Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

Protokół ten jest znaczący, ponieważ wykorzystuje metodę wizualizacji bez plam zamiast wizualizacji opartej na barwniku na pośmiertnej tkance mózgowej człowieka, co pomaga zachować integralność RNA. Zachowanie RNA jest dużą zaletą w tym protokole, ponieważ jest przydatne nie tylko w pośmiertnej ludzkiej tkance mózgowej, ale także w innych typach tkanek o wysokiej aktywności RNazy. Na początek wyjmij chusteczkę z zamrażarki i umieść ją na suchym lodzie w celu transportu do kriostatu.

Umieść czyste szczotki, uchwyt i chusteczkę w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby mogły osiągnąć optymalną temperaturę. W przypadku kriostatów z dwiema komorami i temperaturami przechowywania próbek należy ustawić temperaturę obiektu na minus 16 stopni Celsjusza, a temperaturę komory na minus 18 stopni Celsjusza. Ustaw grubość przekroju kriostatu na 14 mikrometrów, a grubość przycinania na 30 mikrometrów.

Następnie wyczyść scenę mieszaniną jeden do jednego odkażacza RNazy i 70% etanolu, aby zapobiec zamarzaniu. Zaopatrz się w nowe, jednorazowe ostrze kriostatu i wyczyść je odkażaczem RNazy. Umieść oczyszczone ostrze w uchwycie ostrza na scenie.

Następnie wyczyść płytkę zapobiegającą przewróceniu za pomocą dekontaminatora RNazy. Przymocuj oczyszczoną płytkę do stolika i odczekaj co najmniej 20 minut, aż ostrze i płyta zapobiegająca przetaczaniu się spadną do temperatury kriostatu. Najpierw wytnij mały kawałek tkanki do cięcia, upewniając się, że przekrój składa się w około 95% z kory móżdżku.

Umieść pozostałą tkankę z powrotem w suchym lodzie lub w zamrażarce, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie zacznij powoli dodawać OCT na wierzch uchwytu powolnymi, okrężnymi ruchami. Buduj warstwy OTC, aż uchwyt zostanie pokryty mocowaniem o wysokości około trzech milimetrów.

Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale nadal ma trochę płynu w środku, umieść chusteczki na wierzchu mocowania. Pozostaw tkankę na wierzchu OCT na jedną do dwóch minut, aż całkowicie się zamrozi. Następnie przenieś uchwyt z zamrożonym OCT i tkanką do ramienia tnącego kriostatu.

Wyreguluj tkankę tak, aby zlicowała z ostrzem tnącym i pozostaw chusteczkę w ramieniu tnącym przez 20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury. Najważniejszym krokiem jest umożliwienie tkance aklimatyzacji w ramieniu tnącym kriostatu tak długo, jak to konieczne. Jeśli tkanka ulega rozdarciu, wizualizacja komórek Purkiniego będzie bardzo trudna.

Polecam stosowanie mniejszych, cieńszych kawałków tkanki, aby tkanka mogła się szybciej zaaklimatyzować. Następnie powoli przesuń tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania.

Przytnij tkankę dwa do trzech razy, aż warstwy kory będą widoczne. Następnie umieść i wyrównaj płytkę zapobiegającą przetaczaniu się tuż nad ostrzem kriostatu. Wytnij od czterech do sześciu odcinków o grubości 14 mikrometrów, zwracając uwagę, że prawidłowo przycięte sekcje będą płaskie pod płytą stabilizatora.

Wyrównaj wycięte sekcje poziomo w poprzek stolika kriostatu. Ustaw suwak pod kątem, aby jednocześnie podnieść wszystkie kawałki tkanki. Natychmiast po przecięciu tkanki umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 70% etanolem na lodzie na dwie minuty.

Przenieś szkiełko do uchwytu na szkiełko z 95% etanolem na lodzie na 45 sekund. Następnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka ze 100% etanolem w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Zanurz szkiełko trzykrotnie w uchwycie szkiełka zawierającym ksylen numer jeden w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z ksylenem dwa w temperaturze pokojowej na pięć minut. Umieść szkiełka w czystym dygestorium i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Jeśli przechowujesz szkiełka, umieść każdą z nich w osobnej 50-mililitrowej tubie i umieść probówki w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na okres do siedmiu dni.

Najpierw użyj dekontaminatora RNazy, aby wyczyścić stolik mikroskopu i ramię zbierające nakrętki. Rękami w rękawiczkach umieść szkiełko na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 mikrolitrów w ramieniu zbiorczym. Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar, który jest widoczny w okularze.

Użyj obiektywu od pięciu do 10 razy, aby uwidocznić warstwy móżdżku. Umieść kursor nad sekcją, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórek ziarnistych. Przejdź do 40-krotnego powiększenia i wizualizuj komórki Purkinjego.

Następnie zacznij je chwytać. Aby rozpocząć zbieranie RNA po mikrodysekcji, dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy komórek do nieprzezroczystej czapeczki z czapeczką skierowaną do góry. Ostrożnie zamknij probówkę nad nakrętką i kontynuuj pobieranie zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W tym protokole świeża, zamrożona, pośmiertna ludzka tkanka mózgowa jest przygotowywana do mikrodysekcji wychwytu laserem UV. Po przecięciu kriostatu w wyznaczonym czasie ciągnienia, warstwy komórkowe móżdżku są łatwo widoczne za pomocą pięciokrotnie i 10-krotnie większych soczewek obiektywowych. Jak widać tutaj, prawidłowa inkubacja ksylenu powoduje, że tkanka staje się ciemniejsza i lepiej wyznacza warstwy komórkowe niż sam etanol.

Podczas cięcia pod mikroskopem laserowym wymagana jest 40-krotna soczewka obiektywowa, aby zapewnić uchwycenie tylko komórek Purkinjego, a nie otaczającej tkanki. Jak widać tutaj, właściwa inkubacja w ksylenie daje wysokiej jakości morfologicznie nienaruszony obraz w porównaniu z samym utrwalaniem etanolu. Zdolność szkiełka nakrywkowego nieprzezroczystej nasadki jest następnie testowana, podczas gdy inne protokoły wykorzystują nasadkę wypełnioną płynem, te nasadki mogą zmniejszyć wizualizację tkanek i spowodować, że uzyskany obraz będzie ziarnisty i opalizujący pod mikroskopem.

Jednak wizualizacja za pomocą nieprzezroczystej nasadki powoduje, że tkanka wygląda na wygładzoną, bardziej miękką i ostrzejszą w formie. Reprezentatywne obrazy wyciętych komórek Purkinjego przy małej mocy i przy dużej mocy pokazują precyzyjne usunięcie samego ciała komórki Purkinjego. Następnie uzyskuje się wysokiej jakości Rnazę do późniejszego sekwencjonowania RNA.

Sześć reprezentatywnych próbek poddano ekstrakcji RNA i ponownie zawieszono w 14 mikrolitrach wody wolnej od rnazy, a wszystkie sześć próbek wytworzyło wysokiej jakości RNA o liczbie integralności RNA równej lub większej niż osiem. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że jakość tkanek jest wszystkim. Nawet cięcie i umieszczanie suwaków może stworzyć lub zepsuć ten protokół.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować dowolną metodę, która bada RNA lub DNA, w szczególności badamy nasze RNA pod kątem zróżnicowanej ekspresji genów, ale można również zbadać inne kwestie dotyczące regulacji genów. Metodę tę można zastosować do każdego typu tkanki, która ma specyficznie określoną morfologię, która nie wymaga użycia antygenu lub odczynników specyficznych dla barwnika do identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Mamy nadzieję, że ta technika pomoże nam zrozumieć genetykę drżenia samoistnego i innych chorób, które mają fenotyp drżenia.

Najbardziej niebezpieczną substancją chemiczną stosowaną w tym protokole jest ksylen. Należy się z nim odpowiednio obchodzić w dygestorium, odpowiednio zutylizować, a szkiełka należy pozostawić do odpowiedniego wyschnięcia do czasu użycia na otwartej przestrzeni. Ponadto podczas pracy z próbkami ludzkimi należy stosować gospodarkę odpadami niebezpiecznymi biologicznie i bezpieczeństwo.