym termicznie FBS, dwiema milimolowymi L-glutaminą, 1% streptomycyną penicyliny i ligandem na studzienkę i zwróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne 16 do 18 godzin. Następnego ranka umyj komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę i dołącz komórki z każdej studzienki 100 mikrolitrami pasywnego buforu do lizy na studzienkę i energicznie wytrząsaj mieszaczem wirowym. Następnie zamroź lizaty komórkowe w ciekłym azocie.W dniu podwójnego testu lucyferazy potrząśnij lizatami na wytrząsarce, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową i przenieś 10 mikrolitrów lizatu do indywidualnych dołków 96-dołkowej białej płytki z tworzywa sztucznego. Następnie odczytaj aktywność lucyferazy każdej próbki lizatu komórkowego na czytniku mikropłytek. Traktowanie transfekowanych plazmidów plazmidów pACT myszy pBIND z plazmidami alfa EF i pACT 10 nanomolowym estradiolem stymuluje aktywność lucyferazy, ponieważ domena wiążąca ligand receptora estrogenowego alfa zawiera zależną od ligandu domenę funkcyjną transaktywacji, AF-2.Stężenia jedno- i 10-nanomolowe indukują jednak aktywność lucyferazy w komórkach transfekowanych kombinacją plazmidów pBIND i pACT mysiego receptora estrogenowego alfa EF, co sugeruje wykonalność tej procedury do oceny aktywności dimeryzacji domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa liganda przy maksymalnie jednym nanomolowym traktowaniu estradiolem. Leczenie 4-hydroksy-tamoksyfenem nie wywołuje aktywności lucyferazy w komórkach transfekowanych plazmidu pBIND receptora estrogenowego alfa EF i pACT myszy pBIND, co sugeruje, że funkcja AF-2 receptora estrogenowego alfa nie jest aktywowana przez ten ligand. Jednak do 10 stężeń nanomolowych indukuje aktywność lucyferazy w komórkach transfekowanych kombinacją plazmidów pBIND i pACT mysiego receptora estrogenowego alfa EF, co sugeruje, że procedura ta jest wykonalna do oceny aktywności dimeryzacji domeny wiążącej receptor estrogenowy alfa ligand przy maksymalnie 10 nanomolach leczenia 4-hydroksy-tamoksyfenem.Aktywność z połączenia plazmidów ekspresji domeny receptora alfa receptora estrogenowego myszy pBIND i pACT z 4-hydroksy-tamoksyfenem jest znacznie wyższa niż połączenie plazmidów o ekspresji domeny receptora alfa receptora estrogenowego pBIND i pACT dla ludzi. Wskazuje to, że zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego myszy jest silniejsza niż domena wiążąca ligand alfa receptora estrogenowego. Co więcej, zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego myszy zawierającej ludzką domenę F jest znacznie niższa niż w przypadku domeny wiążącej ligand receptora alfa estrogenowego typu dzikiego.W przeciwieństwie do tego, zależna od 4-hydroksy-tamoksyfenu aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej ligand alfa ludzkiego receptora estrogenowego zawierającej mysią domenę F jest znacznie wyższa niż w przypadku domeny wiążącej ligand alfa receptora estrogenowego typu dzikiego. Sugeruje to, że domena F ma wpływ na specyficzną dla gatunku aktywność homodimeryzacji domeny wiążącej receptor alfa liganda receptora estrogenowego zależny od 4-hydroksytamoksyfenu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przetestowaniu podstawowej aktywności domeny wiążącej DNA GAL4 w połączonej lidandowej domenie receptora estrogenowego alfa z ligandem.Działanie to powinno być takie samo jak postępowanie z podłożem.

detecting-ligand-binding-domain-dimerization-activity-estrogen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Ketokonazol wiąże się z aktywacją receptora Pregnane X (PXR) i antagonizuje ją. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów PXR u drożdży definiują unikalny region wiązania ketokonazolu. Ta metoda genetyczna oparta na drożdżach odkrywa nowe interakcje receptorów jądrowych z ligandami, które wiążą się z miejscami wiązania powierzchniowego.

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Ten protokół opisuje znakowanie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) na komórkach fibroblastów COS7, a następnie korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową całych komórek w stanie uwodnionym. Etykieta zawierała fluorescencyjne kropki kwantowe. Protokół może być wykorzystany do badania stechiometrii EGFR na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Badanie stechiometrii receptora naskórkowego czynnika wzrostu w nienaruszonych komórkach przy użyciu mikroskopii korelacyjnej

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Poznaj metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny wiążącej ligand receptora estrogenowego alfa za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów działania selektywnych modulatorów receptora estrogenowego w komórkach.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Przeglądaj więcej filmów