Name: Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych cząstek koronawirusów MERS i SARS w warunkach BSL-2. Technika ta umożliwia bezpieczne badanie wnikania wirusa do komórek gospodarza z wykorzystaniem reportera lucyferazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratoriów Whittakera i Daniela za pomocne komentarze. Finansowanie badań pochodziło z grantów NIH R21 AI111085 i R01 AI135270. T.T. dziękuje za wsparcie ze strony Prezydenckiego Stypendium Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Cornell oraz Programu Stypendialnego dla Absolwentów Narodowej Fundacji Nauki w ramach grantu nr 1. DGE-1650441. L.N. dziękuje za wsparcie ze strony Samuel C. Fleming Family Graduate Fellowship oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr 1. DGE-1650441. Praca ta jest również wspierana przez National Science Foundation 1504846 (do S.D. i G.R.W.).

1. Zasiewanie komórek w celu produkcji pseudotypowanych cząstek
UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Za pomocą standardowych technik hodowli komórkowych należy uzyskać 80–90% zlewającą się kolbę o długości 75cm2 komórek HEK-293T/17 pasażowanych w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM-C) firmy Dulbecco, zawierającej 10% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przygotuj pożywkę DMEM-T do transfekcji (jej skład jest taki sam jak DMEM-C, ale bez antybiotyków).</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 10 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. 
	nuta: Z ogniwami HEK293T/17 należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ łatwo się odłączają.</li>
	<li>Odessać supernatant i odłączyć komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu trypsyny podgrzanego w temperaturze 37 °C. Umieścić kolbę komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3−5 min lub do momentu, gdy komórki zaczną się odłączać. 
	nuta: Unikaj inkubacji komórek z trypsyną dłużej niż 5 minut, ponieważ zwykle prowadzi to do zlepiania się komórek.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 4 ml pożywki DMEM-C i policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego. 
	nuta: Aby uniknąć konieczności liczenia zbyt wielu komórek, może być wymagany dodatkowy etap rozcieńczania. Pamiętaj, aby uwzględnić to rozcieńczenie przy obliczaniu rzeczywistej gęstości komórek trypsynizowanych.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do 5 x 105 komórek/ml za pomocą DMEM-C.</li>
	<li>Wysiewaj 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z 2 ml roztworu komórkowego na studzienkę i delikatnie przesuwaj płytkę do przodu iz powrotem oraz z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki, unikając ruchów okrężnych. 
	nuta: To kluczowy krok. Równomiernie rozmieszczone komórki zapewnią, że komórki nie zlepiają się w środku studzienek. To z kolei zapewni dobrą wydajność transfekcji i produkcję cząstek pseudotypowanych.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez noc (16–18 godzin) w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, 5%CO2</li>.
</ol>
2. Kotransfekcja trójplazmidowa
UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem światła odwróconego, aby sprawdzić morfologię i gęstość komórek. 
	nuta: Idealnie gęstość komórek powinna mieścić się w zakresie 40–60% konfluencji. Bardzo ważne jest, aby komórki nie były ani zbyt zlewające się (80-90% zlewające), ani zbyt słabo rozmieszczone (20-30% zlewające) w każdym dołku. Gęstość komórek wynosząca 40−60% konfluencji zapewni dobrą produkcję pseudotypowanych cząstek.</li>
	<li>Mieszanka plazmidów
	<ol>
		<li>Obliczyć mieszaninę plazmidów dla każdej glikoproteiny otoczki zgodnie z ilościami dla jednego dołka na płytce 6-dołkowej pokazanej w tabeli 1. Pomnóż ilości w przypadku transfekcji kilku studzienek i dołącz dodatkową studzienkę, aby uniknąć wyczerpania mieszanki. 
		nuta: Wraz z plazmidami kodującymi SARS-CoV S i MERS-CoV S, należy uwzględnić kontrolę pustego wektora w celu wytworzenia negatywnych cząstek kontrolnych, które nie mają glikoprotein otoczki wirusa (cząstki Δenv) wraz z glikoproteiną kontroli pozytywnej, taką jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) glikoproteina G, o której wiadomo, że silnie infekuje bardzo szeroki zakres komórek (VSV-Gpp). Plazmidy są dostępne na życzenie.</li>
		<li>Wymieszać obliczone objętości plazmidów i zredukowaną pożywkę do hodowli komórek surowicy (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanina odczynników do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów)
	<ol>
		<li>Obliczyć objętości mieszaniny odczynników do transfekcji na podstawie ilości podanych w tabeli 2 dla jednego dołka (stosunek transfekcji 1:3, w razie potrzeby pomnożyć ilości). Dołącz dodatkowe studzienki, aby uniknąć wyczerpania mieszanki odczynników do transfekcji.</li>
		<li>Wymieszać obliczone objętości odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (3 μl na studzienkę) i zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy (47 μl na studzienkę) w probówce mikrowirówkowej, upewniając się, że odczynnik do transfekcji został dodany do zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy, a nie na odwrót.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować obie mieszaniny (dla jednego dołka: 50 μl mieszanki plazmidów i 50 μl mieszaniny odczynników do transfekcji na bazie lipidów) oddzielnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać zawartość mieszaniny odczynników do transfekcji do mieszaniny plazmidów w stosunku 1:1 (dla 1 dołka: 50 μl każdej mieszanki)</li>
	<li>Przeprowadzić dokładne pipetowanie otrzymanej mieszaniny góra-dół.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać zużytą pożywkę komórek.</li>
	<li>Dodać delikatnie 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy do dołka.</li>
	<li>Do każdego dołka dodawać kroplami 100 μl mieszanki do transfekcji. 
	nuta: Zachowaj ostrożność podczas dodawania mieszanki transfekcyjnej do studzienek HEK-293T, ponieważ łatwo się odłączają.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4–6 godzin.</li>
	<li>Dodać 1 ml do studzienki wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki DMEM-T, która nie zawiera antybiotyków 
	nuta: To kluczowy krok. Odczynniki do transfekcji zwiększają przepuszczalność komórek i zwiększają wrażliwość na antybiotyki. Aby zapewnić dobrą wydajność transfekcji i produkcję pseudotypowanych cząstek, ważne jest, aby unikać stosowania pożywki do hodowli komórkowych zawierającej antybiotyki</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Zbiór pseudotypowanych cząstek
UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem światła odwróconego, aby sprawdzić morfologię komórek i ogólny stan. Sprawdź również kolor podłoża, który powinien być jasnoróżowy/lekko pomarańczowy. 
	nuta: To ważny krok. Jeśli transfekcja wiąże się ze zbyt dużą śmiercią komórki lub kolor podłoża zmieni kolor na pomarańczowo-żółty (kwaśne pH), będzie to zwykle związane z niższą wydajnością zakaźnych pseudotypowanych cząstek</li>
	<li>Przenieść supernatanty transfekowanych komórek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Probówki wirować o masie 290 x g przez 7 minut, aby usunąć resztki komórek.</li>
	<li>Przefiltrować oczyszczone supernatanty przez sterylny filtr o wielkości porów 0,45 μm.</li>
	<li>Przygotować porcje o małej objętości (np. 500 μl lub 1 ml) pseudotypowanego roztworu wirusa w kriowialach.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Cząstki pseudotypowane są stabilne w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy, ale po rozmrożeniu należy unikać ich ponownego zamrażania, ponieważ stracą zakaźność</li>
</ol>
4. Zakażenie podatnymi komórkami za pomocą pseudotypowanych cząsteczek
UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Wysiew komórek podatnych na zakażenie w płytce 24-dołkowej
	<ol>
		<li>Otrzymanie standardowymi technikami hodowli komórkowych 80−90% zlewającej się 75 cm2 kolby podatnych komórek: komórek Vero-E6 dla cząstek pseudotypowanych SARS-CoV (SARS-Spp) i komórek Huh-7 dla cząstek pseudotypowanych MERS-COV S (MERS-Spp). 
		nuta: Aby potwierdzić, czy wytworzone pseudotypowane cząstki są zakaźne, ważne jest, aby starannie wybrać odpowiednią podatną linię komórkową do testów zakaźności pseudowirionów. Używanie komórek o niskiej przepuszczalności doprowadzi do niskiej zakaźności.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) DPBS.</li>
		<li>Odessać supernatant i odłączyć komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu trypsyny podgrzanego w temperaturze 37 °C. Umieścić kolbę komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3−5 min lub do momentu, gdy komórki zaczną się odłączać. 
		nuta: Unikaj inkubacji komórek z trypsyną dłużej niż 5 minut, ponieważ zwykle prowadzi to do zlepiania się komórek. Komórki Huh-7 są szczególnie wrażliwe na ten efekt.</li>
		<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę DMEM-C i policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do 5 x 105 komórek/ml za pomocą DMEM-C.</li>
		<li>Dołki nasienne 24-dołkowej płytki zawierają 0,5 ml roztworu komórkowego na studzienkę i delikatnie przesuwaj płytkę do przodu iz powrotem oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki, unikając ruchów okrężnych 
		nuta: To kluczowy krok. Równomiernie rozmieszczone komórki zapewnią, że komórki nie zlepiają się w środku studzienek. To z kolei zapewni dobre testy zakaźności. Dla każdej pseudotypowanej cząstki (SARS-Spp, MERS-Spp) i warunku należy przygotować trzy studzienki dla trzech powtórzeń eksperymentalnych. Obejmują studzienki dla niezakażonych (N.I.), pustych cząstek wektorowych Δenv i cząstek kontroli pozytywnej, takich jak VSV-Gpp</li>
		<li>Inkubować płytkę przez noc (16−18 godzin) w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie cząstkami pseudotypowanymi
	<ol>
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym i wizualnie potwierdź, że istnieje zlewający się dywan komórek.</li>
		<li>Przynieś kriowiale pseudotypowego wirusa do rozmrożenia na lodzie.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie 0,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) DPBS 
		nuta: To kluczowy krok. Komórki, które nie są odpowiednio wypłukane przed infekcją, zwykle prowadzą do słabych odczytów zakaźności</li>
		<li>Odessać supernatanty komórek.</li>
		<li>Zaszczepić komórki 200 μl rozmrożonego roztworu pseudotypowanych cząstek.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1-2 godziny.</li>
		<li>Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki DMEM-C.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2 przez 72 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja zakaźności za pomocą odczytu testu lucyferazy
UWAGA: Wykonaj pierwsze kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Rozmrozić substrat lucyferyny (przechowywany w temperaturze -80 °C) i 5x bufor do lizy do testu lucyferazy (przechowywany w temperaturze -20 °C), aż osiągną temperaturę pokojową.</li>
	<li>Rozcieńczyć bufor do lizy do testu lucyferazy do 1x sterylną wodą.</li>
	<li>Aspirować supernatanty komórek zakażonych cząstkami pseudotypowanymi.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl 1x buforu do lizy do testu lucyferazy.</li>
	<li>Umieścić płytkę na kołysce i inkubować przez 15 minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej (od tego momentu płytkę można obchodzić poza komorą bezpieczeństwa biologicznego).</li>
	<li>Przygotuj probówki do mikrowirówek dla każdej studzienki, dodając 20 μl substratu lucyferyny do każdej probówki.</li>
	<li>Włącz luminometr.</li>
	<li>Wykonaj pomiar aktywności lucyferazy pojedynczo, przenosząc 10 μl lizatu do jednej probówki zawierającej 20 μl substratu lucyferyny.</li>
	<li>Delikatnie przesuń tubkę, aby wymieszać zawartość, ale unikaj przesuwania płynu na ściankach tuby.</li>
	<li>Umieść rurkę w urządzeniu i zamknij pokrywę.</li>
	<li>Zmierz wartość luminescencji rurki za pomocą luminometru.</li>
	<li>Zapisz pomiar względnej jednostki światła.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 5.8–5.12, aż wszystkie studzienki zostaną przeanalizowane. 
	nuta: Dzięki odpowiedniemu sprzętowi, takiemu jak luminometr do odczytu płyty, proces ten może być wykonywany automatycznie. Test będzie musiał zostać przeskalowany do formatu płytki (np. format płytki 96-dołkowej).</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczanie i wykreślanie względnych średnich i odchyleń standardowych jednostek lucyferazy
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby obliczyć średnie pomiary testu lucyferazy i odchylenia standardowe kontrprób eksperymentalnych i biologicznych.</li>
		<li>Wykreśl dane jako wykres słupkowy z odchyleniami standardowymi. 
		nuta: Przeprowadzając analizy statystyczne danych, należy pamiętać o uwzględnieniu w zestawach danych co najmniej trzech powtórzeń biologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę wydajnego wytwarzania pseudotypowanych cząstek zawierających białko S koronawirusów grupy ryzyka 3, SARS-CoV i MERS-CoV, w warunkach BSL-2. Cząstki te, które zawierają gen reporterowy lucyferazy, umożliwiają nam łatwe ilościowe określenie zdarzeń wejścia koronawirusa za pośrednictwem S za pomocą stosunkowo prostego testu lucyferazy 48,49,50,51. W testach zakaźności z wykorzystaniem komórek permisywnych potwierdzamy, że mierzona aktywność lucyferazy zależy od stężenia cząstek. Ponadto transfekcja receptorów ACE2 i DPP4 pozwala na bardziej efektywne wejście w słabo permisywne linie komórkowe, takie jak komórki HEK-293T. Metoda ta jest wysoce adaptowalna do innych glikoprotein otoczki wirusowej i jest szeroko stosowana 48,49,50,51,52,53,55,56,57,58,59, często w celu uzupełnienia innych testów, takich jak analizy biochemiczne lub natywne infekcje wirusowe.
Protokół, który tutaj opisujemy, opiera się na retrowirusie MLV, który zawiera reporter lucyferazy. Należy jednak podkreślić, że istnieje bardzo szeroki wachlarz innych systemów pseudotypowania, które zostały z powodzeniem opracowane do pakowania koronawirusa S 12,13,25,26,30,31,32 i innych glikoprotein otoczki wirusa 10,11,14,16,17 ,23,24,29,33,38,40,42,44,46. Niektóre z tych innych systemów są oparte na powszechnie stosowanym rdzeniu retrowirusowym MLV 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 lub oparte na szeroko stosowanym systemie pseudotypowania lentiwirusowego HIV-1 przy użyciu różne strategie 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 lub z wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej rabdowirusa (VSV) jako rdzeniem, który pozwala na włączenie szerokiej gamy glikoprotein otoczkowych, a także ponownie z różnymi zastosowanymi strategiami 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Ponadto do pomiarów z powodzeniem zastosowano inne reportery, takie jak białka fluorescencyjne, takie jak GFP 11,13 i RFP36, lub enzymy inne niż lucyferazy, takie jak β-galaktozydaza16,17 i wydzielana fosfataza alkaliczna (SEAP)42. Ponadto w teście przedstawionym w tym protokole zastosowano transfekcję przejściową w celu ekspresji genów i białek MLV i CoV S. Istnieją jednak inne strategie ekspresji, takie jak generowanie stabilnych linii komórkowych do produkcji wirusów pseudotypowanych 7,14. Ponieważ każdy z tych systemów ma swoje zalety i wady, ważne jest, aby wziąć pod uwagę następujące ważne parametry przy podejmowaniu decyzji, który system pseudotypowania najlepiej odpowiada potrzebom badacza: rdzeń pseudowirionu (MLV, HIV-1, VSV lub inne), jak selektywny jest dany rdzeń pseudotypujący we włączaniu określonej glikoproteiny otoczki wirusa, reporter do odczytu testu (GFP, lucyfekaza, SEAP lub inna) oraz strategia transfekcji (liczba plazmidów biorących udział w kotransfekcji, transfekcji przejściowej lub wytwarzaniu stabilnych linii komórkowych).
W metodzie tej należy podkreślić kilka krytycznych etapów. Gęstość komórek, szczególnie w linii komórek producenta HEK-293T/17, jest krytycznym czynnikiem zapewniającym udaną transfekcję. Stwierdzono, że zagęszczenie komórek w zakresie 40–60% konfluencji jest optymalne. Wyższe gęstości zazwyczaj skutkują niską wydajnością transfekcji i niską produkcją cząstek. Należy również pamiętać, że komórki HEK-293T/17 są mniej przylegające niż inne linie komórkowe. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nimi, aby uniknąć ich niepotrzebnego odłączania. Jedną z opcji jest traktowanie plastikowych powierzchni hodowli komórkowych poli-D-lizyną w celu zwiększenia przyczepności. Co więcej, wyższe pasaże komórkowe często skutkują słabymi wskaźnikami transfekcji. Po dodaniu odczynnika do transfekcji do komórek HEK-293T/17 należy również pamiętać, że zwiększa się przepuszczalność komórek. Dlatego w tym momencie najlepiej unikać stosowania pożywki zawierającej antybiotyki, ponieważ mogą one zwiększać cytotoksyczność. Przed pobraniem pseudotypowanych cząstek sprawdź kolor transfekowanych supernatantów komórkowych HEK-293T/17. Zazwyczaj po 48 godzinach transfekcji kolor pożywki do hodowli komórkowej nabiera pomarańczowo-różowego odcienia. Żółte podłoże zwykle przekłada się na słabą wydajność pseudotypowanych cząstek i często jest wynikiem problemów z gęstością wysiewu komórek lub wysoką liczbą pasaży.
W tym protokole produkcja pseudotypowanych cząstek odbywa się w formacie płytki 6-dołkowej. Aby zwiększyć objętość wytwarzanych cząstek, kilka studzienek na 6-dołkowej płytce można transfekować tą samą mieszanką plazmidów, a supernatanty można połączyć ze sobą. Pula może być następnie klarowana, filtrowana i porcjowana. Alternatywnie, w celu zwiększenia skali produkcji, można zastosować inne rodzaje naczyń (np. kolby 25 cm lub 75cm2 ). W takim przypadku warunki transfekcji powinny być odpowiednio zwiększone. W tym protokole test zakaźności jest wykonywany przy użyciu 24-dołkowej płytki i luminometru, który umożliwia pomiary tylko jedną probówką na raz. W przypadku przesiewów o wysokiej przepustowości możliwe są również inne formaty, takie jak format płytki 96-dołkowej i luminometr z czytnikiem płytek. Objętości i odczynniki do testu lucyferazy muszą być odpowiednio dostosowane. Przechowywanie pseudotypowanych cząstek w kriowiałach w temperaturze -80 °C utrzymuje ich stabilność przez kilka miesięcy bez zauważalnego spadku zakaźności. Nie zaleca się poddawania ich cyklom zamrażania i rozmrażania, ponieważ z czasem zmniejszy to ich zakaźność. Dlatego najlepiej przechowywać je w małych porcjach, takich jak 0,5–1 ml i rozmrozić przed infekcją.
Przedstawiona tutaj metoda ma kilka ograniczeń. Ważną z nich jest fakt, że pseudotypowane cząstki podsumowują tylko zdarzenia związane z wnikaniem wirusa. Aby przeanalizować inne etapy cyklu życia infekcji, wymagane są inne testy. Ponadto, ponieważ cząsteczki MLV pączkują na błonie plazmatycznej, ważne jest, aby pamiętać, że badana glikoproteina otoczki musi również przemieszczać się do błony plazmatycznej w celu włączenia do pseudowirionów podczas produkcji. W związku z tym ważne jest, aby wiedzieć, gdzie w komórce ulega ekspresji określona glikoproteina otoczki wirusa w warunkach transfekcji, na przykład poprzez wizualizację lokalizacji subkomórkowej za pomocą testu immunofluorescencyjnego i / lub sprawdzenie sygnałów retencji w białku. Ponadto, chociaż protokół opisuje etapy produkcji i testowania zakaźności, nie wyszczególnia, w jaki sposób mierzyć włączenie glikoprotein otoczki wirusa do pseudotypowanych cząstek. Jedną z metod jest przeprowadzenie testów western blot na skoncentrowanych roztworach cząstek, jak opisano wcześniej50,51 dla inkorporacji MERS-CoV S. W tych testach glikoproteina otoczki S MERS-CoV jest badana wraz z białkiem kapsydu (p30) MLV, co pozwala nam znormalizować włączanie białka S do cząstek. Inne przykłady takich testów analizujących inkorporację glikoproteiny otoczki wirusa do pseudowirionów przeprowadzono w przypadku włączenia SARS-CoV S do systemu pseudowirionu lentiwirusa HIV-132 , glikoproteiny Ebola (GP) w innym systemie cząstek z pseudotypem MLV17 oraz hemaglutyniny grypy (HA) i neuraminidazy (NA) w pseudowirionach VSV38. Najnowszym osiągnięciem w charakterystyce produkcji cząstek pseudotypowanych jest zastosowanie innowacyjnych urządzeń do obrazowania, takich jak Nanosight: umożliwia nam one bezpośrednią wizualizację, kwantyfikację i wymiarowanie cząstek wirusa50. Urządzenie dostarcza szczegółowych informacji na temat ogólnej produkcji cząstek; Należy jednak pamiętać, że nie zawiera on informacji na temat włączenia glikoproteiny otoczki. Przyszłym kierunkiem zastosowania tych wszechstronnych cząstek pseudowirionu jest analiza pojedynczych zdarzeń fuzji wirusów za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek, mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego 60,61,62. Takie podejścia z powodzeniem zastosowano w odniesieniu do wirusa grypy i cząstek koronawirusa kotów, a także pseudowirionów VSV opartych na wirusie grypyHA i NA 63. Obecnie trwają prace nad zastosowaniem takich technik w odniesieniu do cząstek MLV opartych na pseudotypie S koronawirusa.

Wejście do komórki gospodarza stanowi początkowy etap cyklu życia wirusa zakaźnego. W przypadku wirusów otoczkowych polega to na wiązaniu się z pojedynczym receptorem komórki gospodarza lub kilkoma receptorami, a następnie fuzji błon wirusowych i komórkowych. Te podstawowe funkcje są realizowane przez glikoproteiny otoczki wirusa1,2. Glikoproteina otoczki koronawirusa nazywana jest białkiem kolca (S) i należy do białek fuzji wirusów klasy I2,3,4,5,6. Badanie glikoprotein otoczki wirusa ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu ważnych cech danego wirusa, takich jak: inicjacja cyklu życia, jego tropizm gospodarza i komórek, transmisja międzygatunkowa, patogeneza wirusa, a także szlaki wnikania do komórek gospodarza. Cząsteczki pseudotypowane wirusem, zwane również pseudowirionami, są potężnymi narzędziami, które umożliwiają nam łatwe badanie funkcji białek fuzyjnych wirusa. Cząstki pseudotypowane lub pseudowiriony to chimeryczne wiriony, które składają się z zastępczego rdzenia wirusa z heterologicznym białkiem otoczki wirusa na ich powierzchni. Głównym celem protokołu jest pokazanie, w jaki sposób uzyskać cząstki pseudotypowane przez kolce koronawirusa, które są oparte na rdzeniu wirusa białaczki myszy (MLV) i zawierają gen reporterowy lucyferazy. Jako przykłady przedstawiono metodę wytwarzania pseudotypowanych cząstek z białkami kolców koronawirusów wysoce zjadliwego zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS) i bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS). Protokół opisuje procedurę transfekcji, sposób infekowania podatnych komórek docelowych oraz ilościowe oznaczanie zakaźności za pomocą testu lucyferazy.
Ponieważ etapy wejścia pseudowirionów są regulowane przez koronawirusa S na ich powierzchni, dostają się one do komórek w podobny sposób jak ich rodzime odpowiedniki. W związku z tym są doskonałymi substytutami funkcjonalnych testów zakaźności. Cząstki pseudotypowane zwykle pochodzą od wirusów modelu rodzicielskiego, takich jak retrowirusy (MLV7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 i ludzki wirus niedoboru odporności lentiwirusa — HIV23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35) lub rabdowirusy (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej — VSV36,39,40,41,42,43,44,45,46,47). W przypadku pseudotypowania, genomy wirusów rodzicielskich są modyfikowane w celu usunięcia niezbędnych genów, co czyni je wadliwymi do osiągnięcia pełnego cyklu replikacji. Ta cecha pozwala na stosowanie ich w obiektach o średnim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) i stanowi ważną zaletę w porównaniu z używaniem wysoce zjadliwych wirusów rodzimych, które wymagają urządzeń o wyższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3, BSL-4, które nie są tak łatwo dostępne) podczas prowadzenia badań nad wnikaniem wirusów. W tym przypadku białka S patogenów grupy ryzyka 3 SARS-CoV i MERS-CoV są wykorzystywane jako przykłady białek otoczki wirusa włączanych do pseudotypowanych cząstek MLV, generując pseudowiriony SARS-CoV S i MERS-CoV S (odpowiednio SARS-Spp i MERS-Spp). Te pseudowiriony zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach koncentrujących się na zdarzeniach związanych z wnikaniem tych wirusów48,49,50,51. Kolejną zaletą jest to, że opisana tutaj technika nie ogranicza się do pseudotypowania białek koronawirusa S: jest bardzo elastyczna i może być wykorzystana do włączenia przedstawicieli wszystkich trzech klas wirusowych białek fuzyjnych. Przykłady obejmują hemaglutyninę grypy (HA, klasa I)52, glikoproteinę wirusa Ebola (GP klasa I), białko E1 alfawirusa Semliki Forest (SFV, klasa II) i glikoproteinę VSV (G, klasa III)53. Ponadto więcej niż jeden rodzaj wirusowej glikoproteiny może być współwłączony do pseudotypowanej cząstki, jak w przypadku pseudotypowanych cząstek grypy HA i NA-51.
Na podstawie pracy wykonanej przez Bartosch et al.20, ten protokół opisuje generowanie pseudotypowanych cząstek MLV ze strategią kotransfekcji trójplazmidowej przy użyciu powszechnie dostępnej i wysoce kompetentnej w transfekcji linii komórkowej HEK-293T54. Pierwszy plazmid koduje geny rdzeniowe MLV gag i pol, ale brakuje mu genu env otoczki MLV. Drugi plazmid jest wektorem transferowym, który koduje gen reporterowy lucyferazy świetlika, sygnał pakowania MLV Ψ-RNA, wraz z 5'- i 3'-flankującymi regionami MLV z długim powtórzeniem końcowym (LTR). Trzeci plazmid koduje białko fuzyjne będące przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku białko SARS-CoV S lub MERS-CoV S. Po jednoczesnej transfekcji trzech plazmidów za pomocą odczynnika do transfekcji, wirusowe RNA i białka ulegają ekspresji w transfekowanych komórkach, umożliwiając wytwarzanie pseudotypowanych cząstek. Ponieważ MLV jest używany jako szkielet pseudowirionu, zachodzi to na błonie plazmatycznej: RNA zawierające reporter genu lucyferazy i sygnał pakowania są zamykane w powstających cząsteczkach, które zawierają również białka kolca koronawirusa wyrażane przez błonę plazmatyczną. Cząsteczki, które wyrastają z komórek, zawierają białko S koronawirusa na swojej powierzchni i są zbierane w celu wykorzystania w testach zakaźności. Ponieważ pseudotypowane cząstki zawierają białko S koronawirusa, a nie białko otoczki MLV, gdy są używane do infekowania komórek, zachowują się jak ich rodzime odpowiedniki koronawirusa na etapach wejścia. Wirusowe RNA zawierające reporter lucyferazy i flankujące LTR jest następnie uwalniane w komórce, a aktywność polimerazy retrowirusowej umożliwia jego odwrotną transkrypcję do DNA i integrację z genomem komórki gospodarza. Kwantyfikacja zakaźności pseudotypowanych cząstek wirusa w zakażonych komórkach jest następnie przeprowadzana za pomocą prostego testu aktywności lucyferazy. Ponieważ sekwencja DNA, która zostaje zintegrowana z genomem komórki gospodarza, zawiera tylko gen lucyferazy i nie zawiera żadnego z genów MLV lub genu kodującego białko koronawirusa, są one z natury bezpieczniejsze w użyciu niż wirusy natywne zdolne do replikacji.
Oprócz tego, że są bezpieczniejszymi substytutami i wysoce elastycznymi elementami umożliwiającymi włączenie różnych rodzajów glikoprotein otoczkowych, opisane tutaj pseudotypowane cząstki są również bardzo wszechstronne i mogą być używane do badania wielu aspektów wnikania wirusa. Obejmuje to między innymi: badanie podatności komórek gospodarza na infekcję wirusową, analizę szlaków wnikania do komórek wykorzystywanych przez wirusa otoczkowego, badanie skutków inhibitorów farmakologicznych i badań przesiewowych leków, przeprowadzanie testów przeciwciał neutralizujących, charakteryzowanie wnikania do komórek gospodarza wirusów otoczkowych, których nie można hodować, oraz generowanie wektorów wirusowych do dostarczania genów, stabilną ekspresję komórkową genów będących przedmiotem zainteresowania, lub wyciszanie genów.

<table><tbody><tr><td>Nerka ludzka (HEK) HEK-293T/17 komórki&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Klon 17 komórek jest wysoce kompetentny do transfekcji.</td></tr><tr><td>Afrykańska zielona małpa nabłonek nerki Komórki Vero-E6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki wątrobowe Huh-7&nbsp;</td><td>Japońskie Narodowe Instytuty Innowacji Biomedycznych, Zdrowia i Żywienia</td><td>JCRB0403</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ze światłem odwróconym z 10 & razy; obiektyw&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Modyfikacja pożywki Eagle's (DMEM) o 4,5 g/L glukozy, L-glutamina bez pirogronianu sodu</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>1614071</td><td></td></tr><tr><td>1 M Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES)&nbsp;</td><td>Corning Mediatech</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>100 &razy; roztwór penicyliny-streptomycyny (PS)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) z Ca2+ i Mg2+&nbsp;</td><td>Corning Mediatech</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna, 2,21 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 1 & razy; roztwór&nbsp;</td><td>Corning Mediatech</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek z siatkami&nbsp;</td><td>Kova</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; M Sterylny filtr o wielkości porów&nbsp;</td>Strzykawki <td>Pall</td><td>4184</td><td></td></tr><tr><td>10 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>5 & razy; Bufor do lizy do oznaczania lucyferazy&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna, substrat do oznaczania lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda&nbsp;</td>Luminometr <td>VWR</td><td>E476-1L</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 20/20&nbsp;</td><td>Opony Promega</td><td>2030-100</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Protokół ma na celu wygenerowanie pseudotypowanych cząsteczek białka fuzyjnego koronawirusa (CoV) z rdzeniem wirusa mysiej białaczki (MLV) i reporterem lucyferazy, przy użyciu prostej procedury transfekcji powszechnie dostępnej linii komórkowej HEK-293T. Po utworzeniu i uwolnieniu z komórek produkcyjnych, te pseudowiriony zawierają gen reporterowy lucyferazy. Ponieważ na ich powierzchni znajduje się tylko heterologiczne białko kolca koronawirusa, cząsteczki zachowują się jak ich rodzime odpowiedniki koronawirusa w przypadku etapów wejścia. W związku z tym są doskonałymi substytutami natywnych wirionów do badania wnikania wirusa do komórek gospodarza. Po pomyślnym wniknięciu i zakażeniu do komórek docelowych, reporter lucyferazy integruje się z genomem komórki gospodarza i ulega ekspresji. Za pomocą prostego testu lucyferazy transdukowane komórki można łatwo określić ilościowo. Istotną zaletą zabiegu jest to, że może być on wykonywany w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) zamiast w obiektach BSL-3 wymaganych do pracy z wysoce zjadliwymi koronawirusami, takimi jak koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV) i koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV). Kolejną zaletą jest jego wszechstronność, ponieważ można go stosować do białek otoczkowych należących do wszystkich trzech klas wirusowych białek fuzyjnych, takich jak hemaglutynina grypy (HA) klasy I i glikoproteina wirusa Ebola (GP), białko E1 wirusa leśnego Semliki klasy II lub glikoproteina wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej klasy III. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że może ona jedynie podsumować etapy wnikania wirusa, w których pośredniczy badane białko otoczki. Do badania innych etapów cyklu życiowego wirusa potrzebne są inne metody. Przykłady wielu zastosowań, w których te cząstki pseudotypu mogą być wykorzystywane, obejmują badanie podatności komórek gospodarza i tropizmu oraz testowanie wpływu inhibitorów wnikania wirusa w celu przeanalizowania stosowanych szlaków wnikania wirusa.

Reprezentatywne wyniki testów zakaźności cząsteczek pseudotypowanych białkiem S SARS-CoV i białkiem S MERS-CoV przedstawiono na Rysunek 1Zgodnie z oczekiwaniami, dla obu Rysunek 1A i 1Bcząsteczki kontroli pozytywnej pseudotypowane białkiem G wirusa VSV (VSV-Gpp) wykazały bardzo wysoką średnią zakaźność w 106 do 107 zakresy względnych jednostek lucyferazy (RLU) odpowiednio. Dla cząstek pseudotypizowanych białkiem S wirusa SARS-CoV (Rycina 1A) zakażeniam podatnych komórek Vero-E6, zmierzono wysoką średnią zakaźność na poziomie około 9,8 x 104 RLU. Wartość ta jest niemal o 3 rzędy wielkości wyższa od wartości zmierzonych dla kontroli niezinfekowanej (1,1 x 102 RLU), lub cząsteczki Δenv (1,5 x 102 RLU), które nie posiadają glikoprotein otoczki wirusowej na swojej powierzchni. Podobnie w przypadku cząsteczek pseudotypowanych białkiem S MERS-CoV (Rycina 1B) zakażenia komórek Huh-7 zmierzono wysoką średnią zakaźność na poziomie około 1,0 x 106 RLU. Jest to wartość niemal o 4 rzędy wielkości wyższa niż wartości zmierzone dla kontroli nieinfekowanej (0,8 x 102 RLU), lub cząsteczki Δenv (2,0 x 102 RLU). Przeprowadzono dodatkowy test zakaźności, w którym rozcieńczano seryjnie SARS-Spp i MERS-Spp, a następnie wykorzystano je do zakażenia komórek Vero-E6 (Rysunek 2A). Test ten potwierdza, że zmierzona aktywność lucyferazy zależy od stężenia cząsteczek wykorzystanych do zakażenia komórek. Aby potwierdzić rolę konwertazy angiotensyny 2 (ACE2) oraz dipeptydylopeptydazy 4 (DPP4) – odpowiednio receptorów SARS-CoV i MERS-CoV – w pośredniczeniu w przywieraniu i wnikaniu pseudotypowanych cząsteczek, wykorzystaliśmy słabo podatne komórki HEK-293T i poddano je transfekcji w celu ekspresji ACE2 lub DPP4 (Rysunek 2B). Przetransfekowane komórki wykorzystano następnie do testu zakaźności. Analiza ta wykazuje, że po nadekspresji ACE2 i DPP4 następuje odpowiednio około 4-logowy i 2-logowy wzrost zakaźności dla SARS-Spp i MERS-Spp, co potwierdza, że wykorzystanie receptorów przez pseudowirusy jest podobne do tego, które ma miejsce w przypadku wirusów natywnych.
Przedstawione tutaj przykłady obrazują znaczenie uwzględnienia zarówno kontroli negatywnej (cząstki niezakaźne, Δenv), jak i kontroli pozytywnej (VSV-Gpp) podczas wytwarzania cząstek pseudotypizowanych. W rzeczywistości cząstki kontroli pozytywnej VSV-Gpp pozwalają ocenić, czy dana partia cząstek pseudotypizowanych skutecznie zaowocowała uzyskaniem funkcjonalnych i zakaźnych pseudowirionów. Oczekiwane wyniki typowej infekcji cząstkami VSV-Gpp w większości linii komórek ssaków mieszczą się w przedziale 106−107 Zakres RLU. Problemy z komórkami producentami HEK-293T/17 (wysoka liczba pasaży, problemy z gęstością komórek) lub niska wydajność transfekcji mogą wpływać na ogólną produkcję i zakaźność pseudotypowanych cząsteczek. Ponadto istotne są warunki kontroli negatywnej, ponieważ pozwalają one ocenić poziomy bazowe pomiarów RLU w danej linii komórkowej (warunki bez infekcji) oraz nieswoistą internalizację cząsteczek (infekcja Δenv), która nie jest zapośredniczona przez białko otoczki wirusa. W przypadku danego typu cząsteczek pseudotypowanych z badanym białkiem otoczki wirusa zaleca się uzyskanie wartości o kilka rzędów wielkości wyższych niż wartości kontroli negatywnej, co przedstawiono tutaj w Rysunek 1A,BJednakże, jeśli w przypadku danego typu komórek infekcja wirusem pseudotypowanym wykazuje bardzo niską zakaźność (tzn., bliskie kontrolom negatywnym, takim jak w Rysunek 2B (w warunkach N.T. dla komórek nietransfekowanych) nie musi to oznaczać, że produkcja pseudotypowanych cząsteczek była wadliwa. Możliwe jest, że zastosowana linia komórkowa nie jest lub jest słabo podatna na infekcję. Zaleca się sprawdzenie, czy dany typ komórek powinien być podatny na infekcję badanym wirusem. Transfekcja słabo podatnych komórek plazmidem (lub plazmidami) wykazującym ekspresję receptorów wirusowych może umożliwić wydajniejsze wnikanie i infekcję wirusa, co pokazano w Rycina 2Bgdzie po transfekcji receptorów ACE2 i DPP4 w docelowych komórkach HEK-293T obserwuje się odpowiednio około 4- i 2-logowy wzrost zakaźności.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plazmid/odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-MLVgagpol plazmid kodujący MLV gag i pol</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wektor transferowy pTG-Luc z reporterem lucyferazy</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S lub pusty wektor</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do hodowli komórkowych o obniżonej zawartości surowicy</td>
			<td>Do 50 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Ilości plazmidów i zredukowanej pożywki do hodowli komórkowych z surowicą wymagane do transfekcji jednego dołka płytki 6-dołkowej z komórkami HEK-293T/17 w celu produkcji pseudotypowanych cząstek.Na podstawie stężenia preparatów plazmidowych należy obliczyć objętość wymaganą do uzyskania potrzebnej ilości plazmidowego DNA. Jeśli transfekowana jest więcej niż jedna studnia tymi samymi plazmidami, należy pomnożyć objętości przez liczbę studni do transfekcji i uwzględnić w obliczeniach dodatkową studnię, aby uniknąć wyczerpania mieszaniny w późniejszych etapach. Całkowita ilość transfekowanego DNA wynosi 1 µg/studnię. Plazmidy są dostępne na prośbę do autorów.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do transfekcji</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do hodowli komórkowych z obniżoną zawartością surowicy</td>
			<td>47 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ilości odczynnika do transfekcji i pożywki do hodowli komórkowej z obniżoną zawartością surowicy wymagane do transfekcji jednej studni płytki 6-dołkowej z komórkami HEK-293T/17 w celu produkcji pseudotypowanych cząstek.Pomnóż objętości przez wymaganą liczbę studni do transfekcji i uwzględnij w obliczeniach dodatkowe studnie, aby uniknąć wyczerpania mieszaniny w późniejszych etapach. Zastosowany stosunek odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA wynosi 3:1.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący aktywność lucyferazy w komórkach Vero-E6, Huh-7; białka VSV-Gpp, SARS-Spp, MERS-Spp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Testy zakaźności pseudotypowanych cząsteczek S koronawirusów w podatnych komórkach gospodarza z wykorzystaniem szkieletu wirusa białaczki mysiej (MLV) i genu reporterowego lucyferazy. (A) Test zakaźności cząsteczek pseudotypowanych białkiem S SARS-CoV w komórkach Vero-E6. (B) Test zakaźności cząsteczek pseudotypowanych białkiem S MERS-CoV w komórkach Huh-7. Dla obu paneli (A) i (B) naniesione dane odpowiadają średnim względnym jednostkom lucyferazy z trzech niezależnych eksperymentów, a słupki błędów odpowiadają odchyleniu standardowemu (s.d.). Dane na osi y przedstawiono w skali log10. N.I.: kontrola niezakażona; Δenv: zakażenie cząsteczkami pseudotypowanymi pozbawionymi glikoprotein otoczki wirusa; VSV-Gpp: zakażenie cząsteczkami pseudotypowanymi z glikoproteiną otoczki VSV G jako kontrolą pozytywną. Inne użyte skróty: SARS-Spp: zakażenie cząsteczkami pseudotypowanymi białkiem S SARS-CoV, MERS-Spp: zakażenie cząsteczkami pseudotypowanymi białkiem S MERS-CoV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący aktywność lucyferazy w komórkach Vero-E6 i HEK-293T w badaniu infekcji SARS/MERS-Spp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zależność zakaźności pseudowirionów białka S CoV od stężenia oraz rola receptorów ACE2 i DPP4 w wnikaniu SARS-Spp i MERS-Spp. (A) Zależność zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp od stężenia mierzona za pomocą testu aktywności lucyferazy. Pseudowiriony poddano rozcieńczeniom seryjnym i wykorzystano je do zakażenia komórek Vero-E6. (B) Test zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp w słabo podatnych komórkach docelowych HEK-293T przetransfekowanych w celu ekspresji odpowiednio receptorów ACE2 i DPP4. Dane naniesione na osi y w skali log10, analogicznie do Ryciny 1, z eksperymentów powtórzonych dwukrotnie; słupki błędów odpowiadają odchyleniu standardowemu (s.d.). N.T.: nieprzetransfekowane komórki kontrolne HEK-293T; ACE2: konwertaza angiotensyny 2 (receptor SARS-CoV) i DPP4: dipeptydyl peptydaza 4 (receptor MERS-CoV). Pozostałe użyte skróty są zgodne z Rycyną 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Protokół ten pozwala naukowcom na generowanie wirusów pseudotypowych, które można bezpiecznie wykorzystać do badania zdarzeń związanych z wnikaniem wysoce zjadliwych wirusów, takich jak koronawirus sal i większość koronawirusów. Ta wszechstronna technika opiera się na łatwej w konfiguracji transfekcji przejściowej. System ten może być również stosowany do wytwarzania cząstek pseudotypowanych białkami fuzyjnymi innych wirusów, nie tylko koronawirusa S. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ważne jest monitorowanie zdrowia i gęstości komórek pod kątem transfekcji, a także infekcji wirusem pseudotypowym.Tę procedurę zademonstrują Tiffany Tang i Lakshmi Nathan. Doktoranci z mojego laboratorium. Na początek ostrożnie umyj HEK293T komórki 10 mililitrami 37 stopni Celsjusza, dwukrotnie podgrzanym DPBS.Następnie odessać supernatant i przymocować komórki jednym mililitrem 25% roztworu trypsyny, który został wstępnie podgrzany w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj kolbę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez trzy do pięciu minut, aż komórki zaczną się odłączać. Dodaj cztery mililitry kompletnego DMEM, aby dezaktywować roztwór trypsyny.A następnie policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego. Rozcieńczyć komórki do 500 000 komórek na mililitr za pomocą kompletnego DMEM. Następnie wysiew dwa mililitry roztworu komórkowego na dołek na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.I delikatnie przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Po upewnieniu się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc lub 16 do 18 godzin. Aby przygotować kotransfekcję trzech plazmidów, najpierw wymieszaj obliczone objętości plazmidów i zredukowaną pożywkę do hodowli komórek surowicy w mikroprobówce wirówkowej.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodać trzy mikrolitry na studzienkę odczynnika do transfekcji na bazie lipidów do 47 mikrolitrów na studzienkę zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie w mikroprobówce wirówkowej wymieszaj równe ilości odczynnika do transfekcji i roztworów plazmidu za pomocą kilkakrotnie kierując rurkę w górę iw dół. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po całonocnej inkubacji płytki komórkowej użyj mikroskopu światła odwróconego, aby zbadać komórki pod kątem ich morfologii i gęstości.Następnie odessać zużytą pożywkę komórkową i delikatnie dodać jeden mililitr na dołek wstępnie podgrzanej zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy do każdej studzienki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu transfekcji do każdej studzienki kroplami. I inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez cztery do sześciu godzin.Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanego DMEM do transfekcji bez antybiotyków w temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołka. I inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Aby rozpocząć zbieranie cząstek pseudotypowych, użyj mikroskopu światła odwróconego, aby zbadać komórki pod kątem ich morfologii i ogólnego stanu.Kolor podłoża powinien być jasnoróżowy lub lekko pomarańczowy. Następnie przenieś supernatanty transfekowanych komórek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów. Odwiruj probówki pod ciśnieniem 290-krotności grawitacji przez siedem minut, aby usunąć resztki komórek.Następnie przefiltruj sklarowany supernatant przez sterylny filtr o wielkości porów 0,45 mikrona. Wykonaj porcje o małej objętości roztworu wirusa pseudotypu w fiolkach kriogenicznych. I przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić infekcję cząstkami pseudotypowymi, najpierw zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że istnieje zlewający się dywan komórek. Następnie umyj komórki trzykrotnie 0,5 mililitra wstępnie podgrzanego DPBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odessać supernatanty komórek i zaszczepić komórki 200 mikrolitrami rozmrożonego roztworu pseudotypowanych cząstek.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną do dwóch godzin. Po okresie inkubacji dodać 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEMc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I inkubować zainfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.Na koniec odessać supernatanty zainfekowanych komórek. I poprzedza test reporterowy lucyferazy. Aby określić ilościowo zakaźność pseudotypowanych cząstek, najpierw rozmrozić substrat lucyferyny, przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, w pięciokrotnym buforze do lizy testu lucyferazy przechowywanym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej.Następnie rozcieńczyć bufor do lizy do testu lucyferazy do jednorazowego stężenia sterylną wodą. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego buforu do każdej studzienki. I inkubować w temperaturze pokojowej na bujaczku przez 15 minut.Aby wykonać pomiar aktywności lucyferazy, po jednym dołku na raz, najpierw dodaj 20 mikrolitrów substratu lucyferyny do probówki z mikrowirówką. Następnie dodaj 10 mikrolitrów lizatu do probówki. Wymieszaj zawartość, delikatnie przesuwając tubki.I umieściłem rurkę w luminometrze. Zamknij pokrywę i zmierz wartość luminescencji rurki. Zapisz pomiar względnych jednostek światła i zastąp analizą danych.Testy zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp w podatnych komórkach gospodarza wykazały silną średnią zakaźność w porównaniu z oczekiwanymi cząstkami kontroli pozytywnej. Niezakażone kontrole i cząstki kontroli ujemnej pozbawione glikoprotein otoczki wirusa. Również testy aktywności lucyferazy wykazały zależność zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp od stężenia.Wzrost zakaźności SARS-Spp lub MERS-Spp w słabo permisywnych komórkach docelowych, transfekowanych w celu ekspresji receptora ACE2 SARS-Spp lub receptora DPP4 MERS-Spp, potwierdza, że wykorzystanie receptorów pseudowirionów jest podobne do wykorzystania wirusów NATO do pośredniczenia w przyłączaniu i wnikaniu pseudowirionów. Przed wykonaniem tego kroku dokładnie sprawdź obliczenia. I upewnij się, że wszystkie roztwory są dobrze wymieszane podczas tego kroku.Test western blot można przeprowadzić na skoncentrowanych pseudotypowanych cząstkach w celu oceny włączenia glikoproteiny S do pseudowirionów. Podczas gdy opisane tutaj pseudotypowane cząstki są bezpieczniejszymi substytutami niż wirusy NATO, nadal wymagają środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

production-pseudotyped-particles-to-study-highly-pathogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Tetrarazystroniczne cząstki wirusopodobne zawierające replikację i transkrypcję (trVLP) reprezentują system modelowania cyklu życia, który pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, opierając się wyłącznie na składnikach wirusa Ebola.

Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Chociaż badacze są ogólnie zaznajomieni z procedurami i środkami ostrożności wymaganymi do eksperymentów na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 lub 2 (BSL-1/2), mogą nie być zaznajomieni z procedurami eksperymentalnymi w laboratoriach kombinezonów BSL-4. Ten artykuł zawiera szczegółową wizualną demonstrację systemów laboratoryjnych kombinezonu BSL-4 sprawdzania, procedur wejścia, przemieszczania i wychodzenia z laboratorium.

Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a) BSL-4: 1. Procedury wejścia i wyjścia z kombinezonu laboratoryjnego poziomu bezpieczeństwa biologicznego 4

Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych cząstek koronawirusów MERS i SARS w warunkach BSL-2. Technika ta umożliwia bezpieczne badanie wnikania wirusa do komórek gospodarza z wykorzystaniem reportera lucyferazy.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Przeglądaj więcej filmów