Name: Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj ilościowy test wiązania DNA do badania interakcji białko-DNA i odkrywania regulatorów transkrypcyjnych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych środków przeciwnowotworowych poprzez pomiar wiązania czynników transkrypcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Za pomoc techniczną i oprzyrządowanie University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, szczególnie dr Rena Lapidus i Mariola Sadowska, dziękujemy za pomoc. Prace odpowiedzialne za opracowanie tego testu zostały częściowo sfinansowane przez NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, nagrodę VA Merit Award dla AP oraz przez University of Maryland Cigarette Restitution Funds (CRF) przekazane Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.

Kilka kroków jest wykonywanych z wyprzedzeniem, a kilka odczynników jest przygotowywanych i przechowywanych przed procedurą: (1) hodowla komórkowa i izolacja białek, (2) przygotowanie oligonukleotydu, (3) przygotowanie 96-dołkowych płytek, (4) inkubacja ekstraktu jądrowego przez noc. Zabieg trwa 2 dni ze względu na całonocną inkubację białka jądrowego z oligonukleotydami DNA.
1. Przygotowanie
1.1 Izolacja białka jądrowego
<ol>
	<li>Bufor hipotoniczny: Aby przygotować 100 ml buforu hipotonicznego, dodać 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 μl (1 M MgCl2), 333 μl (3 M KCl) do 98,3 ml H2O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl. Dla buforu hipotonicznego + NP40 (do użycia w kroku 2.11): Dodać 0,5 ml (10% NP40) do 9,5 ml buforu hipotonicznego dla końcowego 0,5% NP40.</li>
	<li>Bufor o niskiej zawartości soli: Aby przygotować 100 ml buforu o niskiej zawartości soli (do użycia w kroku 2.15), dodać 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glicerolu, 150 μl (1 M MgCl2), 666 μl (3 M KCl), 40 μl (0,5 M EDTA) do 73 ml H2O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 25% glicerol, 1,5 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.</li>
	<li>Bufor o wysokiej zawartości soli: Aby przygotować 100 ml buforu o wysokiej zawartości soli (do użycia w kroku 2.15), dodaj 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glicerolu, 150 μl (1 M MgCl2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 μl (0,5 M EDTA) do 47 ml H2O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 25% glicerolu, 1,5 mM MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.</li>
	<li>10% NP40 Detergent: 10 ml NP40 do 90 ml H2O</li>
	<li>Inhibitory proteazy i fosfatazy [dodawane do buforu hipotonicznego + NP40 (krok 2.11), do buforu o niskiej zawartości soli (krok 2.15) i do buforu o wysokiej zawartości soli (krok 2.15) tuż przed użyciem]: Dodać 2,5 μl (1 M DTT) i 50 μl inhibitorów proteazy (100x) do 5 ml każdego buforu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM DTT i 1x inhibitory proteazy. W skład podstawowej mieszaniny inhibitora proteazy 100x wchodzą: fluorek sodu (Ser/Thr, fosfatazy kwaśne), ortowanaradan sodu (Tyr, fosfatazy alkaliczne), β-glicerofosforan (fosfatazy Ser/Thr), pirofosforan sodu (fosfatazy Ser/Thr), aprotynina (proteazy Ser), Bestatyna (aminopeptydazy), E64 (proteazy cysteinowe), leupeptyna (proteazy Ser/Cys), EDTA (metaloproteazy).</li>
</ol>
1.2 Przygotowanie płytek testowych
<ol>
	<li>Roztwór utrwalający płytki: Aby przygotować 500 ml roztworu, dodać 5,25 g węglanu sodu do 500 ml H2O, dobrze wymieszać i dostosować pH do 9,7 w celu uzyskania końcowego stężenia 0,1 M węglanu sodu.</li>
	<li>Roztwór blokujący płytkę: Aby przygotować podstawowy oligonukleotyd poli dI/dC, ponownie zawiesić 1 jednostkę (~50 mg) poli dI/dC w 1 ml 10 mM Tris/HCl, pH 7,9 zawierającym 1 mM EDTA, aby uzyskać stężenie podstawowe 50 μg/μl. Zapas rozcieńcza się do 1 μg/μl przed użyciem.</li>
</ol>
1.3 płuczące i rozcieńczenia przeciwciał
UWAGA: Bufor do płukania streptawidyny służy do płukania płytek pomiędzy dodatkami oraz do rozcieńczania pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał.
<ol>
	<li>Aby przygotować 1 l buforu do płukania streptawidyny, dodaj 2,4 g Tris/HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20) do 1 l sterylnej filtrowanej wody o pH 7,18. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stężenia końcowe: 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.</li>
</ol>
1.4 Bufor wiążący DNA
UWAGA: Ten bufor jest przechowywany w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Aby przygotować 15 ml buforu wiążącego DNA, dodać 180 μl (1 M HEPES, pH 7,9), 300 μl (3 M KCl), 12 μl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 μl (1 M DTT), 3,0 ml (60% glicerolu), 300 μl (50 μg/μl poli dI/dC) rozcieńczonych dejonizowanym/destylowanymH2O(12 ml). Stężenia końcowe: 12 mM HEPES/pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glicerol, 1 μg/μl poly dI/dC.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i izolacja białek jądrowych
UWAGA: Przygotowanie wymaga około 3 godzin. Stymulacja komórek będzie zależała od eksperymentu. Liczba komórek używanych w każdym eksperymencie będzie się różnić, a wszystkie objętości odzwierciedlają typowy eksperyment z użyciem 3 x 107 komórek na punkt. Dostosuj głośność, aby dostosować się do liczby komórek faktycznie użytej w eksperymencie 6.
<ol>
	<li>Aby przygotować białko jądrowe do testów wiązania DNA, należy wyhodować komórki ludzkie, które wyrażają RUNX2 (śródbłonek, kostniakomięsak, komórki raka piersi) w odpowiednich pożywkach 6.</li>
	<li>Traktuj komórki subkonfluentne nokodazolem (0,2 μg/ml przez 16 godzin) w celu zatrzymania komórek na granicy cyklu komórkowego G2/M 6. W tych warunkach białko RUNX2 jest stabilizowane i osiągane jest maksymalne wiązanie DNA. W ten sposób dostępna jest wystarczająca ilość białka jądrowego do wielu testów, a inhibitory mogą być porównywane z tego samego preparatu.</li>
	<li>Na każdym etapie należy wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C, przygotować i schłodzić przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed pobraniem komórek.</li>
	<li>Schłodzić komórki (4 °C) i przeprowadzić zabiegi na lodzie.</li>
	<li>Odwirować komórki z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut w okrągłodennej probówce z polipropylenu o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przemyć 1x lodowatym PBS (bez Ca2+ i Mg2+).</li>
	<li>Ponownie odwirować i odrzucić supernatant PBS.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu hipotonicznego bez inhibitorów proteazy, uważając, aby całkowicie zawiesić osad komórkowy.</li>
	<li>Przenieść zawartość do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Natychmiast odwirować z prędkością 5 500 obr./min przez 5,5 minuty; wyrzucić supernatant i ZACHOWAĆ osad komórkowy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu hipotonicznego zawierającego 0,5% NP40. Dodać inhibitory proteazy i fosfatazy oraz 0,5 mM DTT (zgodnie z opisem w kroku 1.1.5).</li>
	<li>Pozostawić próbkę na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 10 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant (zawiera białka cytozolowe).</li>
	<li>Zawiesić ponownie osad jądrowy w 60 μl każdego buforu o niskiej zawartości soli (do którego dodano inhibitory proteazy i 0,5 mM DTT z kroku 1.1.5) i bufor o wysokiej zawartości soli (do którego dodano inhibitory proteazy i 0,5 mM DTT z kroku 1.1.5), co daje w sumie 120 μl. Najpierw dodać 60 μl buforu o niskiej zawartości soli do osadu i ponownie zawiesić, Następnie dodać 60 μl buforu o wysokiej zawartości soli. Zwiruj granulkę, aby pomóc w ponownym zawieszeniu.</li>
</ol>
UWAGA: Ten krok pomaga pozbyć się niektórych białek błony jądrowej i przygotować się do etapu lizy: najpierw niska zawartość soli (resuspend pellet, vortex), a następnie wysoka zawartość soli (vortex) optymalizuje ten krok. Trzymaj ekstrakt na lodzie przez 30 minut, z wirowaniem po pierwszych 10 minutach.
<ol start="16">
	<li>Wirować z prędkością 12 000 obr./min przez 15 minut; zachować supernatant zawierający białko jądrowe.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka (starać się utrzymywać próbki w temperaturze 2-5 mg/ml), porcjować w odpowiednich ilościach (10 μl/probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
UWAGA: Szacowana wydajność: 30 x 106 komórek da 5 μg/μl białka w 120 μl. 5 x 106 komórek da 2,2 μg/μl białka w 40 μl.
3. Przygotowanie dwuniciowego oligonukleotydu
<ol>
	<li>Zaprojektuj komplementarne oligonukleotydy z kompatybilnymi półmiejscami na końcach. Dla RUNX2 są to: 5'-CGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATAC TCG -3'-Biotyna (sens) i 5'CGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATT GTGGTTAATACG -3'-Biotyna (antysens).</li>
</ol>
UWAGA: Eksperymenty pilotażowe wykazały, że trzy miejsca wiązania RUNX2 i biotyna znakowana jednym końcem dały najbardziej powtarzalne wyniki.
<ol start="2">
	<li>Przygotować 5x bufor do wyżarzania: Dodać 300 μl (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 μl (1 M MgCl2), 10 μl (1 M DTT) do 260 μl H2O (ostatecznie 600 μl).</li>
	<li>Do 200 pmol każdego jednoniciowego oligonukleotydu (3 μl) dodać 12 μl 5x buforu do wyżarzania i 45 μl H2O, co daje w sumie 60 μl (200 pmol/60 μl).</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut w bloku grzewczym.</li>
	<li>Schłodzić powoli do temperatury 65 °C (ustawiając temperaturę na 65 °C, trwa to 15 minut), a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej, wyłączając zasilanie bloku grzewczego (lub umieszczając w 50 ml wody o temperaturze 65 °C w zlewce na lodzie; trwa to 15-20 minut).</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytek 96-dołkowych
UWAGA: Nie używaj białek mleka w do mycia.
<ol>
	<li>Płytkę utrwalającą z roztworem utrwalającym (0,1 M węglan sodu): dodać 300 μl/basenik.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny, kołysząc w temperaturze pokojowej (RT) lub nie kołysząc w temperaturze 4 °C (O/N).</li>
	<li>Przemyć płytkę 3x buforem do płukania streptawidyny (WB): za każdym razem dodawać 300 μl/studzienkę.</li>
	<li>Dodaj dwuniciowy oligonukleotyd znakowany biotyną (3 zgodne miejsca wiązania na nukleotyd) przez 2 godziny z kołysaniem (1,25 nmol / dołek; 100 μl / dołek).</li>
	<li>Umyj 3x zimnym WB: dodaj 300 μl/studzienkę, a następnie natychmiast odwróć talerz do zlewu i po każdym dodaniu osusz brzegi ręcznikiem papierowym.</li>
</ol>
UWAGA: Nie używaj końcówek pipet do usuwania płynu z płytek, ponieważ może to spowodować zeskrobanie kompleksów avidin:biotyna:DNA ze studzienek. Zrób to dla wszystkich kolejnych etapów prania.
5. Inkubacja z ekstraktem jądrowym
UWAGA: Nie zastępuj DNA plemników łososia lub śledzia buforem blokującym poli dI/dC. Unikaj zatykania talerzy białkami mleka. Oba te czynniki blokujące powodują wysokie wartości tła.
<ol>
	<li>Inkubować ze specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym przygotowanym z ekstraktu jądrowego (90 μl/basenik). Przygotować mieszankę główną zawierającą ekstrakt jądrowy (białko wiążące DNA; 3-9 μg / dołek) + poli dI / dC (1 μg / μl z 50 μg / ul podstawy) w 1x bufor wiążący DNA. Objętość jest potrzebna dla całkowitej wymaganej liczby studzienek (90 μl/studzienkę).</li>
	<li>Na tym etapie dodaje się dowolny potencjalny inhibitor, taki jak witamina D3 (rysunek 2) lub 5221975 związku CADD (rysunek 3), lub odpowiednie rozcieńczenie kontrolnego rozpuszczalnika, takiego jak etanol.</li>
	<li>Umieść talerz na platformie bujanej, O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć 3x z WB: dodać 300 μl/basenik</li>
</ol>
6. Dodanie przeciwciała pierwotnego
UWAGA: Pierwotne roztwory przeciwciał powinny być przygotowywane świeże - przechowywanie nie jest zalecane.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne specyficzne dla RUNX2 (podstawowe 1 μg/μl) 1/5 000 w buforze do płukania streptawidyny. Przygotować wystarczającą ilość do dodania do każdego dołka płytki 96-dołkowej (90 μl/basenik) w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubuj przez 1 godzinę w RT na kołyszącej się platformie.</li>
	<li>Przemyć 3x z WB; dodać 300 μl/dołek.</li>
</ol>
7. Dodanie przeciwciała drugorzędowego
UWAGA: Drugorzędowe rozcieńczenia przeciwciał mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc, jeśli zajdzie taka potrzeba następnego dnia.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone ze sprzężonym z HRP swoiste dla swoistości Fab (7,1 mg / ml zapasów) do 1:1,400 w buforze do płukania streptawidyny: 3,5 μl przeciwciała/5,0 ml buforu do płukania. Przygotować wystarczającą ilość do dodania do każdego dołka płytki 96-dołkowej (90 μl/basenik) w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubuj przez 30 minut w RT na bujanej platformie.</li>
	<li>Umyć 6x z WB, odwracając talerz do zlewu (300 μl/studzienkę).</li>
</ol>
8. Rozwój podłoża HRP i produktu
<ol>
	<li>Dodać 50 μl substratu TMB do dołka bezpośrednio z butelki bulionowej.</li>
	<li>Inkubować 10-20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (metoda zatrzymania reakcji) lub bezpośrednio mierzyć absorbancję (ciągłe monitorowanie kinetyczne).</li>
</ol>
9. Pomiar reakcji
<ol>
	<li>Metoda zatrzymania reakcji: Aby uzyskać wizualną reakcję zatrzymania, sprawdź, czy kolor zmienił się z przezroczystego na niebieski i zatrzymaj reakcję za pomocą 50 μl kwasu siarkowego.</li>
	<li>Pomiar absorbancji przy długości fali 450 nm za pomocą spektrofotometru Biotrak II z czytnikiem płytek widzialnych (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway, NJ, USA) lub podobnym instrumentem.</li>
	<li>Metoda ciągłego monitorowania kinetycznego: Dodać substrat po ostatnim praniu i tuż przed umieszczeniem w spektrofotometrze (nie przerywać reakcji).</li>
	<li>Pomiar absorbancji przy długości fali 635 nm za pomocą spektrofotometru Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) lub podobnym instrumentem.</li>
</ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li>
<li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497(2009).</li>
<li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TransLISA%2C+a+novel+quantitative%2C+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li>
<li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li>
<li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+%28cholecalciferol%29+prohormone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li>
<li>Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+P+%22Biotek+Instruments+Application+Note%22">Biotek Instruments Application Note</a>. , Biotek. 
	Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf">http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf</a> (2007).</li>
<li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21(2001).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+I+inhibitors%3A+chemistry%2C+biology%2C+and+interfacial+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Testy wiązania DNA służą do pomiaru zdolności czynników transkrypcyjnych do interakcji z DNA. Testy wiązania DNA obejmują przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) 1 i testy oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) 3 , a także testy wykorzystujące formaty 96-dołkowe 4 , takie jak testy chemiluminescencyjne 2. EMSA jest nieilościowa i wykorzystuje oligonukleotydy znakowane radioaktywnie (32P). Są one inkubowane z białkami jądrowymi, a kompleksy wiążące ...

Testy wiążące DNA są użyteczne w pomiarze zdolności czynników transkrypcyjnych do interakcji z DNA. Testy wiązania DNA obejmują testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), które zależą od znakowanych radioaktywnie oligonukleotydów 1 lub testów chemiluminescencyjnych 2. Opisano również testy oparte na immuneprecypitacji chromatyny (ChIP) 3 oraz testy wykorzystujące formaty 96-dołkowe 4. Jednak EMSA jest testem nieilościowym, który wymaga użycia oligonukleotydów znakowanych radioaktywnie. Kiedy białka jądrowe łączą się ze specyficznymi sekwencjami promotora nukleotydów, kompleksy wiążące są opóźniane na żelach poliakrylamidowych, a specyficzny czynnik transkrypcyjny można zwalidować za pomocą przeciwciała "supershift". Opracowaliśmy ilościowy test wiązania DNA przy użyciu formatu immunoenzymatycznego (D-ELISA), który jest w stanie zmierzyć interakcję RUNX2 z sekwencjami wiążącymi DNA odpowiadającymi zdefiniowanym elementom promotora w docelowych genach RUNX2. Zastosowanie przeciwciała anty-RUNX2 zapewnia specyficzność testu, a brak znakowania radioaktywnego odróżnia ten test od tradycyjnego testu przesunięcia żelu 5. Wykrywanie kompleksów wiążących jest możliwe dzięki zastosowaniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), które przekształca substrat HRP, tetrametylobenzydynę (TMB) w barwny produkt do analizy spektrofotometrycznej. Opisany tutaj test może obejmować wykorzystanie zmutowanych oligonukleotydów DNA jako kontroli i może być stosowany do wykrywania konkurencyjnych lub niekonkurencyjnych inhibitorów wiązania DNA. Dzięki temu testowi możliwe jest również badanie przesiewowe nowych związków przeciwnowotworowych.

<table><tbody><tr><td>Poly dI/dC</td><td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td><td>US20539-5UN</td><td>1 U ~50mg</td></tr><tr><td>Przeciwciało RUNX2</td><td>MBL International Corp., Woburn, MA</td><td>D130-3</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone z peroksydazą specyficzną dla Fab</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9917</td><td>7,1 mg / ml</td></tr><tr><td>TMB Substrat (tetrametylobenzydyna)</td><td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td><td>X1189S</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>57995</td> Kwas siarkowy <td>do mocowania płytek</td></tr><tr><td></td><td>VWR, West Chester, PA</td><td>BDH-39922-1</td><td>Roztwór zatrzymujący</td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe</td><td>Greiner Bio-One, Bazylea, Szwajcaria</td><td>655996</td><td>Powlekane Avidin, czarne strony</td></tr><tr><td>HALT</td><td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td><td>78440</td><td>Inhibitory proteazy i fosfatazy</td></tr><tr><td>Chemikalia</td><td>Różni producenci</td><td>Klasa</td><td></td> laboratoryjna</tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Odczynniki</td></tr><tr><td>Spektrofotometr: Biotrak II Czytnik płytek widzialnych</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td>Do użytku z metodą reakcji zatrzymania</td></tr><tr><td>Spektrofotometr: Bio-Tek Synergy HT Czytnik mikropłytek wieloreakcyjnych</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td><td></td><td>Do użytku z ciągłym monitorowaniem kinetycznym</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Sprzęt</mocny></td></tr></tbody></table>

test ilościowy do badania interakcji białko-dna, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Wiele testów wiążących DNA, takich jak testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), testy chemiluminescencyjne, testy oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i testy oparte na wielu dołkach są używane do pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego. Jednak testy te są nieilościowe, brakuje im swoistości, mogą wiązać się z użyciem znakowanych radioaktywnie oligonukleotydów i mogą nie być przystosowane do badań przesiewowych inhibitorów wiązania DNA. Z drugiej strony, używając ilościowego testu immunoenzymatycznego związanego z enzymem wiążącym DNA (D-ELISA), wykazujemy interakcje białek jądrowych z DNA za pomocą czynnika transkrypcyjnego RUNX2, które zależą od specyficznego związku z konsensusowymi sekwencjami wiążącymi DNA obecnymi na oligonukleotydach znakowanych biotyną. Opisano przygotowanie komórek, ekstrakcję białka jądrowego i projektowanie dwuniciowych oligonukleotydów. 96-dołkowe płytki pokryte awidyną utrwala się buforem alkalicznym i inkubuje z białkami jądrowymi w buforze blokującym nukleotydy. Po intensywnym myciu płytek, po inkubacji swoistych przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych dodaje się substrat peroksydazy chrzanowej i rozwija się reakcja kolorymetryczna. Do ilościowego pomiaru interakcji białka z DNA wykorzystano tryb zatrzymania reakcji lub ciągłe monitorowanie kinetyczne. Omówiono odpowiednie kontrole swoistości, w tym leczenie nieswoistymi IgG lub bez białka lub przeciwciała pierwszorzędowego. Opisano zastosowania testu, w tym jego przydatność w badaniach przesiewowych leków oraz omówiono reprezentatywne wyniki pozytywne i negatywne.

Metoda D-ELISA jest wysoce specyficzna dla wyznaczonego białka wiążącego DNA, pod warunkiem zastosowania specyficznego sekwencyjnie, dwuniciowego oligonukleotydu zawierającego trzy kopie konsensusowej sekwencji wiązania RUNX2 (ACACCA). Specyficzność zwiększa również przeciwciało pierwszorzędowe rozpoznające dany czynnik białkowy. Przeciwciało drugorzędowe zawiera kowalencyjnie związaną peroksydasę chrzanową (HRP), która przekształca bezbarwny substrat (tetrametylbenzydynę) w barwny produkt, co ułatwia detekcję (R...

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA. Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie ilościowego testu wiązania DNA, który jest przydatny w badaniu oddziaływań białko-DNA, odkrywaniu regulatorów transkrypcyjnych ekspresji genów oraz identyfikacji nowych czynników przeciwnowotworowych. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie płytki testowej pokrytej streptawidyną z odpowiednim BIOTYNYLOWANYM celem DNA. Drugim krokiem jest dodanie białek z ekstraktu jądrowego z potencjalnymi inhibitorami lub bez nich i umożliwienie im związania się z celem DNA.Następnie związane czynniki transkrypcyjne są wykrywane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych oraz przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową. W ostatnim kroku do dołków dodaje się substrat peroksydazy chrzanowej w celu wywołania reakcji barwnej. Ostatecznie intensywność barwy jest mierzona za pomocą spektrofotometru.Z czasem stopień zmiany barwy wskaże poziom wiązania DNA oraz efekt potencjalnych inhibitorów wiązania DNA. Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod, takich jak analiza przesunięcia mobilności elektroforetycznej, jest to, że stanowi ona ilościowy test wiązania inhibitorów DNA. Aby rozpocząć, należy przygotować odpowiednią li

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa metoda badania interakcji białko:DNA, odkrywanie regulatorów transkrypcji ekspresji genów i identyfikowanie nowych środków przeciwnowotworowych

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj ilościowy test wiązania DNA do badania interakcji białko-DNA i odkrywania regulatorów transkrypcyjnych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych środków przeciwnowotworowych poprzez pomiar wiązania czynników transkrypcyjnych.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Przeglądaj więcej filmów