Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Protokół ten pozwala nam łatwo zbadać cechy epigenetyczne choroby neurodegeneracyjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje drożdże jako system modelowy, w porównaniu z innymi komórkowymi i zwierzęcymi modelami chorób neurodegeneracyjnych, drożdże są celowe i opłacalne. Technika ta pozwala nam zmapować zmiany epigenetyczne, które powstają w chorobie neurodegeneracyjnej, co może prowadzić do nowych markerów diagnostycznych, a także nowych celów terapii.

Metoda ta pozwala na dalsze badania roli znaczników epigenetycznych w chorobach neurodegeneracyjnych i może być modyfikowana w celu oceny ludzkich fibroblastów i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta konkretna metoda zawiera szereg szczegółów, które należy zademonstrować wizualnie, takich jak prawidłowe obciążenie aparatu Western blot. Procedurę zademonstrują Michel Fallah i Navin Rana, obaj naukowcy z laboratorium Torrente.

Zacznij od ponownego naniesienia drożdży z zamrożonego wywaru glicerolu na płytki z selektywnym agarem z 2% glukozą histydyny, na dwa do trzech dni inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zaszczepić drożdże z prążkami dla każdego modelu nadekspresji i kontroli w pięciu mililitrach selektywnej płynnej pożywki histydyny. Uzupełniony 2% rafinozą w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę, przez noc.

Następnego ranka wyhoduj 100 mililitrów płynnej kultury dla każdego z modeli nadekspresji i kontroli w selektywnych pożywkach uzupełnionych 2% galaktozą przez noc. I zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD600, aby określić objętość kultury nocnej potrzebnej do renderowania kultur ekspresji przy początkowym OD600 0,3. Aby wywołać nadekspresję białka, hoduj drożdże na pożywce galaktozy z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez odpowiedni okres doświadczalny.

Następnie zmierz OD600 w każdej kulturze pod koniec okresu indukcji. I ustandaryzuj wszystkie liczby komórek do najniższej wartości OD600. Zbierz kultury w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze sterylnej, niegazowanej wody na każde 10 mililitrów wyhodowanej kultury.

Podwielokrotność jednego mililitra resuspension komórek do oddzielnych probówek mikrowirówek w celu dodatkowego odwirowania i odessania supernatantów. Następnie zatrzaskowo zamroź granulki komórek w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zlizować komórki do analizy Western blot, rozmrozić granulki komórek drożdży na lodzie przed ponownym zawieszeniem w 100 mikrolitrach wody destylowanej.

Dodaj 300 mikrolitrów 0,2-molowego wodorotlenku sodu i 20 mikrolitrów 2-merkaptoetanolu do każdej próbki komórki. I ponownie zawiesić granulki przez pipetowanie. Po 10-minutowej inkubacji na lodzie osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić próbki w 100 mikrolitrach barwnika ładującego.

Następnie gotuj próbki przez 10 minut na bloku grzewczym. Podczas lizy próbek umieść dwa żele w uchwycie na żel i wypełnij komorę wewnętrzną do góry buforem do pracy, a komorę zewnętrzną do znaku linii dwóch żeli. Gdy próbki są gotowe, załaduj po 15 mikrolitrów roztworu do lizy komórek do każdej studzienki 10 dołków, 12% żelu poliakryloamidowego i dodaj pięć mikrolitrów drabinki białkowej do dołka drabinki białkowej.

Uruchom żel na około 45 minut przy napięciu 150 V lub do momentu, gdy przód barwnika dotknie dna żelu. Podczas pracy żelu namocz dwie podkładki z włókna na żel w buforze transferowym i jedną membranę z polifluorku winylidenu lub PVDF na żel w metanolu. Gdy żel jest gotowy, przepłucz membranę w buforze transferowym i umieść jedną wstępnie namoczoną podkładkę z włókna na dnie półsuchej komórki aparatu do przenoszenia.

Następnie membrana PVDF, żel i druga wstępnie nasączona wkładka z włókna. Następnie ustaw moc na 150 miliamperów na godzinę. Pod koniec transferu białka zdjąć membranę z aparatu transferowego w celu krótkiego spłukania wodą destylowaną.

Umieść przepłukaną błonę stroną z białkiem do góry w małym pojemniku do barwienia i przykryj membranę solą fizjologiczną z tris-buforem lub TBS, blokując bufor na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Pod koniec inkubacji blokującej inkubować błonę przez noc z histonem przeciwdrożdżowym i przeciwciałem specyficznym dla modyfikacji w TBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I właściwe przeciwciało kontrolujące obciążenie jądrowe.

Następnego ranka umyj membranę cztery razy w TBS, uzupełnionym 0,1% polisorbatem 20 przez pięć minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej na pranie. Po ostatnim przemyciu inkubować blot z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie cztery pięciominutowe mycia w TBST i jedno pięciominutowe mycie w TBS samo z kołysaniem.

Następnie zobrazuj plamę na fluorescencyjnym systemie obrazowania Western blot przez dwie minuty. W tym przypadku wykazano zahamowanie wzrostu w kulturach stałych i płynnych ze znaczącym wpływem na wzrost drożdży obserwowany w obecności podawania galaktozy w modelach nadekspresji mięsaka. Obserwuje się znaczny spadek poziomów histonów w modelu nadekspresji fuzji w mięsaku i znaczny wzrost poziomów acetylacji histonów w modelu nadekspresji białka wiążącego TAR 43, których nie obserwuje się ani w modelu nadekspresji sfuzji w mięsaku, ani w modelu nadekspresji alfa synukleiny.

Występują również znaczne spadki poziomu histonów w modelu nadekspresji alfa synukleiny. W tym eksperymencie z sacharozą, im mniejsza ilość galaktozy użyta do indukcji fuzji w nadekspresji mięsaka, tym niższą toksyczność obserwuje się zarówno w kulturze stałej, jak i płynnej. Co ważne, im niższy poziom fuzji w nadekspresji mięsaka, tym mniejsza wielkość obniżenia poziomu histonów.

Podczas wykonywania tego protokołu konieczne jest ujednolicenie ilości drożdży w każdej próbce, aby umożliwić właściwe porównanie poziomów modyfikacji potranslacyjnej histonów. 2-merkaptoetanol należy stosować pod kapturem, aby uniknąć wdychania. Jeśli używana jest bejca Poneau, należy ją odpowiednio wyrzucić.