Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie ilościowego testu wiązania DNA, który jest przydatny w badaniu oddziaływań białko-DNA, odkrywaniu regulatorów transkrypcyjnych ekspresji genów oraz identyfikacji nowych czynników przeciwnowotworowych. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie płytki testowej pokrytej streptawidyną z odpowiednim BIOTYNYLOWANYM celem DNA. Drugim krokiem jest dodanie białek z ekstraktu jądrowego z potencjalnymi inhibitorami lub bez nich i umożliwienie im związania się z celem DNA.

Następnie związane czynniki transkrypcyjne są wykrywane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych oraz przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową. W ostatnim kroku do dołków dodaje się substrat peroksydazy chrzanowej w celu wywołania reakcji barwnej. Ostatecznie intensywność barwy jest mierzona za pomocą spektrofotometru.

Z czasem stopień zmiany barwy wskaże poziom wiązania DNA oraz efekt potencjalnych inhibitorów wiązania DNA. Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod, takich jak analiza przesunięcia mobilności elektroforetycznej, jest to, że stanowi ona ilościowy test wiązania inhibitorów DNA. Aby rozpocząć, należy przygotować odpowiednią liczbę kultur komórkowych, składających się z co najmniej 3×10⁷ komórek dla każdego badanego warunku.

W tym doświadczeniu wykorzystuje się ludzkie komórki śródbłonka szpiku kostnego, które wykazują ekspresję białka runX2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, należy poddać je działaniu nokozolu w stężeniu 0,2 µg/mL, aby zatrzymać wzrost komórek w fazie G2/M cyklu komórkowego.

Działanie to ustabilizuje białko RunX2 i zapewni maksymalne wiązanie DNA po 16 godzinach. Poddać komórki lizie i wyizolować białko zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole tekstowym. Po wyizolowaniu białka zmierzyć jego stężenie, stosując standardowy test BCA.

Następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C w aliquotach o objętości 10 µL i stężeniach od 2 do 5 mg/mL. Płytkę 96-dołkową przygotować za pomocą 0,1 M roztworu węglanu sodu, dodając 300 µL mieszaniny do każdego dołka. Przygotować odpowiednią liczbę dołków, tak aby każda próbka była analizowana w trzech powtórzeniach.

Inkubować płytkę przez dwie godziny na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć płytkę trzykrotnie 300 µL buforu do mycia strep avid, a następnie inkubować z 100 µL dwuniciowych oligonukleotydów znakowanych biotyną w stężeniu 1,25 nanomoli na dołek przez dwie godziny podczas kołysania. Następnie przemyć płytki dodatkowo trzy razy buforem do mycia strep din.

Następnie należy dodać do każdej studzienki 100 µL master mixu zawierającego 1x bufor wiążący XDNA, białka wiążące DNA w stężeniu od 3 do 9 µg na studzienkę oraz poly DIGC w ilości 1 µg na studzienkę. Następnie do odpowiednich studni należy dodać master mix zawierający potencjalny inhibitor, taki jak witamina D3, lub odpowiednie rozcieńczenie kontroli rozpuszczalnika, np. etanolu. Następnie płytkę należy przykryć i pozostawić na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez noc, po inkubacji z ekstraktami jądrowymi.

Przemyj płytkę trzykrotnie buforem do mycia strep-avid. Następnie dodaj do każdego dołka 90 µL przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla run X dwa, rozcieńczonego do stężenia 0,2 ng/µL w buforze do mycia strep-avid. Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przez jedną godzinę.

Następnie ponownie wypłucz dołki buforem do mycia i strep avid, a następnie dodaj 90 µL na dołek mieszaniny przeciwciał wtórnych zawierającej 5 ng/µL oczyszczonego powinowactwem przeciwciała anty-Fab sprzężonego z HRP, rozcieńczonego w buforze do mycia i strep. AVID. Inkubuj przeciwciała wtórne przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej.

Następnie przemyj go sześciokrotnie 300 µL buforu do mycia i Strp na każdą studzienkę. Kolejnie wywołaj wyniki, dodając do każdej studzienki 50 µL substratu tetraetylobenadyny bezpośrednio z butelki z roztworem zapasowym w celu ciągłego monitorowania próbek. Umieść próbki w spektrofotometrze i mierz absorbancję przy 635 nm w sposób ciągły.

W przypadku pomiaru jednorazowego należy inkubować próbki przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. W tym czasie kolor w dołkach powinien zmienić się z bezbarwnego na niebieski o różnym natężeniu. Reakcję należy zatrzymać, dodając do każdego dołka 50 µL kwasu siarkowego.

Następnie zmierz absorbancję każdej studzienki przy 450 nanometrach za pomocą czytnika płytek 96-dołkowych. Przedstawiony tutaj wykres jest przykładem ciągłego monitorowania wpływu biologicznie aktywnej witaminy D3 na wiązanie run X 2D NA. Przetestowane stężenia miały niewielki wpływ na wiązanie run X 2D NA.

Chociaż wykazano, że inne związki witaminy D3 wywierają gwałtowne efekty, związek 5 2 2 1 9 7 5 przetestowany w tej pracy został zidentyfikowany przy użyciu komputerowo wspomaganego projektowania leków. W badaniach związek ten wykazał zależne od dawki hamowanie wiązania rux two w zakresie od 1 nanomolar do 100 micromolar; 50% wiązania renx 2D NA udało się zahamować przy użyciu zaledwie 0,01 micromolar związku.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak przeprowadzić analizę wiązania DNA oraz przetestować potencjalne inhibitory wiązania DNA.