Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Protokół ten pozwala naukowcom na generowanie wirusów pseudotypowych, które można bezpiecznie wykorzystać do badania zdarzeń związanych z wnikaniem wysoce zjadliwych wirusów, takich jak koronawirus sal i większość koronawirusów. Ta wszechstronna technika opiera się na łatwej w konfiguracji transfekcji przejściowej. System ten może być również stosowany do wytwarzania cząstek pseudotypowanych białkami fuzyjnymi innych wirusów, nie tylko koronawirusa S. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ważne jest monitorowanie zdrowia i gęstości komórek pod kątem transfekcji, a także infekcji wirusem pseudotypowym.

Tę procedurę zademonstrują Tiffany Tang i Lakshmi Nathan. Doktoranci z mojego laboratorium. Na początek ostrożnie umyj HEK293T komórki 10 mililitrami 37 stopni Celsjusza, dwukrotnie podgrzanym DPBS.

Następnie odessać supernatant i przymocować komórki jednym mililitrem 25% roztworu trypsyny, który został wstępnie podgrzany w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj kolbę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez trzy do pięciu minut, aż komórki zaczną się odłączać. Dodaj cztery mililitry kompletnego DMEM, aby dezaktywować roztwór trypsyny.

A następnie policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego. Rozcieńczyć komórki do 500 000 komórek na mililitr za pomocą kompletnego DMEM. Następnie wysiew dwa mililitry roztworu komórkowego na dołek na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

I delikatnie przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Po upewnieniu się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc lub 16 do 18 godzin. Aby przygotować kotransfekcję trzech plazmidów, najpierw wymieszaj obliczone objętości plazmidów i zredukowaną pożywkę do hodowli komórek surowicy w mikroprobówce wirówkowej.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodać trzy mikrolitry na studzienkę odczynnika do transfekcji na bazie lipidów do 47 mikrolitrów na studzienkę zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie w mikroprobówce wirówkowej wymieszaj równe ilości odczynnika do transfekcji i roztworów plazmidu za pomocą kilkakrotnie kierując rurkę w górę iw dół. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po całonocnej inkubacji płytki komórkowej użyj mikroskopu światła odwróconego, aby zbadać komórki pod kątem ich morfologii i gęstości.

Następnie odessać zużytą pożywkę komórkową i delikatnie dodać jeden mililitr na dołek wstępnie podgrzanej zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy do każdej studzienki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu transfekcji do każdej studzienki kroplami. I inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez cztery do sześciu godzin.

Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanego DMEM do transfekcji bez antybiotyków w temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołka. I inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Aby rozpocząć zbieranie cząstek pseudotypowych, użyj mikroskopu światła odwróconego, aby zbadać komórki pod kątem ich morfologii i ogólnego stanu.

Kolor podłoża powinien być jasnoróżowy lub lekko pomarańczowy. Następnie przenieś supernatanty transfekowanych komórek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów. Odwiruj probówki pod ciśnieniem 290-krotności grawitacji przez siedem minut, aby usunąć resztki komórek.

Następnie przefiltruj sklarowany supernatant przez sterylny filtr o wielkości porów 0,45 mikrona. Wykonaj porcje o małej objętości roztworu wirusa pseudotypu w fiolkach kriogenicznych. I przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić infekcję cząstkami pseudotypowymi, najpierw zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że istnieje zlewający się dywan komórek. Następnie umyj komórki trzykrotnie 0,5 mililitra wstępnie podgrzanego DPBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odessać supernatanty komórek i zaszczepić komórki 200 mikrolitrami rozmrożonego roztworu pseudotypowanych cząstek.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną do dwóch godzin. Po okresie inkubacji dodać 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEMc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I inkubować zainfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.

Na koniec odessać supernatanty zainfekowanych komórek. I poprzedza test reporterowy lucyferazy. Aby określić ilościowo zakaźność pseudotypowanych cząstek, najpierw rozmrozić substrat lucyferyny, przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, w pięciokrotnym buforze do lizy testu lucyferazy przechowywanym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej.

Następnie rozcieńczyć bufor do lizy do testu lucyferazy do jednorazowego stężenia sterylną wodą. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego buforu do każdej studzienki. I inkubować w temperaturze pokojowej na bujaczku przez 15 minut.

Aby wykonać pomiar aktywności lucyferazy, po jednym dołku na raz, najpierw dodaj 20 mikrolitrów substratu lucyferyny do probówki z mikrowirówką. Następnie dodaj 10 mikrolitrów lizatu do probówki. Wymieszaj zawartość, delikatnie przesuwając tubki.

I umieściłem rurkę w luminometrze. Zamknij pokrywę i zmierz wartość luminescencji rurki. Zapisz pomiar względnych jednostek światła i zastąp analizą danych.

Testy zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp w podatnych komórkach gospodarza wykazały silną średnią zakaźność w porównaniu z oczekiwanymi cząstkami kontroli pozytywnej. Niezakażone kontrole i cząstki kontroli ujemnej pozbawione glikoprotein otoczki wirusa. Również testy aktywności lucyferazy wykazały zależność zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp od stężenia.

Wzrost zakaźności SARS-Spp lub MERS-Spp w słabo permisywnych komórkach docelowych, transfekowanych w celu ekspresji receptora ACE2 SARS-Spp lub receptora DPP4 MERS-Spp, potwierdza, że wykorzystanie receptorów pseudowirionów jest podobne do wykorzystania wirusów NATO do pośredniczenia w przyłączaniu i wnikaniu pseudowirionów. Przed wykonaniem tego kroku dokładnie sprawdź obliczenia. I upewnij się, że wszystkie roztwory są dobrze wymieszane podczas tego kroku.

Test western blot można przeprowadzić na skoncentrowanych pseudotypowanych cząstkach w celu oceny włączenia glikoproteiny S do pseudowirionów. Podczas gdy opisane tutaj pseudotypowane cząstki są bezpieczniejszymi substytutami niż wirusy NATO, nadal wymagają środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego.