Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie ilościowego testu wiązania DNA, który jest przydatny w badaniu interakcji DNA białek, odkrywaniu transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów oraz w identyfikacji nowych środków przeciwnowotworowych. W tym celu należy najpierw przygotować płytkę testową pokrytą streptawidyną z odpowiednim wzorcem BIOTYNYLOWANEGO DNA. Drugim krokiem jest dodanie białek ekstraktu jądrowego z potencjalnymi inhibitorami lub bez nich i umożliwienie im związania się z celem DNA.

Następnie związane czynniki transkrypcyjne są wykrywane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanu. Ostatnim krokiem jest dodanie do dołków substratu peroksydazy chrzanowej w celu wywołania rozwoju koloru. Ostatecznie rozwój koloru mierzy się za pomocą spektrofotometru.

Z biegiem czasu ilość zmiany koloru będzie wskazywać na stopień wiązania DNA i wpływ potencjalnych inhibitorów wiązania DNA. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, jest to, że jest to ilościowy test wiązania inhibitora DNA. Na początek należy przygotować odpowiednią liczbę kultur komórkowych składających się z co najmniej trzech razy 10 do siedmiu komórek dla każdego badanego stanu.

W tym przypadku wykorzystywane są ludzkie komórki śródbłonka szpiku kostnego, które wyrażają białko run X dwa. Gdy komórki zlewają się w 80%. Potraktuj komórki 0,2 mikrograma na mililitr, bez konazolu, aby zatrzymać wzrost komórek na granicy cyklu komórkowego G 2 M.

To ustabilizuje białko run X two i wytworzy maksymalne wiązanie DNA po 16 godzinach. Lyce komórki i wyizolować białko zgodnie z zaleceniami w dołączonym protokole tekstowym. Po wyizolowaniu białka zmierz stężenie białka za pomocą standardowego testu BCA.

Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w podwielokrotnościach o pojemności 10 mikrolitrów o stężeniach od dwóch do pięciu miligramów na mililitr. Utrwalić 96-dołkową płytkę 0,1-molowym roztworem węglanu sodu, dodając 300 mikrolitrów mieszaniny na. Dobrze Przygotuj się na tyle dobrze, aby każda próbka była prowadzona w trzech egzemplarzach.

Inkubuj płytkę przez dwie godziny na bujanej platformie w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami paciorkowca i przemyj bufor i inkubuj ze 100 mikrolitrami dwuniciowych oligonukleotydów znakowanych biotyną w temperaturze 1,25 nanomoli na studzienkę przez dwie godziny podczas kołysania. Następnie umyj płytki jeszcze trzy razy buforem do płukania strep din.

Następnie dodać 100 mikrolitrów na studzienkę mieszanki głównej zawierającej jedno białko wiążące bufor wiążący DNA XDNA w ilości od trzech do dziewięciu mikrogramów na studzienkę i poli DIGC w ilości jednego mikrograma na studzienkę. Następnie dodać do odpowiednich studzienek mieszaninę wzorcową zawierającą dowolny potencjalny inhibitor, taki jak witamina D, trzy lub odpowiednie rozcieńczenie kontrolnego rozpuszczalnika, takiego jak etanol. Następnie przykryj płytkę i umieść ją na kołyszącej się platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc po inkubacji z ekstraktami jądrowymi.

Umyj płytkę trzykrotnie paciorkowcem avid i przemyj buforem. Następnie dodać 90 mikrolitrów na studzienkę swoistego przeciwciała monoklonalnego typu run X dwa rozcieńczonego do 0,2 nanograma na mikrolitr i paciorkowca i przemywać bufor. Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej na bujanej platformie przez godzinę.

Następnie ponownie przepłukać studzienki paciorkowym avidem i przepłukać buforem i dodać 90 mikrolitrów na studzienkę wtórnej mieszaniny przeciwciał zawierającej pięć nanogramów na mikrolitr fab specyficznego powinowactwa oczyszczonego skoniugowanego przeciwciała HRP rozcieńczonego w paciorkowcach. AVID i bufor do mycia. Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej.

Następnie umyj go sześć razy 300 mikrolitrami na studzienkę Strp i buforem do mycia. Następnie opracuj wyniki, dodając 50 mikrolitrów substratu tetraetylowo-benadynowego do każdej studzienki bezpośrednio z butelki podstawowej w celu ciągłego monitorowania próbek. Umieścić próbki w spektrofotometrze i mierzyć absorbancję przy 635 nanometrach w sposób ciągły.

W przypadku jednorazowego pomiaru należy inkubować próbki przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. W tym czasie studzienki powinny zmienić kolor z przezroczystego na różny stopień niebieskiego. Zatrzymaj reakcję, dodając do każdego 50 mikrolitrów kwasu siarkowego.

Następnie zmierz absorbancję każdej studzienki przy 450 nanometrach za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Przedstawiony wykres jest przykładem ciągłego monitorowania wpływu biologicznie aktywnej witaminy D 3 na wiązanie run X 2D NA. Badane stężenia miały niewielki wpływ na wiązanie run X 2D NA.

Chociaż wykazano, że inne związki witaminy D, trzy mają dramatyczne działanie. Badany tutaj związek 5 2 2 1 9 7 5 został zidentyfikowany przy użyciu komputerowego projektowania leków. Po przetestowaniu związek wykazywał zależne od dawki hamowanie wiązania rux dwa z jednego nanomola na 100 mikromolów, 50% wiązania renx 2D NA było w stanie zahamować przy zaledwie 0,01 mikromola związku.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak przeprowadzić test wiązania DNA i przetestować potencjalne inhibitory wiązania DNA.