Name: Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj bezbarwny protokół izolacji RNA z komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku przy użyciu mikroskopii laserowej. Ta metoda zachowuje integralność RNA do sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować The New York Brain Bank, dr Jean Paul Vonsattel i dr Etty Cortés, za pomoc w cięciu i przechowywaniu próbek zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej do tych eksperymentów. Autorzy chcieliby podziękować osobom, które hojnie przekazały swój mózg na rzecz kontynuowania badań nad drżeniem samoistnym. Dr Faust i dr Martuscello chcieliby podziękować Wydziałowi Patologii i Biologii Komórki Uniwersytetu Columbia za ich nieustające wsparcie i kluczową przestrzeń badawczą. Autorzy pragną podziękować NIH R01 NS088257 Louis/Faust) za finansowanie badań w ramach tego projektu. Obrazy LCM wykonano w Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource of the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, wspieranym przez grant NIH #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Autorzy pragną podziękować Theresie Swayne i Laurze Munteanu za ich nieustającą pomoc w zakresie specjalistycznej mikroskopii.

Wszystkie próbki ludzkie wykorzystane w tym protokole zostały uzyskane za świadomą zgodą i zostały zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną (IRB) na Uniwersytecie Columbia i Uniwersytecie Yale.
UWAGA: Całość tego protokołu powinna być zgodna ze ścisłymi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z RNA, gdzie zawsze używa się dłoni w rękawiczce, wszystkie powierzchnie są czyszczone dekontaminatorem RNazy, a wszystkie materiały robocze są wolne od RNA/DNA/nukleazy.
1. Przetestuj integralność RNA tkanki przed rozpoczęciem LCM
UWAGA: Testowanie jakości RNA można przeprowadzić wieloma metodami. Upewnij się, że RNA z całego przekroju jest badany w celu uzyskania reprezentatywnego numeru integralności RNA (RIN) dla próbki.
<ol>
	<li>Starannie wybrać próbki tkanek do włączenia, które mieszczą się w parametrze projektu eksperymentalnego. Jeśli tniesz na kriostacie, przejdź do kroku 1.2. Jeśli nie, odpowiednio przetrzyj tkankę i przejdź do kroku 1.11.</li>
	<li>Zdobądź dwa pojemniki z suchym lodem. Rozmiar będzie zależał od liczby próbek.
	<ol>
		<li>W pierwszym pojemniku z suchym lodem umieść pustą, oznaczoną probówkę o pojemności 2 ml kodem tkanki. 
		UWAGA: Zamrożenie probówek zajmuje 10 minut. Probówki muszą zostać zamrożone przed umieszczeniem w nich tkanki; W przeciwnym razie tkanka stopi się na powierzchni rurki.</li>
		<li>W drugim pojemniku z suchym lodem umieść tkankę z zamrażarki o temperaturze -80 °C, która wymaga kontroli RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść kriostat. Zobacz krok 4.7, aby uzyskać szczegółową procedurę czyszczenia.</li>
	<li>Usuń tkankę z suchego lodu i odetnij niewielką część tkanki za pomocą odkażonej żyletki odkażonej przez RNazę. Tkanka powinna mieć wymiary około 1 cm x 1 cm.</li>
	<li>Umieścić kopiec o wysokości około 3 mm ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na "uchwycie" kriostatu i pozostawić do częściowego zamrożenia. Następnie umieść tkankę na wierzchu OCT - nie wpychaj się do OCT, po prostu pozwól jej spocząć na wierzchu.</li>
	<li>Gdy OCT stwardnieje, umieść uchwyt z zamontowaną tkanką w ramieniu tnącym kriostatu i ustaw przed ostrzem kriostatu.</li>
	<li>Przycinaj na odcinkach 30 μm, aż tkanka będzie równa.</li>
	<li>Wytnij 300 μm tkanki i umieść w zamrożonej probówce o pojemności 2 ml. Umieść probówkę z powrotem w suchym lodzie.</li>
	<li>Wyjmij chusteczkę z "uchwytu" i umieść ją z powrotem w suchym lodzie, aż będzie gotowa do odłożenia.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.4–1.9 dla wszystkich tkanek.</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki są kompletne, wyekstrahuj RNA za pomocą dostarczonego zestawu do ekstrakcji RNA (Tabela materiałów #15). Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem do ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami, w tym z opcjonalnym krokiem suszenia membrany probówki zbiorczej i opcjonalnym krokiem mineralizacji DNazy (Tabela materiałów #16).</li>
	<li>Przetestuj integralność wyekstrahowanego RNA za pomocą bioanalizatora oceny jakości14.</li>
</ol>
2. Przygotuj się przed rozpoczęciem sekcji dla LCM
<ol>
	<li>Wyczyść uchwyty szkiełek przed każdą rundą cięcia tkanek pod kątem LCM. Wykonaj procedurę czyszczenia dzień przed użyciem, aby umożliwić całkowite wyschnięcie przez noc. 
	UWAGA: Uchwyty szkiełek służą do utrwalania wycinków tkanek w etanolu i oczyszczania w ksylenie.
	<ol>
		<li>Procedura czyszczenia uchwytu szkiełka: Spłukać środkiem odkażającym RNazy, a następnie wodą uzdatnioną pirowęglanem dietylu (DEPC). Pozostaw do wyschnięcia na noc do góry nogami na powierzchni wolnej od RNA/DNA/nukleazy, unikając kurzu lub innych zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu. 
		ostrożność: DEPC jest wysoce toksyczny i powinien być traktowany i utylizowany zgodnie ze standardowym protokołem EH&S dotyczącym niebezpiecznych chemikaliów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść szczotki do cięcia za pomocą dekontaminatora RNazy i pozostaw do wyschnięcia na noc. Unikaj kurzu i innych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Umieść szkiełka membranowe w świetle UV na 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie wystawiaj szkiełek na działanie promieniowania UV wcześniej niż 1–2 dni przed użyciem. Zwiększa to wiązanie tkanki ze szkiełkiem membranowym. 
	UWAGA: Krok 2.3 można połączyć z Krokiem 4, który pozwala na zabieg UV w tym samym dniu, w którym następuje cięcie tkanek (patrz Krok 4.4).</li>
</ol>
3. Przygotuj roztwory utrwalające z wodą wolną od RNaz i wysokiej jakości etanolem
UWAGA: Wszystkie roztwory są przygotowywane na świeżo dla każdego eksperymentu. Upewnij się, że procedura czyszczenia uchwytu szkiełka od kroku 1.1 została zakończona. Wszystkie rozwiązania przygotowywane są w uchwytach na prowadnice.
<ol>
	<li>Umieść 30 ml 100% etanolu w jednym uchwycie na szkiełka.</li>
	<li>Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz/nukleaz. Umieść 30 ml 95% etanolu w jednym szkiełku i połóż na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz/nukleaz. Umieść 30 ml 70% etanolu w jednym uchwycie na szkiełko i połóż na lodzie.</li>
	<li>Umieść 30 ml 100% ksylenu w dwóch oddzielnych uchwytach na szkiełka i oznacz je jako #1 i #2.</li>
</ol>
4. Przygotowanie kriostatu do cięcia tkanek
<ol>
	<li>Zaopatrz się w wiadro lodu na roztwory etanolu i pojemnik z suchym lodem na chusteczkę. 
	ostrożność: Suchy lód jest bardzo zimny, dlatego należy używać rękawic ochronnych. Nie umieszczaj lodu i suchego lodu w tym samym pojemniku. Różne temperatury lodu i suchego lodu spowodują, że utworzą się one razem w nieokreślonej temperaturze.</li>
	<li>Wyjmij chusteczkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść ją na suchym lodzie w celu transportu do kriostatu.</li>
	<li>Ustawienia kriostatu:
	<ol>
		<li>Ustaw grubość przekroju na 14 μm.</li>
		<li>Ustaw grubość przycinania na 30 μm, aby zachować ilość tkanki.</li>
		<li>W przypadku kriostatów z temperaturą dwukomorową i temperaturą przechowywania próbek, należy ustawić temperaturę komory (CT) na -18 °C. W przypadku kriostatów z jednym ustawieniem należy ustawić temperaturę na -17 °C.</li>
		<li>W przypadku kriostatów z podwójną komorą i temperaturą przechowywania próbek, ustaw temperaturę obiektu (OT) na -16 °C. 
		UWAGA: OT musi być cieplejszy niż CT, aby zapewnić równomierne cięcie. Jeśli tkanka nadal się rozdrabnia, OT można zwiększyć do -15 °C, a CT do -18 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść tkankę w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby umożliwić osiągnięcie optymalnej temperatury. 
	UWAGA: Jeśli tkanka nie ma optymalnej temperatury, rozpadnie się podczas cięcia. Nie umieszczaj tkanki w temperaturze -20 °C poprzedniej nocy, aby zachować integralność RNA i zapobiec tworzeniu się kryształków lodu. Pozwól tkance na tyle czasu, ile to konieczne, aby zrównoważyć się do optymalnej temperatury, aby ciąć płynnie. W tym przypadku może wystąpić fakultatywne zastosowanie inkubacji szkiełek w promieniowaniu UV (patrz krok 1.3).</li>
	<li>Umieść "uchwyt" w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby umożliwić mu zejście do temperatury kriostatu.</li>
	<li>Umieść czyste szczotki w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby pozwolić zejść do temperatury kriostatu.</li>
	<li>Wyczyść kriostat
	<ol>
		<li>Oczyść scenę mieszaniną 1:1 odkażacza RNazy i 70% etanolu rozcieńczoną wodą wolną od RNA/DNA/nukleazy, aby zapobiec zamarzaniu na scenie.</li>
		<li>Wyczyść nowe jednorazowe ostrze kriostatu za pomocą dekontaminatora RNazy i umieść w uchwycie ostrza na scenie. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż ostrze kriostatu osiągnie temperaturę kriostatu.</li>
		<li>Wyczyść płytkę zapobiegającą przetaczaniu się za pomocą dekontaminatora RNazy i przymocuj do stolika. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż płyta stabilizująca przechylenie osiągnie temperaturę kriostatu. 
		UWAGA: Płyta zapobiegająca przechylaniu się nie jest wymagana do cięcia, ale jest wysoce zalecana. Jeśli płyta zapobiegająca staczaniu się nie jest dostępna, alternatywą jest oczyszczona szczotka. Jeśli płyta zabezpieczająca nie ma odpowiedniej temperatury, tkanka stopi się lub przyklei podczas cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sekcja tkanki
<ol>
	<li>Wytnij mały kawałek tkanki (~1 cm x 1 cm) do przekrojenia. Włóż pozostałą chusteczkę do zamrażarki z suchym lodem/-80 °C. 
	UWAGA: Upewnij się, że sekcja tkanki składa się w ~95% z kory móżdżku, w której znajdują się komórki Purkinjego.</li>
	<li>Umieść kopiec OCT o wysokości około 3 mm, aby przykryć "uchwyt". Zacznij od budowania warstw na wierzchu powolnym, okrężnym ruchem, aż powstanie mały kopiec.</li>
	<li>Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale w środku nadal znajduje się trochę płynu, umieść tkankę na wierzchu OCT. Nie wpychaj tkanki głęboko do OCT. Pozwól chusteczce usiąść na wierzchu OCT, aż do całkowitego zamrożenia. Zajmie to 1–2 minuty.</li>
	<li>Umieść "uchwyt" z zamrożonym OCT i tkanką w ramieniu tnącym kriostatu. Wyreguluj tkankę tak, aby była równo z ostrzem tnącym.</li>
	<li>Pozostaw tkankę w ramieniu tnącym na 15–20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury. 
	UWAGA: W zależności od grubości tkanki potrzebny jest czas na aklimatyzację do temperatury. Pozwól chusteczce siedzieć tak długo, jak to konieczne, aby ciąć czysto. Dostosuj OT i CT, aby pomóc w aklimatyzacji do temperatury tkanek.</li>
	<li>Powoli przesuwaj tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania. Grubość wykończenia należy ustawić na 30 μm.</li>
	<li>Przytnij 2–3 razy, aż warstwy kory będą widoczne.</li>
	<li>Umieść i wyrównaj płytkę zabezpieczającą tuż nad ostrzem kriostatu. 
	UWAGA: Srebrna linia pojawi się ze światła w kriostacie na styku ostrza i płytki zapobiegającej przetaczaniu. Oznacza to, że płyta stabilizująca przechylanie się znajduje się bezpośrednio nad krawędzią ostrza.</li>
	<li>Rozpocznij cięcie sekcji z prędkością 14 μm. Prawidłowo przycięte sekcje będą płasko pod płytą zabezpieczającą. 
	UWAGA: Jeśli chusteczka jest zablokowana, upewnij się, że płytka zapobiegająca przetaczaniu się jest wystarczająco zimna. W razie potrzeby umieszczenie kawałka suchego lodu na zewnątrz (strona nie dotykająca sceny) szybko schłodzi płytę stabilizacyjną.</li>
	<li>Wytnij 4–6 sekcji i wyrównaj je poziomo w poprzek stolika kriostatu.</li>
	<li>Ustawiając szkiełko pod kątem, podnieś wszystkie kawałki tkanki za jednym razem. 
	UWAGA: Za pomocą szczotek podnieś końce chusteczki, aby były łatwiej dostępne dla szkiełka po podniesieniu. Nie podnoś jednej sekcji na raz. Wystawienie na działanie powietrza o temperaturze pokojowej pogorszy integralność RNA. 
	ostrożność: Nie pozwól, aby membrana dotykała stopnia kriostatu. Jeśli membrana dotknie stolika, zacznie odłączać się od szkiełka i spowoduje błędy podczas próby LCM.</li>
	<li>Natychmiast przejdź do kroku 6. Nie zwlekaj z fiksacją.</li>
</ol>
6. Utrwalanie tkanki/wizualizacja bez plam
<ol>
	<li>Natychmiast przejdź do protokołu utrwalania etanolu</li>
	<li>Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 70% etanolem na 2 minuty — na lodzie.</li>
	<li>Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 95% etanolem na 45 s — na lodzie.</li>
	<li>Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka ze 100% etanolem na 2 minuty — w temperaturze RT.</li>
	<li>Zanurz szkiełko 3 razy w uchwycie szkiełka z ksylenem 1 — przy suchej temperaturze (RT).</li>
	<li>Umieść szkiełko w uchwycie szkiełek z ksylenem 2 na 5 minut — w temperaturze RT.</li>
	<li>Pozostawić do wyschnięcia w czystym miejscu przez co najmniej 30 minut. Optymalny jest dłuższy czas schnięcia, do 60 min. 
	ostrożność: Szkiełka stojące do suszenia w dygestorium. Ksylen jest lotny. Ułożenie szkiełek na płasko spowoduje, że ksylen będzie gromadził się w sekcji tkankowej, co spowoduje, że tkanka będzie zbyt ciemna.</li>
</ol>
7. Opcjonalnie — Przechowywanie slajdów
<ol>
	<li>Umieścić wysuszone szkiełka w pojedynczych probówkach o pojemności 50 ml (po jednym szkiełku na probówkę) i umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C na okres do 7 dni. 
	UWAGA: Szkiełka muszą być suche przed umieszczeniem w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Nie używaj środka osuszającego wewnątrz tuby, ponieważ cząstki stałe osadzają się w tkance i membranie. Upewnij się, że nasadka rurki jest szczelna; Jeśli nie, podczas rozmrażania przed użyciem na szkiełku wystąpi kondensacja. 
	ostrożność: Integralność RNA zmniejsza się po 7 dniach, podobnie jak jakość wizualizacji tkanek.</li>
</ol>
8. Rozmrażanie przechowywanych preparatów do użytku
<ol>
	<li>Wyjąć probówkę za pomocą jednego szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C na 1 godzinę przed planowanym użyciem.</li>
	<li>Nie otwieraj rurki od razu. Pozwól, aby rurka osiągnęła temperaturę pokojową. Kondensacja wystąpi tylko na zewnątrz rury.</li>
	<li>Gdy rurka osiągnie temperaturę pokojową i cała kondensacja zniknie (około 30–40 min), zdejmij nasadkę i wystawij szkiełko na działanie powietrza o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozwól szkiełku zaaklimatyzować się do temperatury pokojowej przez 15–20 minut. Pozostaw szkiełko wewnątrz rurki ze zdjętą nakrętką. 
	UWAGA: Zjeżdżalnia jest teraz gotowa do LCM.</li>
</ol>
9. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji komórek Purkinjego:
UWAGA: Ta sekcja protokołu będzie omawiać tylko szczegóły związane z przechwytywaniem komórek Purkinjego do późniejszego sekwencjonowania RNA. W tej sekcji założono, że użytkownik jest zaznajomiony z mikroskopem laserowym UV i powiązanym oprogramowaniem.
<ol>
	<li>Wyczyść stolik mikroskopu i ramię zbierające nakrętki za pomocą odkażacza RNazy.</li>
	<li>Dłońmi w rękawiczkach umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 μl w ramieniu do pobierania danych. 
	UWAGA: Zawsze upewnij się, że technika RNA jest prawidłowa, czyszcząc obszar roboczy środkiem odkażającym RNaza i używając rąk w rękawiczkach podczas dotykania szkiełka lub nieprzezroczystej nasadki. Rękawice można zdjąć, gdy zamek i nasadka są na swoim miejscu i rozpocznie się przechwytywanie laserowe.</li>
	<li>Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar widoczny w okularze. 
	UWAGA: Tylko okular mikroskopu pokaże, czy nieprzezroczysta nasadka jest wyśrodkowana. Aparat nie pokaże, jeśli nasadka jest wyśrodkowana nad tkanką. W zależności od konstrukcji lunety do przechwytywania laserowego, wizualizacja przez nieprzezroczystą nasadkę będzie albo tylko w okularze, albo wizualizowana zarówno w okularze, jak i w kamerze.</li>
	<li>Wizualizuj warstwy móżdżku za pomocą soczewki obiektywu 5x - 10x i umieść kursor na sekcji, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórek ziarnistych (warstwa komórek Purkinjego).</li>
	<li>Przejdź do 40X i wizualizuj komórki Purkinjego. 
	UWAGA: Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2 to przykładowe wizualizacje.</li>
	<li>Rozpocznij przechwytywanie komórek Purkinjego. 
	nuta: Do przeprowadzenia sekwencjonowania RNA wymagane jest co najmniej 5 ng RNA. Około 1600–2000 komórek Purkinjego wytwarza wystarczającą ilość materiału RNA do sekwencjonowania. RNA będzie stabilne do 8 godzin pod mikroskopem. Przetestuj energię UV i ognisko UV przed pobraniem, aby upewnić się, że poziomy są prawidłowe. Z biegiem czasu tkanka będzie nadal wysychać, a energia UV i ognisko UV mogą być konieczne do zmiany.</li>
</ol>
10. Pobieranie RNA po LCM
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do lizy komórek (za każdym razem przygotuj świeży)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 2-merkaptoetanol w buforze do lizy w stosunku 1:100 (odpowiednio 10 μl: 1 ml). Bufor do lizy (RLT) znajduje się w Tabeli materiałów (#14 i #15).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu do lizy komórek do nieprzezroczystej nasadki, nasadką skierowaną do góry. Ostrożnie zamknij rurkę nad nasadką.</li>
	<li>Pozostaw rurkę do góry nogami na 1 minutę.</li>
	<li>Wiruj probówkę przez 30 s i szybko odkręć bufor do lizy na dno probówki.</li>
	<li>Ponownie otwórz probówkę i powtórz kroki 10.2–10.4.</li>
	<li>Umieść probówkę zawierającą 100 μl buforu do lizy i RNA z zamrażarki o temperaturze -80 °C, aż wszystkie próbki będą gotowe i gotowe do ekstrakcji RNA (Tabela materiałów #14).</li>
</ol>

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li>
<li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection%3A+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li>
<li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97(2006).</li>
<li>Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahalingam%2C+M+%22Laser+Capture+Microdissection%3A+Methods+and+Protocols%22">Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols</a>. Murray, G. I. , Springer. (2018).</li>
<li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li>
<li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraeme%2C+MI+%22Laser+Capture+Microdissection.+Third+edn%22">Laser Capture Microdissection. Third edn</a>. , Humana Press. (2018).</li>
<li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor%3A+From+models+to+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li>
<li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor%3A+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+changes+in+essential+tremor%3A+33+cases+compared+with+21+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathologic+findings+in+essential+tremor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li>
<li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li>
<li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li>
<li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536(2009).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues%3A+results+from+a+rapid+human+autopsy+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li>
<li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Carl+Zeiss+Microscopy%22">Carl Zeiss Microscopy</a>. , Carl Zeiss. Germany. (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół jest specjalnie zmodyfikowany, aby był nierdzewnym podejściem do wizualizacji morfologicznie odrębnych tkanek dla UV-LCM. Metoda ta ma na celu maksymalizację integralności RNA dla późniejszego bezpośredniego sekwencjonowania RNA, przy jednoczesnym zachowaniu zwiększonego poziomu wizualizacji tkanek. Zdolność do rozróżniania różnych typów komórek w celu wychwycenia, w celu stworzenia możliwie najczystszej populacji komórek, ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia różnych profili molekularnych ...

Laserowa mikrodysekcja (LCM) jest cennym narzędziem badawczym, które pozwala na separację patologicznie istotnych komórek do późniejszej oceny molekularnej. Wykorzystanie analiz molekularnych w tych heterogenicznych próbkach tkanek oraz korelacja z danymi patologicznymi i klinicznymi jest niezbędnym krokiem w ocenie translacyjnego znaczenia badań biologicznych1. Podczas analizy danych dotyczących ekspresji genów z RNA zdecydowanie zaleca się stosowanie zamrożonych skrawków tkanki, ponieważ pozwala to na uzyskanie doskonałej jakości RNA, a także maksymalizacji ilości2. Powszechnie wiadomo, że wysoka jakość i ilość RNA są niezbędne do uzyskania istotnych danych z sekwencjonowania RNA3. Jednak w przypadku stosowania RNA ze świeżo mrożonej tkanki pośmiertnej do LCM, degradacja RNA jest poważnym wyzwaniem, ponieważ zachodzi natychmiast po śmierci, a jej zakres zależy od różnych czynników związanych z metodą pobierania tkanek4,5. Ponadto degradacja RNA nasila się, gdy potrzebne są techniki barwienia w celu rozpoznania szczegółów histologicznych i identyfikacji komórki. Specjalistyczne techniki barwienia, takie jak hematoksylina i eozyna, barwienie Nissl, immunofluorescencja i immunohistochemia są pomocne w różnicowaniu komórek z otaczającego zrębu, ale wykazano, że degradują RNA i zmieniają profile ekspresji transkryptu6. Dlatego nasze laboratorium stworzyło nierdzewny protokół specjalnie zaprojektowany do zachowania RNA w pośmiertnym ludzkim móżdżku w celu sekwencjonowania RNA po izolacji LCM neuronów Purkinjego.
Podczas przetwarzania świeżo zamrożonej tkanki na LCM, metoda utrwalania może różnie wpływać zarówno na RNA, jak i na integralność tkanki. Utrwalanie formaliny jest standardem dla zachowania morfologicznego, ale powoduje sieciowanie, które może fragmentować RNA i zakłócać amplifikację RNA7. Utrwalanie etanolu jest lepszą alternatywą dla izolacji RNA, ponieważ jest to utrwalacz koagulacyjny, który nie indukuje sieciowania1. Aby poprawić wizualizację morfologii tkanki, ksylen jest najlepszym wyborem, ponieważ usuwa lipidy z tkanki. Istnieją jednak znane ograniczenia związane z wykorzystaniem ksylenu w LCM, ponieważ tkanki mogą wyschnąć i stać się kruche, powodując fragmentację tkanek po wychwycie laserowym7. Ksylen jest również lotną toksyną i musi być odpowiednio traktowany w dygestorium. Niemniej jednak wykazano, że ksylen poprawia wizualizację tkanek, jednocześnie zachowując integralność RNA8. Dlatego nasz protokół koncentruje się na zastosowaniu 70% wiązania etanolu i odwadniania etanolu, a następnie inkubacji ksylenu w celu uzyskania jasności morfologicznej.
Ważne jest, aby zwrócić uwagę na różne typy systemów mikrodysekcji opartych na laserze, ponieważ wykazano, że różnią się one szybkością, precyzją i jakością RNA. Mikrodysekcja wychwytu laserem w podczerwieni (IR) i systemy mikrodysekcji mikrowiązki lasera ultrafioletowego (UV) były nowymi platformami LCM, które pojawiły się prawie równocześnie8. System IR-LCM wykorzystuje "system kontaktowy" wykorzystujący przezroczystą folię termoplastyczną umieszczoną bezpośrednio na wycinku tkanki, a komórki będące przedmiotem zainteresowania selektywnie przylegają do folii za pomocą skupionych impulsów z lasera IR. Alternatywnie, system UV-LCM jest "systemem bezkontaktowym", w którym skupiona wiązka laserowa odcina komórki lub obszary zainteresowania w tkance; W zależności od konfiguracji w dwóch obecnie dostępnych platformach komercyjnych, które wykorzystują konstrukcję mikroskopu odwróconego lub pionowego, tkanka jest pozyskiwana do urządzenia do pobierania za pomocą fali ciśnienia indukowanej laserem, która katapultuje ją przeciwko grawitacji lub tkanki jest zbierana odpowiednio przez grawitację. Do istotnych zalet systemu UV-LCM należy szybsza akwizycja komórek, wolne od zanieczyszczeń pobieranie z podejściem bezkontaktowym oraz bardziej precyzyjna preparacja dzięki znacznie mniejszej średnicy wiązki laserowej9. Protokół ten został specjalnie zaprojektowany dla systemu UV-LCM i nie został przetestowany w systemie IR-LCM. W obu konstrukcjach systemów UV-LCM, podczas akumulacji komórek w nasadce zbiorczej, użycie szkiełka nakrywkowego, które zwiększa przejrzystość komórkową podczas mikroskopii, nie jest odpowiednie, ponieważ komórki nie byłyby w stanie wejść do nasadki zbiorczej. Dlatego, aby poprawić wizualizację tkanek, przetestowaliśmy użycie nieprzezroczystych nakrętek zbiorczych, które są zaprojektowane tak, aby działały jako szkiełko nakrywkowe do wizualizacji mikroskopowej w systemach UV-LCM, w porównaniu z nasadkami zbiorczymi wypełnionymi płynem. Nasadki do zbierania płynów mogą być trudne, ponieważ ciecz ulega parowaniu i musi być często wymieniana podczas pracy przy mikroskopie. Czas staje się ważnym czynnikiem wpływającym na stabilność RNA, ponieważ przechwycona tkanka rozpuszcza się natychmiast7.
Nasze laboratorium bada pośmiertne zmiany neuropatologiczne w móżdżku u pacjentów z drżeniem samoistnym (ET) i pokrewnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi móżdżku. Wykazaliśmy zmiany morfologiczne skoncentrowane na komórkach Purkinjego, które odróżniają przypadki ET od kontrolnych, w tym zmniejszoną liczbę komórek Purkinjego, zwiększoną regresję dendrytyczną i różnorodne zmiany aksonalne, co prowadzi nas do postulatu, że degeneracja komórek Purkinjego jest podstawową cechą biologiczną w patogenezie ET10,11,12,13. Profilowanie transkrypcyjne jest stosowane w wielu chorobach neurologicznych w celu zbadania podstaw molekularnych leżących u podstaw zwyrodnieniowych zmian komórkowych. Jednak profile transkrypcyjne z heterogenicznych próbek, takich jak regiony tkanki mózgowej, mogą skutecznie maskować ekspresję transkryptów o niskiej liczebności i/lub zmniejszać wykrywanie zmian molekularnych, które występują tylko w niewielkiej populacji dotkniętych chorobą komórek, takich jak komórki Purkinjego w korze móżdżku. Na przykład komórki Purkiniego są znacznie przewyższane liczebnie przez obfite komórki ziarniste w korze móżdżku o około 1:3000; W związku z tym, aby skutecznie celować w ich transkryptom, wymagana jest specyficzna izolacja tych neuronów. Kora móżdżku jest wyznaczona przez wyraźne warstwy, które różnią się gęstością i wielkością komórek. Ta architektura komórkowa jest idealna do wizualizacji w świeżo zamrożonej próbce tkanki bez odczynników barwiących zawierających barwniki. Teoretycznie protokół ten może być również stosowany do innych typów tkanek, które mają podobną charakterystyczną organizację tkanek.
Ten protokół został zaprojektowany specjalnie do wizualizacji komórek Purkinjego w ludzkim pośmiertnym móżdżku. Istnieje wiele protokołów utrwalania, barwienia, wizualizacji i konserwacji RNA wielu typów tkanek dla celów zarówno IR, jak i UV-LCM. Rozważając eksperymentalny projekt UV-LCM, osoby powinny dostosować swój protokół tak, aby jak najlepiej odpowiadał potrzebom i wymaganiom materiałów początkowych i końcowych. W tym miejscu łączymy wiele aspektów różnych protokołów LCM, aby zapewnić ulepszoną metodę wizualizacji komórek Purkinjego w pośmiertnym ludzkim móżdżku bez potrzeby stosowania odczynników barwiących zawierających barwnik w celu przygotowania wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania transkryptomu.

<table><tbody><tr><td>MembranSlide NF 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9081-000</td><td>Szkiełka membranowe do tkanek. Nie zalecamy korzystania ze szkiełek szklanych.</td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 Opaque</td><td>Zeiss</td><td>415190-9201-000</td><td>Nieprzezroczyste nasadki służą do poprawy wizualizacji tylko na odwróconych zakresach</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td>Odpowiednie są również inne produkty do odkażania RNazy. Służy do czyszczenia wszystkich powierzchni przed pracą.&nbsp;</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Jeśli używasz alternatywnego etanolu, zapewnij wysoką jakość. Niezbędny do utrwalenia tkanek.</td></tr><tr><td>Ksyleny (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td>Jeśli używasz alternatywnego ksylenu, zapewnij wysoką jakość. Niezbędne do wizualizacji tkanek.&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Inna woda wolna od RNA / DNA / nukleaz również odpowiednia. Stosowany tylko w rozcieńczaniu etanolu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-Fix Slide Jars</td><td>Evergreen</td><td>240-5440-G8K</td><td>Odpowiedni jest również każdy uchwyt na slajdy/słoik. Należy go wyczyścić przed użyciem. Służy do mocowania po przekroju.&nbsp;</td></tr><tr><td>Płyta stabilizatora, komplet 70 mm 100 &mu; m</td> Typ płyty antyrolkowej <td>Leica Biosystems</td><td>14041933980</td><td>zależy od rodzaju kriostatu i miejsca mocowania na stoliku. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania.</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758-50mL</td><td>DEPC od dowolnego dostawcy wystarczy. Postępuj zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi uzdatniania wody.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Chusteczki Kimwipes można zamówić u dowolnego sprzedawcy i używać w dowolnym rozmiarze. Chusteczki Kimwipes są przeznaczone do czyszczenia mikroskopu i kriostatu.</td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Dopuszczalna jest każda marka OCT. Żadna tkanka nie zostanie osadzona w OCT, łatwo jest przymocować tkankę do "chucka".&nbsp;</td></tr><tr><td>Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td><td>Thermo Scientific</td><td>4280L</td><td>Typ ostrza zależy od typu kriostatu. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania.</td></tr><tr><td>Leica Microsystems 3P&nbsp; UCHWYTY KRIOSTATOWE 25 + 30 MM</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0558768</td><td>Typ uchwytu zależy od typu kriostatu. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania. Każdy rozmiar jest odpowiedni.&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Wymagany do ekstrakcji RNA po LCM. Bufor do lizy RLT niezbędny do zbierania wychwyconych komórek z nieprzezroczystej czapeczki.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Wymagany do ekstrakcji RNA preparatów do sekcji, które są wykonywane przed LCM w celu zbadania integralności RNA tkanek wyjściowych.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw DNazy bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Dnaza usunie dowolne DNA, aby umożliwić czystą populację RNA. Upewnij się, że Dnase jest świeży.&nbsp;</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Zakupiona objętość według uznania użytkownika. Niezbędny do dodania do buforu RLT w celu lizy komórek. Zapobiega aktywności RNazy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Globe Naukowy&nbsp; Certyfikowana probówka wirówkowa z podziałką Lot (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-092</td><td>Wystarczy dowolna probówka o pojemności 2 ml, która jest wolna od RNazy, DNazy, ludzkiego DNA i pirogenów.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji rna z mikrowypreparowanych komórek purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Mikrodysekcja laserowa (LCM) jest korzystnym narzędziem, które pozwala na pobieranie odpowiednich cytologicznie i/lub fenotypowo komórek lub regionów z heterogenicznych tkanek. Wychwycony produkt może być stosowany w różnych metodach molekularnych do izolacji białek, DNA lub RNA. Jednak zachowanie RNA z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej jest szczególnie trudne. Standardowe techniki wizualizacji LCM wymagają procedur barwienia histologicznego lub immunohistochemicznego, które mogą dalej degradować RNA. W związku z tym zaprojektowaliśmy nierdzewny protokół wizualizacji w LCM z zamierzonym celem zachowania integralności RNA w pośmiertnej tkance mózgowej człowieka. Komórka Purkiniego móżdżku jest dobrym kandydatem do wizualizacji ze stali nierdzewnej ze względu na swoją wielkość i charakterystyczne położenie. Kora móżdżku ma wyraźne warstwy, które różnią się gęstością komórek, co czyni je dobrym archetypem do identyfikacji pod mikroskopią w dużym powiększeniu. Komórki Purkiniego to duże neurony znajdujące się między warstwą komórek ziarnistych, która jest gęstą siecią komórkową małych neuronów, a warstwą molekularną, która jest rzadka w ciałach komórkowych. Ze względu na tę architekturę możliwe jest zastosowanie wizualizacji ze stali nierdzewnej. Inne narządy lub układy komórkowe, które naśladują ten fenotyp, również byłyby odpowiednie. Protokół ze stali nierdzewnej ma na celu utrwalenie świeżo zamrożonej tkanki za pomocą etanolu i usunięcie lipidów za pomocą ksylenu w celu poprawy wizualizacji morfologicznej pod mikroskopią świetlną o dużym powiększeniu. Protokół ten nie uwzględnia innych metod utrwalania i jest specjalnie opracowany dla świeżo mrożonych próbek tkanek pobranych przy użyciu systemu ultrafioletowego (UV)-LCM. W tym miejscu przedstawiamy pełny protokół sekcji i mocowania świeżo mrożonej pośmiertnej tkanki ludzkiego móżdżku oraz oczyszczania RNA z komórek Purkinjego wyizolowanych za pomocą UV-LCM, przy jednoczesnym zachowaniu jakości RNA do późniejszego sekwencjonowania RNA. W naszych rękach protokół ten zapewnia wyjątkowy poziom wizualizacji komórkowej bez potrzeby stosowania odczynników barwiących i daje RNA o wysokiej liczbie integralności RNA (≥8), zgodnie z potrzebami eksperymentów profilowania transkrypcji.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje etapy przygotowania świeżo zamrożonej tkanki mózgu człowieka pobranej po śmierci do UV-LCM. Przedstawiono dokładne specyfikacje i uwagi dotyczące cięcia w kriostacie, ponieważ precyzyjne cięcie świeżo zamrożonej tkanki mózgu może być trudne. Najważniejszym aspektem jest to, że świeżo zamrożona tkanka ma bardzo niską temperaturę i wymaga znacznej ilości czasu na aklimatyzację do wyższej temperatury panującej w kriostacie. Etapu tego nie można przyspie...

Ten protokół wykorzystuje metodę bez plam do wizualizacji i izolowania komórek Purkinjego w świeżo zamrożonej tkance z ludzkiego móżdżku pośmiertnego za pomocą mikrodysekcji laserowej. Celem tego protokołu jest wygenerowanie wystarczających ilości wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania RNA.

Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Protokół ten jest znaczący, ponieważ wykorzystuje metodę wizualizacji bez plam zamiast wizualizacji opartej na barwniku na pośmiertnej tkance mózgowej człowieka, co pomaga zachować integralność RNA. Zachowanie RNA jest dużą zaletą w tym protokole, ponieważ jest przydatne nie tylko w pośmiertnej ludzkiej tkance mózgowej, ale także w innych typach tkanek o wysokiej aktywności RNazy. Na początek wyjmij chusteczkę z zamrażarki i umieść ją na suchym lodzie w celu transportu do kriostatu.Umieść czyste szczotki, uchwyt i chusteczkę w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby mogły osiągnąć optymalną temperaturę. W przypadku kriostatów z dwiema komorami i temperaturami przechowywania próbek należy ustawić temperaturę obiektu na minus 16 stopni Celsjusza, a temperaturę komory na minus 18 stopni Celsjusza. Ustaw grubość przekroju kriostatu na 14 mikrometrów, a grubość przycinania na 30 mikrometrów.Następnie wyczyść scenę mieszaniną jeden do jednego odkażacza RNazy i 70% etanolu, aby zapobiec zamarzaniu. Zaopatrz się w nowe, jednorazowe ostrze kriostatu i wyczyść je odkażaczem RNazy. Umieść oczyszczone ostrze w uchwycie ostrza na scenie.Następnie wyczyść płytkę zapobiegającą przewróceniu za pomocą dekontaminatora RNazy. Przymocuj oczyszczoną płytkę do stolika i odczekaj co najmniej 20 minut, aż ostrze i płyta zapobiegająca przetaczaniu się spadną do temperatury kriostatu. Najpierw wytnij mały kawałek tkanki do cięcia, upewniając się, że przekrój składa się w około 95% z kory móżdżku.Umieść pozostałą tkankę z powrotem w suchym lodzie lub w zamrażarce, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie zacznij powoli dodawać OCT na wierzch uchwytu powolnymi, okrężnymi ruchami. Buduj warstwy OTC, aż uchwyt zostanie pokryty mocowaniem o wysokości około trzech milimetrów.Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale nadal ma trochę płynu w środku, umieść chusteczki na wierzchu mocowania. Pozostaw tkankę na wierzchu OCT na jedną do dwóch minut, aż całkowicie się zamrozi. Następnie przenieś uchwyt z zamrożonym OCT i tkanką do ramienia tnącego kriostatu.Wyreguluj tkankę tak, aby zlicowała z ostrzem tnącym i pozostaw chusteczkę w ramieniu tnącym przez 20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury. Najważniejszym krokiem jest umożliwienie tkance aklimatyzacji w ramieniu tnącym kriostatu tak długo, jak to konieczne. Jeśli tkanka ulega rozdarciu, wizualizacja komórek Purkiniego będzie bardzo trudna.Polecam stosowanie mniejszych, cieńszych kawałków tkanki, aby tkanka mogła się szybciej zaaklimatyzować. Następnie powoli przesuń tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania.Przytnij tkankę dwa do trzech razy, aż warstwy kory będą widoczne. Następnie umieść i wyrównaj płytkę zapobiegającą przetaczaniu się tuż nad ostrzem kriostatu. Wytnij od czterech do sześciu odcinków o grubości 14 mikrometrów, zwracając uwagę, że prawidłowo przycięte sekcje będą płaskie pod płytą stabilizatora.Wyrównaj wycięte sekcje poziomo w poprzek stolika kriostatu. Ustaw suwak pod kątem, aby jednocześnie podnieść wszystkie kawałki tkanki. Natychmiast po przecięciu tkanki umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 70% etanolem na lodzie na dwie minuty.Przenieś szkiełko do uchwytu na szkiełko z 95% etanolem na lodzie na 45 sekund. Następnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka ze 100% etanolem w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Zanurz szkiełko trzykrotnie w uchwycie szkiełka zawierającym ksylen numer jeden w temperaturze pokojowej.Następnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z ksylenem dwa w temperaturze pokojowej na pięć minut. Umieść szkiełka w czystym dygestorium i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Jeśli przechowujesz szkiełka, umieść każdą z nich w osobnej 50-mililitrowej tubie i umieść probówki w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na okres do siedmiu dni.Najpierw użyj dekontaminatora RNazy, aby wyczyścić stolik mikroskopu i ramię zbierające nakrętki. Rękami w rękawiczkach umieść szkiełko na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 mikrolitrów w ramieniu zbiorczym. Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar, który jest widoczny w okularze.Użyj obiektywu od pięciu do 10 razy, aby uwidocznić warstwy móżdżku. Umieść kursor nad sekcją, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórek ziarnistych. Przejdź do 40-krotnego powiększenia i wizualizuj komórki Purkinjego.Następnie zacznij je chwytać. Aby rozpocząć zbieranie RNA po mikrodysekcji, dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy komórek do nieprzezroczystej czapeczki z czapeczką skierowaną do góry. Ostrożnie zamknij probówkę nad nakrętką i kontynuuj pobieranie zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tym protokole świeża, zamrożona, pośmiertna ludzka tkanka mózgowa jest przygotowywana do mikrodysekcji wychwytu laserem UV. Po przecięciu kriostatu w wyznaczonym czasie ciągnienia, warstwy komórkowe móżdżku są łatwo widoczne za pomocą pięciokrotnie i 10-krotnie większych soczewek obiektywowych. Jak widać tutaj, prawidłowa inkubacja ksylenu powoduje, że tkanka staje się ciemniejsza i lepiej wyznacza warstwy komórkowe niż sam etanol.Podczas cięcia pod mikroskopem laserowym wymagana jest 40-krotna soczewka obiektywowa, aby zapewnić uchwycenie tylko komórek Purkinjego, a nie otaczającej tkanki. Jak widać tutaj, właściwa inkubacja w ksylenie daje wysokiej jakości morfologicznie nienaruszony obraz w porównaniu z samym utrwalaniem etanolu. Zdolność szkiełka nakrywkowego nieprzezroczystej nasadki jest następnie testowana, podczas gdy inne protokoły wykorzystują nasadkę wypełnioną płynem, te nasadki mogą zmniejszyć wizualizację tkanek i spowodować, że uzyskany obraz będzie ziarnisty i opalizujący pod mikroskopem.Jednak wizualizacja za pomocą nieprzezroczystej nasadki powoduje, że tkanka wygląda na wygładzoną, bardziej miękką i ostrzejszą w formie. Reprezentatywne obrazy wyciętych komórek Purkinjego przy małej mocy i przy dużej mocy pokazują precyzyjne usunięcie samego ciała komórki Purkinjego. Następnie uzyskuje się wysokiej jakości Rnazę do późniejszego sekwencjonowania RNA.Sześć reprezentatywnych próbek poddano ekstrakcji RNA i ponownie zawieszono w 14 mikrolitrach wody wolnej od rnazy, a wszystkie sześć próbek wytworzyło wysokiej jakości RNA o liczbie integralności RNA równej lub większej niż osiem. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że jakość tkanek jest wszystkim. Nawet cięcie i umieszczanie suwaków może stworzyć lub zepsuć ten protokół.Zgodnie z tą procedurą można zastosować dowolną metodę, która bada RNA lub DNA, w szczególności badamy nasze RNA pod kątem zróżnicowanej ekspresji genów, ale można również zbadać inne kwestie dotyczące regulacji genów. Metodę tę można zastosować do każdego typu tkanki, która ma specyficznie określoną morfologię, która nie wymaga użycia antygenu lub odczynników specyficznych dla barwnika do identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Mamy nadzieję, że ta technika pomoże nam zrozumieć genetykę drżenia samoistnego i innych chorób, które mają fenotyp drżenia.Najbardziej niebezpieczną substancją chemiczną stosowaną w tym protokole jest ksylen. Należy się z nim odpowiednio obchodzić w dygestorium, odpowiednio zutylizować, a szkiełka należy pozostawić do odpowiedniego wyschnięcia do czasu użycia na otwartej przestrzeni. Ponadto podczas pracy z próbkami ludzkimi należy stosować gospodarkę odpadami niebezpiecznymi biologicznie i bezpieczeństwo.

a-stainless-protocol-for-high-quality-rna-isolation-from-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ten film pokazuje, jak wyizolować komórki Purkinjego z ludzkiej pośmiertnej tkanki móżdżku za pomocą mikrodysekcji laserowej.

Mikrodysekcja laserowa w celu wyizolowania komórek Purkinjego z ludzkiej pośmiertnej tkanki móżdżku

Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj bezbarwny protokół izolacji RNA z komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku przy użyciu mikroskopii laserowej. Ta metoda zachowuje integralność RNA do sekwencjonowania.

Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

Przeglądaj więcej filmów