Name: Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu Saccharomyces cerevisiae chorób neurodegeneracyjnych ALS i Parkinsona. Technika Western blot pozwala mapować zmiany epigenetyczne i identyfikować potencjalne markery diagnostyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Royenie Tanaz, Hudzie Yousuf i Sadiqa Taasen za pomoc techniczną. Jesteśmy bardzo wdzięczni prof. Jamesowi Shorterowi za hojne dostarczenie odczynników i pomoc intelektualną w projektowaniu eksperymentów z strojeniem sacharozy. Plazmidy drożdży były hojnym darem od prof. Aarona Gitlera (w tym 303Gal-FUS; Plazmid Addgene # 29614). Brooklyn College i Centrum Badań nad Zaawansowaną Nauką (CUNY), a także NIH NINDS Advanced Postdoctoral Transition Award (K22NS09131401) wspierały MPT.

1. Przekształcanie S. cerevisiae za pomocą neurodegeneracyjnych konstruktów białkowych związanych z proteinopatią
<ol>
	<li>Drożdże typu dzikiego (WT) 303 uprawiać w bulionie z ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej (YPD) przez noc z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po 12−16 godzinach wzrostu rozcieńczyć drożdże do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,25 za pomocą YPD. Ponieważ do każdej przemiany potrzebne będzie 10 ml płynnej kultury drożdży, należy przygotować 50 ml płynnej kultury drożdży do pięciu przemian odpowiadających konstruktom FUS, TDP-43, a-synukleiny i tylko wektorom (ccdB), a także transformacji kontroli ujemnej bez DNA.</li>
	<li>Drożdże uprawiać mieszając w temperaturze 30 °C, aż do osiągnięcia OD600 między 0,60 a 0,80. Zwykle zajmuje to 4-6 godzin.</li>
	<li>Trzydzieści minut przed zakończeniem wzrostu drożdży zlinearyzuj konstrukty plazmidowe. 
	UWAGA: Użyte tutaj konstrukty plazmidowe muszą być zintegrowane bezpośrednio z genomem, a zatem linearyzacja jest wymagana przed transformacją.
	<ol>
		<li>Obliczyć objętość zapasu plazmidu, która wynosi 1 μg. Odejmij tę objętość od 44 μl, aby obliczyć ilość potrzebnej ilości wolnego od nukleazH2O.</li>
		<li>Dodać H2O wolne od nukleaz, 5 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego (tabela materiałów), 1 μl enzymu restrykcyjnego NheI (tabela materiałów) i odpowiednią ilość plazmidu (obliczoną w kroku 1.4.1) do probówki mikrowirówkowej. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Plazmid jest teraz zlinearyzowany i gotowy do transformacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy kultura drożdży osiągnie OD600 0,6-0,8, zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w dół przy 850 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad komórkowy w 10 ml sterylnegoH2Oi odwirować w temperaturze 850 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant. Powtórz 3 razy, w sumie cztery prania.</li>
	<li>Na początku trzeciego płukania rozmrozić i gotować 10 μl DNA plemników łososia na reakcję przemiany przez 5 minut na bloku grzewczym.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl dH2O na przemianę i rozbić na odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek. W przypadku pięciu przemian ponownie zawiesić osad w 500 μl dH2O i równomiernie rozbić na pięć oddzielnych probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 850 x g w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć całą pozostałą wodę.</li>
	<li>Dodać, w następującej kolejności, 50 μl sterylnegoH2O, 240 μl 50% glikolu polietylenowego (PEG), 36 μl 1 M LiAc, 10 μl DNA plemników łososia, 20 μl zlinearyzowanego plazmidowego DNA (lub wody wolnej od nukleaz bez transformacji kontrolnej DNA). Dokładnie wymieszaj po każdym dodaniu i krótko zmieszaj po dodaniu wszystkich składników przemiany.</li>
	<li>Inkubować reakcje przemian w temperaturze 42 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Przeprowadź tę inkubację w łaźni wodnej, aby uzyskać bardziej spójną kontrolę temperatury.</li>
	<li>Wirować przy 470 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 200 μl sterylnegoH2O.</li>
	<li>Zawiesinę drożdży na płytkach z selektywnymi podłożami i rozprowadzić za pomocą kulek do walcowania lub rozsiewacza. Inkubować płytki przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Płytki zdefiniowane syntetycznie (SD)-He są używane do opisywanych tutaj plazmidów.</li>
</ol>
2. Badanie tłumienia wzrostu i przechowywania kolonii w zasobach glicerolu
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedyncze kolonie z płytek transformacyjnych w 5 ml selektywnej pożywki uzupełnionej 2% rafinozą. Uprawiać na wytrząsarce w temperaturze 30 °C przez noc. Wybierz co najmniej 12 kolonii na transformację. 
	UWAGA: Nie oczekuje się żadnych kolonii na płytce kontrolnej transformacji "bez DNA".</li>
	<li>Wysterylizuj żabkę szpilkową etanolem, a następnie podpal.</li>
	<li>Dla każdej hodowli należy podać 100 μl nasyconej zawiesiny komórek w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej. Dodać 200 μl sterylnegoH2Odo wszystkich studzienek sąsiednich kolumn studzienkowych. W przypadku rozcieńczeń seryjnych w stosunku 1:5 dodać 50 μl z pierwszej kolumny do sąsiedniej kolumny z tyłu za pomocą pipety wielokanałowej. Dokładnie wymieszać pipetując. Następnie dodać 50 μl z drugiej kolumny do trzeciej kolumny i wymieszać pipetując. Powtórz to dla reszty talerza.</li>
	<li>Drożdże należy poszczepić, umieszczając froggera w 96-dołkowej płytce, a następnie stemplować, delikatnie i równomiernie dociskając selektywne płytki z galaktozą i bez galaktozy. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. 
	UWAGA: Płytki SD-His i SGal-His są używane do opisywanych tutaj plazmidów.</li>
	<li>W przypadku przemian FUS, TDP-43 i a-synukleiny zidentyfikuj kolonię wykazującą największą supresję wzrostu w obecności galaktozy. Wybierz tę kolonię z płytki SD-His i zaszczepij w 10 ml selektywnej pożywki uzupełnionej 2% rafinozą w celu wzrostu przez noc. Do kontroli wektora wybierz kolonię, która nie wykazuje zahamowania wzrostu w obecności galaktozy.</li>
	<li>Aby przygotować zapasy glicerolu, połącz 0,5 ml nasyconej płynnej kultury z 0,5 ml 50% glicerolu. Mieszać pipetując w górę i w dół i zamrażać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Zapasy glicerolu można przechowywać do roku w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Nadekspresja białek związanych z neurodegeneracyjną proteinopatią u S. cerevisiae
<ol>
	<li>Z zamrożonych zapasów glicerolu ponownie rozprowadzić drożdże na histydynie, 2% pochodnych pożywkach z agarem glukozowym i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Zaszczepić pojedyncze kolonie dla każdego z modeli nadekspresji i kontrolować w 5 ml selektywnej pożywki płynnej z histydyną uzupełnioną 2% rafinozą. Rosnąć przez wytrząsanie (200 obr./min) w temperaturze 30 °C przez noc.</li>
	<li>Hoduj 100 ml płynnej kultury dla każdego z modeli nadekspresji i kontroli (FUS, TDP-43 i kontrola wektorowa; kontrola a-synukleiny i wektora).
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 ml kultury w selektywnych pożywkach uzupełnionych 2% galaktozą.</li>
		<li>Zmierz OD600 kultur nocnych i oblicz ilość kultury nocnej potrzebnej do renderowania kultur nadekspresji przy początkowym OD600 wynoszącym 0,3. Zazwyczaj posiewy nocne osiągają OD600 0,9-10, co wymaga około 5 ml hodowli przez noc, aby rozpocząć 100 ml świeżej hodowli.</li>
		<li>Indukować nadekspresję białka poprzez hodowlę drożdży na pożywkach galaktozy (patrz krok 3.3.1) przez 5 godzin (FUS i TDP-43) lub 8 godzin (a-synukleina) z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz OD600 każdej kultury pod koniec okresu indukcji. Ustandaryzuj wszystkie liczby komórek do najniższej wartości OD600. Zebrać posiew w probówkach o pojemności 50 ml, odwirowując przy 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Jeśli wartości OD600 zmierzone na końcu indukcji wynoszą odpowiednio 0,654 i 0,984 dla 100 ml kultury a-synukleiny i 100 ml kultury kontrolnej, należy zebrać 95 ml kultury a-synukleinowej i 67,1 ml kultury kontrolnej.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml sterylnego dH2O na każde 10 ml wyhodowanej kultury. Równomiernie rozdrobnić osad, dzieląc 1 ml reprodukcji komórek do probówek do mikrowirówek. Na przykład, jeśli zaczynasz od 100 ml hodowli, ponownie zawieś osad w 10 ml sterylnego dH2O i podziel go na 10 probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Wirować przy 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Zatrzaskowe granulki komórek zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.</li>
</ol>
4. Liza komórek i western blot w celu wykrycia modyfikacji potranslacyjnych histonów
<ol>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Rozmrozić granulki komórek drożdży na lodzie i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μL dH2O.</li>
		<li>Do resuspensji komórek dodać 300 μl 0,2 M NaOH i 20 μl 2-merkaptoetanolu. Zawiesić pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Inkubować komórki na lodzie przez 10 minut, a następnie odwirować przy 3 200 x g na wirówce stołowej przez 30 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x barwnika ładującego i gotować przez 10 minut na bloku grzewczym. 
		UWAGA: Przepis na 6-krotne obciążenie barwnika można znaleźć w Tabeli Materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu i przenoszenie membrany
	<ol>
		<li>Przygotować komorę żelową, umieszczając dwa żele w uchwycie na żel i wypełniając wewnętrzną komorę do góry buforem do pracy i wypełniając komorę zewnętrzną do znaku linii dwóch żeli.</li>
		<li>Załadować 15 μl próbki z etapu 4.1.4 na studzienkę do 10-dołkowego żelu poliakrylamidowego o stężeniu 12%. W przypadku pasa drabinki białkowej załaduj 5 μl.</li>
		<li>Uruchom żel przez około 45 minut przy napięciu 150 V lub do momentu, gdy przód barwnika dotknie dna żelu.</li>
		<li>Podczas pracy żelu przygotuj się do przeniesienia membrany, mocząc podkładki z włókna (po dwie na żel) w buforze transferowym (tabela materiałów) i nasączając membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu. Przed transferem przepłukać membranę w buforze transferowym. 
		UWAGA: Membranę PVDF należy przyciąć do rozmiaru żelu i używać jednej membrany PVDF na każdy przenoszony żel.</li>
		<li>Na półsuchym ogniwie aparatu transferowego umieścić "kanapkę" transferową: od dolnej elektrody umieścić (1) wstępnie namoczoną podkładkę z włókna, (2) wstępnie namoczoną i przepłukaną membranę PVDF, (3) żel z kroku 4.2.3 i (4) drugą wstępnie namoczoną podkładkę z włókna. 
		UWAGA: Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza w "kanapce" do przenoszenia. Delikatnie zwiń "kanapkę" pipetą serologiczną, aby usunąć bąbelki. Po umieszczeniu żelu na membranie PDVF należy uważać, aby jej nie przesuwać.</li>
		<li>Przeprowadzić transfer białka, ustawiając zasilacz na 150 mA na 1 godzinę (na jedną "kanapkę").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie histonów PTM z przeciwciałami specyficznymi dla modyfikacji
	<ol>
		<li>Usunąć membranę z aparatu transferowego. Spłukać krótko dH2O.
		<ol>
			<li>Opcjonalnie sprawdź transfer białek za pomocą barwnika Ponceau-S, wlewając tyle barwnika Ponceau-S, aby pokryć błonę, do małego plastikowego pudełka i inkubując w temperaturze RT z delikatnym wstrząsem przez 30−60 s. Usuń plamę Ponceau-S i spłucz dH2O, aż plama tła zniknie, a pasma białkowe będą widoczne gołym okiem. Kontynuuj płukanie za pomocądH 2O, aż cała plama zostanie usunięta z membrany.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zablokuj błonę poprzez inkubację blot przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem za pomocą buforu blokującego bufor soli fizjologicznej tris (TBS) (Tabela materiałów) w małym pudełku do barwienia. Użyj wystarczającej ilości bufora blokującego, aby zakryć blot. 
		UWAGA: Uważaj, aby umieścić membranę pionowo w pudełku do barwienia, tak aby strona membrany, na której leżą białka, nie była skierowana w dół.</li>
		<li>Inkubować blot w pojemniku do barwienia przez noc z przeciwciałem specyficznym dla modyfikacji histonów, reagującym w stosunku do drożdży w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciało w buforze blokującym TBS zgodnie ze specyfikacją producenta. Uwzględnij również odpowiednią kontrolę obciążenia jądrowego, taką jak anty-całkowity H3 hodowany w innym gatunku gospodarza niż przeciwciało specyficzne dla modyfikacji. Na przykład, jeśli sondujesz H3S10ph za pomocą przeciwciała anty-H3S10ph wyhodowanego u królika, użyj przeciwciała anty-całkowitego H3 podniesionego u myszy jako kontroli obciążenia. W razie potrzeby powtórz to dla każdej plamy. 
		UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał można ponownie wykorzystać łącznie trzy razy w ciągu miesiąca. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj membranę 4x w domowym TBS + 0,1% polisorbat 20 (TBST) przez 5 min z bujaniem przy RT.</li>
		<li>Inkubować blot z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniach określonych przez producenta (osła anty-królik 680 i osł anty-mysz) przez 1 godzinę w RT. 
		UWAGA: Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe muszą być chronione przed światłem zarówno podczas przechowywania, jak i użytkowania. Przeprowadzić inkubację w ciemnych plastikowych pudełkach lub przykryć folią aluminiową.</li>
		<li>Pierz membranę 4x z TBST przez 5 min i pierz z TBS przez 5 min kołysząc w RT.</li>
		<li>Wizualizacja blot na fluorescencyjnym systemie obrazowania Western blot przez 2 minuty. Wizualizacja przeciwciał drugorzędowych anty-królików 680 i anty-myszy 800 w kanałach odpowiednio 800 nm i 700 nm. 
		UWAGA: Kontrpróby są przeprowadzane niezależnie, począwszy od sekcji 1. Konieczne jest sprawdzenie, czy odpowiedź sygnałowa przeciwciała mieści się w zakresie, w którym odpowiedź sygnałowa jest liniowa, w celu właściwej interpretacji danych w tych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych i statystyki
<ol>
	<li>Otwórz obraz plamy w oprogramowaniu do obrazowania (Tabela materiałów). Uzyskaj surową gęstość pasm specyficznych dla modyfikacji w próbkach kontroli wektorowej, TDP-43 i FUS (lub kontroli wektorowej i a-synukleiny), rysując prostokąt, który kadruje pasmo w trybie analizy.</li>
	<li>Powtórz krok 5.1 dla ładowania pasm kontrolnych. 
	UWAGA: W każdej próbce będzie dostępne pasmo kontroli obciążenia i pasmo specyficzne dla modyfikacji.</li>
	<li>Obliczyć gęstość względną pasm specyficznych dla modyfikacji, dzieląc każde pasmo przez gęstość odpowiadającego mu pasma w wektorowej próbie kontrolnej. Spowoduje to znormalizowanie danych do kontrolki wektora.</li>
	<li>Obliczyć gęstość względną pasma kontrolnego obciążenia, dzieląc każde pasmo przez gęstość odpowiadającego mu pasma kontroli obciążenia w próbce kontrolnej wektora.</li>
	<li>Obliczyć skorygowaną gęstość względną każdego pasma, dzieląc gęstość względną pasma specyficznego dla modyfikacji przez gęstość względną pasma kontrolnego obciążenia dla każdej próbki. Teraz dane można wizualizować w formie histogramu. 
	UWAGA: Aby ułatwić przetwarzanie, kroki 5.3–5.5 można wykonać w arkuszu kalkulacyjnym (plik uzupełniający).</li>
	<li>Po wielu niezależnych powtórzeniach należy przeprowadzić testy T Welcha między dwiema próbkami kontrolnymi i odpowiednim modelem proteinopatii (kontrola w porównaniu z FUS, kontrola w porównaniu z TDP-43 i kontrola w porównaniu z a-synukleiną) z p = 0,05 jako granicą istotności.</li>
</ol>

<ol><li>Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).</li>
<li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li>
<li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease%3A+a+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li>
<li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).</li>
<li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li>
<li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS%2FTLS+in+ALS+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li>
<li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tip+of+the+iceberg%3A+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+concepts+of+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li>
<li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP104+required+for+induced+thermotolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112(1990).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772(2003).</li>
<li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone%2C+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).</li>
<li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reveal+a+%E2%80%9CDruggable%E2%80%9D+Rsp5%2FNedd4+Network+that+Ameliorates+%CE%B1-Synuclein+Toxicity+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979(2013).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li>
<li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).</li>
<li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).</li>
<li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li>
<li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+sequestration+of+FUS%2FTLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li>
<li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+%28ALS%29+Causing+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li>
<li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson%E2%80%99s+disease%3A+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li>
<li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+the+%CE%B1-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół zapewnia prosty, celowy i opłacalny sposób kategoryzacji zmian PTM histonów w całym genomie skorelowanych z proteinopatiami neurodegeneracyjnymi. Chociaż istnieją inne modele ALS i PD, takie jak ludzkie linie komórkowe in vitro i mysie modele32, S. cerevisiae pozostaje atrakcyjny ze względu na łatwość użycia. Na przykład modele drożdży nie wymagają użycia sterylnego kaptura, ani nie wymagają intensywnego szkolenia, które towarzyszy pracy nad hodowlą komórko...

Choroby neurodegeneracyjne to wyniszczające choroby, które mają niewiele lub nie mają żadnych opcji leczenia. Wśród nich szczególnie przerażające są stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Parkinsona (PD). Około 90% przypadków ALS i PD uważa się za sporadyczne, występujące bez rodzinnego wywiadu choroby, podczas gdy pozostałe przypadki występują w rodzinach i są na ogół związane z określoną mutacją genu1,2. Co ciekawe, obie te choroby są związane z błędną lokalizacją i agregacją białek3,4,5,6. Na przykład połączone w mięsaku (FUS) i białko wiążące DNA TAR 43 (TDP-43) to białka wiążące RNA, które błędnie lokalizują się w cytoplazmie i agregują w ALS7,8,9,10,11,12, podczas gdy α-synukleina jest głównym składnikiem agregatów białkowych określanych jako ciała Lewy'ego w PD5,13,14,15.
Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków związanych z asocjacją całego genomu w dużych populacjach pacjentów, przytłaczająca większość przypadków ALS i PD pozostaje niewyjaśniona genetycznie. Czy epigenetyka może odgrywać rolę w chorobach neurodegeneracyjnych? Epigenetyka obejmuje zmiany w ekspresji genów zachodzące bez zmian w podstawowej sekwencji DNA16. Główny mechanizm epigenetyczny obejmuje modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek histonowych16. W komórkach eukariotycznych materiał genetyczny jest szczelnie owinięty chromatyną. Jednostką zasadową chromatyny jest nukleosom, składający się ze 146 par zasad DNA owiniętych wokół oktamera histonu, złożonego z czterech par histonów (po dwie kopie histonów H2A, H2B, H3 i H4)17. Każdy histon ma N-końcowy ogon, który wystaje z nukleosomu i może być modyfikowany przez dodanie różnych ugrupowań chemicznych, zwykle na resztach lizyny i argininy18. Te PTM są dynamiczne, co oznacza, że można je łatwo dodawać i usuwać, i obejmują grupy takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja. PTM kontrolują dostępność DNA dla maszynerii transkrypcyjnej, a tym samym pomagają kontrolować ekspresję genów18. Na przykład, acetylacja histonów zmniejsza siłę oddziaływania elektrostatycznego między wysoce zasadowym białkiem histonowym a ujemnie naładowanym szkieletem DNA, dzięki czemu geny upakowane przez acetylowane histony są bardziej dostępne, a tym samym wysoce ekspresyjne19. Ostatnio niezwykła swoistość biologiczna poszczególnych histonów PTM i ich kombinacji doprowadziła do hipotezy kodu histonowego20,21, w której białka, które zapisują, usuwają i odczytują histonowe PTM, działają zgodnie w celu modulowania ekspresji genów.
Drożdże to bardzo przydatny model do badania neurodegeneracji. Co ważne, wiele neuronalnych ścieżek komórkowych jest zachowanych od drożdży do ludzi22,23,24. Drożdże podsumowują fenotypy cytotoksyczności i inkluzje białek po nadekspresji FUS, TDP-43 lub α-synukleiny22,23,24,25,26. W rzeczywistości modele Saccharomyces cerevisiae ALS zostały wykorzystane do identyfikacji genetycznych czynników ryzyka u ludzi27. Co więcej, nadekspresja ludzkiej α-synukleiny drożdży pozwoliła na scharakteryzowanie sieci Rsp5 jako celu leczniczego w celu złagodzenia toksyczności α-synukleiny w neuronach28,29.
Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący Saccharomyces cerevisiae do wykrywania zmian PTM w całym genomie histonów związanych z neurodegeneracyjnymi proteinopatiami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zastosowanie S. cerevisiae jest bardzo atrakcyjne ze względu na łatwość użycia, niski koszt i szybkość w porównaniu z innymi modelami neurodegeneracji in vitro i zwierzęcymi. Wykorzystując wcześniej opracowane modele ALS i PD22,23,25,26, mamy nadekspresję ludzkiego FUS, TDP-43 i α-synukleiny w drożdżach i odkryliśmy wyraźne zmiany PTM histonów występujące w związku z każdą proteinopatią30. Protokół, który tutaj opisujemy, może zostać ukończony w mniej niż dwa tygodnie od transformacji do analizy danych.

<table><tbody><tr><td>-Jego suplement DO</td><td>Clontech</td><td>630415</td><td></td></tr><tr><td>10x Running Buffer</td><td></td><td></td><td>Mix: 141,65 g glicyny (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g zasady Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g dodecylosiarczanu sodu (Sigma-Aldrich L3771) i 1 l wody dejonizowanej, pH 8,8.</td></tr><tr><td>12% żele poliakrylamidowe</td><td>BIO-RAD</td><td>456-1041</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Antyacetylohiston H3 (Lys14) Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>MilliporeSigma</td><td>07-353 (nr partii 2762291)</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>Anty-acetylo-histon H4 (Lys 16) Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab109463 (Nr partii. GR187780)</td> <td>Rozcieńczenie: 1/2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe antyacetylohistonowe H4 (Lys12) Abcam</td><td></td><td>ab46983 (nr partii. GR71882)</td> <td>Rozcieńczenie: 1/5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe antydimetylohistonu H3 (Lys36) Abcam</td><td></td><td>ab9049 (nr partii. GR266894, GR3236147)</td> <td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne anty-histonowe H3</td><td>Abcam</td><td>ab24834 (nr partii. GR236539, GR174196, GR3194335)</td> <td>Kontrola obciążenia jądrowego; Rozcieńczenie: 1/2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyfosfo-histonowe H2B (Thr129) Pierwszorzędowe przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab188292 (nr partii. GR211874)</td> <td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe antyfosfo-histonu H3 (Ser10) Abcam</td><td></td><td>ab5176 (nr partii. GR264582, GR192662, GR3217296)</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>BioPhotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (100 x 20 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30702118</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych, 96-dołkowa</td><td>Eppendorf</td><td>30730011</td> Wirówka 5804<td></td></tr><tr><td>/5804 R/5810/5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszom IRDye 800 CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32212 (nr partii C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td><td>Rozcieńczenie: 1/5000</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td><td>LI-COR</td><td>926-68073 (nr partii C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td><td>Rozcieńczenie: 1/2500</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo gruby bibuła (bibuła filtracyjna)</td><td>BIO-RAD</td><td>1703968</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>Przygotować 20% m/v roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Przygotuj 20% w/v roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Przygotować 50% m/v roztwór.</td></tr><tr><td>Membrany transferowe Immobilon-FL</td><td>MilliporeSigma</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny (LiAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td>Przygotować 1 M roztwór.</td></tr><tr><td>Ładowanie mieszanki barwników</td><td></td><td></td><td>: 1,2 g dodecylosiarczanu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 ml glicerolu, 1,2 ml 0,5 M zasady Trizma o pH 6,8, 0,93 g DL-Ditiothreitolu (Sigma-Aldrich D0632) i 2,1 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Pionowa komórka elektroforeorezy</td><td>BIO-RAD</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td></td></tr><tr><td>Bufor enzymatyczny restrykcyjny NEB 2.1, 10x</td><td>New England Bio Labs</td><td>102855-152</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny Nhe I</td><td>New England Bio Labs</td><td>101228-710</td><td></td></tr> System obrazowania <tr><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td>Odyssey Fc bez <td>nukleaz</td></tr><tr><td></td><td>LI-COR Biosciences</td><td>2800-03</td><td></td></tr><tr><td>OmniTray Hodowla komórek poddana działaniu sterylnej pokrywki, PS (86 x 128 mm)</td><td>ThermoFisher</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-a-synukleina-GFP</td><td>Prezent od A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-ccdB</td><td>Addgene</td><td>14133</td><td></td></tr><tr><td>pAG303Gal-FUS</td><td>Addgene</td><td>29614</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-TDP-43</td><td>Prezent od A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) (PEG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td>Przygotuj 50% roztwór w/v.</td></tr><tr><td>Ponceau S Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504</td><td>Mix: 0,5 g 0,1% w/w barwnika Ponceau S, 5 ml 1% v/v kwasu octowego (Sigma-Aldrich 320099) i 500 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Rafinoza pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7630</td><td>Przygotować 10% w/v roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>Plemniki łososia DNA</td><td>Agilent Tech</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>SD-His płytki</td><td></td><td></td><td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g -Suplement DO He, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów (ThermoFisher 291920) i 900 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr>Płytki <td></td><td></td><td>SGal-His</td><td>Wymieszaj: 20 g agaru, 0,77 g suplementu DO He, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 100 ml roztworu galaktozy i 900 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>Bufor ładujący dodecylosiarczan sodu Przechowywać</td><td></td><td></td><td>w temperaturze -20 oC. 6X, Wymieszaj: 1,2 g dodecylosiarczanu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego, 0,93 g DL-ditiotreitolu, 2,1 ml wody dejonizowanej, 4,7 ml glicerolu i 1,2 ml 0,5 M zasady trizma, pH 6,8.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Przygotować 0,2 M roztwór.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Przygotować 20% w/v roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>TBS + 0,1% Tween 20 (TBST)</td><td></td><td></td><td>Mieszaj: 100 ml 10X TBS, 1 ml Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) i 900 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>TBS Bufor blokujący</td><td>LI-COR</td><td>927-5000</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowa</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka</td><td></td><td></td><td>transferowych: 22,5 g glicyny, 4,84 g zasady Tizma, 400 ml metanolu, 1 g dodecylosiarczanu sodu i 1,6 l wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)</td><td></td><td></td> <td>10X, pH 7,6, roztwór: Wymieszaj 24 g zasady Trizma i 88 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich S7653). Napełnij do 1 l wodą dejonizowaną.</td></tr><tr><td>WT 303 S. cerevisiae drożdże</td><td>Prezent od J. Shorter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Dekstroza peptonowa (YPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Parkinsona (PD), powodują utratę setek tysięcy istnień ludzkich każdego roku. Brakuje skutecznych metod leczenia, które mogłyby zatrzymać postęp choroby. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków związanych z sekwencjonowaniem w dużych populacjach pacjentów, większość przypadków ALS i PD pozostaje niewyjaśniona wyłącznie przez mutacje genetyczne. Mechanizmy epigenetyczne, takie jak potranslacyjna modyfikacja białek histonowych, mogą być zaangażowane w etiologię i progresję chorób neurodegeneracyjnych oraz prowadzić do nowych celów interwencji farmaceutycznej. Modele ALS i PD u ssaków in vivo i in vitro są kosztowne i często wymagają długotrwałych i pracochłonnych protokołów eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiamy praktyczne, szybkie i opłacalne podejście do określania zmian w poziomach modyfikacji histonów w całym genomie przy użyciu Saccharomyces cerevisiae jako systemu modelowego. Protokół ten pozwala na kompleksowe badania zmian epigenetycznych związanych z proteinopatiami neurodegeneracyjnymi, które potwierdzają wcześniejsze odkrycia w różnych systemach modelowych, jednocześnie znacznie poszerzając naszą wiedzę na temat epigenomu choroby neurodegeneracyjnej.

Aby zilustrować tę metodę, wykorzystamy niedawno opublikowane wyniki30. WT ludzkie FUS i TDP-43 nadeksprymowano przez 5 h, natomiast WT α-synukleinę nadeksprymowano przez 8 h. Konstrukt ccdB posłużył jako negatywna kontrola wektorowa. Rysunek 2 przedstawia zahamowanie wzrostu w hodowlach stałych i płynnych. Drożdże zebrano zgodnie z opisem, a następnie przeprowadzono analizę Western blotting z użyciem przeciwciał specyficznych dla mody...

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Protokół ten pozwala nam łatwo zbadać cechy epigenetyczne choroby neurodegeneracyjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje drożdże jako system modelowy, w porównaniu z innymi komórkowymi i zwierzęcymi modelami chorób neurodegeneracyjnych, drożdże są celowe i opłacalne. Technika ta pozwala nam zmapować zmiany epigenetyczne, które powstają w chorobie neurodegeneracyjnej, co może prowadzić do nowych markerów diagnostycznych, a także nowych celów terapii.Metoda ta pozwala na dalsze badania roli znaczników epigenetycznych w chorobach neurodegeneracyjnych i może być modyfikowana w celu oceny ludzkich fibroblastów i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta konkretna metoda zawiera szereg szczegółów, które należy zademonstrować wizualnie, takich jak prawidłowe obciążenie aparatu Western blot. Procedurę zademonstrują Michel Fallah i Navin Rana, obaj naukowcy z laboratorium Torrente.Zacznij od ponownego naniesienia drożdży z zamrożonego wywaru glicerolu na płytki z selektywnym agarem z 2% glukozą histydyny, na dwa do trzech dni inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zaszczepić drożdże z prążkami dla każdego modelu nadekspresji i kontroli w pięciu mililitrach selektywnej płynnej pożywki histydyny. Uzupełniony 2% rafinozą w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę, przez noc.Następnego ranka wyhoduj 100 mililitrów płynnej kultury dla każdego z modeli nadekspresji i kontroli w selektywnych pożywkach uzupełnionych 2% galaktozą przez noc. I zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD600, aby określić objętość kultury nocnej potrzebnej do renderowania kultur ekspresji przy początkowym OD600 0,3. Aby wywołać nadekspresję białka, hoduj drożdże na pożywce galaktozy z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez odpowiedni okres doświadczalny.Następnie zmierz OD600 w każdej kulturze pod koniec okresu indukcji. I ustandaryzuj wszystkie liczby komórek do najniższej wartości OD600. Zbierz kultury w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze sterylnej, niegazowanej wody na każde 10 mililitrów wyhodowanej kultury.Podwielokrotność jednego mililitra resuspension komórek do oddzielnych probówek mikrowirówek w celu dodatkowego odwirowania i odessania supernatantów. Następnie zatrzaskowo zamroź granulki komórek w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zlizować komórki do analizy Western blot, rozmrozić granulki komórek drożdży na lodzie przed ponownym zawieszeniem w 100 mikrolitrach wody destylowanej.Dodaj 300 mikrolitrów 0,2-molowego wodorotlenku sodu i 20 mikrolitrów 2-merkaptoetanolu do każdej próbki komórki. I ponownie zawiesić granulki przez pipetowanie. Po 10-minutowej inkubacji na lodzie osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić próbki w 100 mikrolitrach barwnika ładującego.Następnie gotuj próbki przez 10 minut na bloku grzewczym. Podczas lizy próbek umieść dwa żele w uchwycie na żel i wypełnij komorę wewnętrzną do góry buforem do pracy, a komorę zewnętrzną do znaku linii dwóch żeli. Gdy próbki są gotowe, załaduj po 15 mikrolitrów roztworu do lizy komórek do każdej studzienki 10 dołków, 12% żelu poliakryloamidowego i dodaj pięć mikrolitrów drabinki białkowej do dołka drabinki białkowej.Uruchom żel na około 45 minut przy napięciu 150 V lub do momentu, gdy przód barwnika dotknie dna żelu. Podczas pracy żelu namocz dwie podkładki z włókna na żel w buforze transferowym i jedną membranę z polifluorku winylidenu lub PVDF na żel w metanolu. Gdy żel jest gotowy, przepłucz membranę w buforze transferowym i umieść jedną wstępnie namoczoną podkładkę z włókna na dnie półsuchej komórki aparatu do przenoszenia.Następnie membrana PVDF, żel i druga wstępnie nasączona wkładka z włókna. Następnie ustaw moc na 150 miliamperów na godzinę. Pod koniec transferu białka zdjąć membranę z aparatu transferowego w celu krótkiego spłukania wodą destylowaną.Umieść przepłukaną błonę stroną z białkiem do góry w małym pojemniku do barwienia i przykryj membranę solą fizjologiczną z tris-buforem lub TBS, blokując bufor na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Pod koniec inkubacji blokującej inkubować błonę przez noc z histonem przeciwdrożdżowym i przeciwciałem specyficznym dla modyfikacji w TBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I właściwe przeciwciało kontrolujące obciążenie jądrowe.Następnego ranka umyj membranę cztery razy w TBS, uzupełnionym 0,1% polisorbatem 20 przez pięć minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej na pranie. Po ostatnim przemyciu inkubować blot z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie cztery pięciominutowe mycia w TBST i jedno pięciominutowe mycie w TBS samo z kołysaniem.Następnie zobrazuj plamę na fluorescencyjnym systemie obrazowania Western blot przez dwie minuty. W tym przypadku wykazano zahamowanie wzrostu w kulturach stałych i płynnych ze znaczącym wpływem na wzrost drożdży obserwowany w obecności podawania galaktozy w modelach nadekspresji mięsaka. Obserwuje się znaczny spadek poziomów histonów w modelu nadekspresji fuzji w mięsaku i znaczny wzrost poziomów acetylacji histonów w modelu nadekspresji białka wiążącego TAR 43, których nie obserwuje się ani w modelu nadekspresji sfuzji w mięsaku, ani w modelu nadekspresji alfa synukleiny.Występują również znaczne spadki poziomu histonów w modelu nadekspresji alfa synukleiny. W tym eksperymencie z sacharozą, im mniejsza ilość galaktozy użyta do indukcji fuzji w nadekspresji mięsaka, tym niższą toksyczność obserwuje się zarówno w kulturze stałej, jak i płynnej. Co ważne, im niższy poziom fuzji w nadekspresji mięsaka, tym mniejsza wielkość obniżenia poziomu histonów.Podczas wykonywania tego protokołu konieczne jest ujednolicenie ilości drożdży w każdej próbce, aby umożliwić właściwe porównanie poziomów modyfikacji potranslacyjnej histonów. 2-merkaptoetanol należy stosować pod kapturem, aby uniknąć wdychania. Jeśli używana jest bejca Poneau, należy ją odpowiednio wyrzucić.

characterizing-histone-post-translational-modification-alterations

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym wywiadzie dr Lindquist opisuje zależności między fałdowaniem białek, chorobami prionowymi a zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Problem fałdowania białek stanowi centrum współczesnej biologii. Oprócz swoich tradycyjnych funkcji biochemicznych, białka mogą pośredniczyć w przekazywaniu informacji biologicznych, a zatem mogą być uznane za materiał genetyczny. Ta niedawno odkryta funkcja białek ma istotne znaczenie dla badań nad zaburzeniami u ludzi. Dr Lindquist opisuje również aktualne...

Wywiad: Fałdowanie białek i badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Źródło: Bennett, S. A.,  i wsp., Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia procedurę oceny modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych. Etapy obejmują lizę komórek, wirowanie, elektroforezę, transfer błonowy i wykrywanie zmodyfikowanych histonów na podstawie przeciwciał.

Wykrywanie modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę charakteryzacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu Saccharomyces cerevisiae chorób neurodegeneracyjnych ALS i Parkinsona. Technika Western blot pozwala mapować zmiany epigenetyczne i identyfikować potencjalne markery diagnostyczne.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Przeglądaj więcej filmów