Name: Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w trójwymiarowej hodowli komórek C3A hepatocytów. Technika LC-MS umożliwia analizę setek PTMs w jednym eksperymencie, badając dynamikę chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Sidoli z wdzięcznością dziękuje Fundacji Badań nad Białaczką (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (nagroda Sagol Network GerOmics), Deerfield (nagroda Xseed), Relay Therapeutics, Merck, oraz Biuru Dyrektora NIH (1S10OD030286-01).

<ol><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+divide%3A+exponential+growth+in+classical+2D+and+metabolic+equilibrium+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments.</a> PLoS One. 9 (9), 106973(2014).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Gonda, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+transgenic+cell+model+to+quantify+genotoxic+effects+of+space+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment.</a> Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Tvardovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+and+middle-down+protein+analysis+reveals+that+intact+and+clipped+human+histones+differ+in+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).</li>
<li>Azad, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+chromatin+by+histone+tail+clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modifying chromatin by histone tail clipping.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).</li>
<li>Kragesteen, B. K., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+or+tails%3A+histone+tail+clipping+regulates+macrophage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity.</a> Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).</li>
<li>Dhaenens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+clipping%3A+the+punctuation+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone clipping: the punctuation in the histone code.</a> EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).</li>
<li>Anderson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+histone+proteoforms+using+front-end+electron+transfer+dissociation-enabled+orbitrap+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).</li>
<li>Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+roles+of+histone-modifying+enzymes+and+their+associated+chromatin+modifications+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation.</a> Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Fischle, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+discrimination+of+repressive+methyl-lysine+marks+in+histone+H3+by+Polycomb+and+HP1+chromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.</a> Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).</li>
<li>Onder, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+epigenetic+histone+modification+analysis+by+mass+spectrometry+for+clinical+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations.</a> Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epiproteomics%3A+quantitative+analysis+of+histone+marks+and+codes+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics%3A+a+still+unexploited+resource+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).</li>
<li>Stampar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+%28HepG2%2FC3A%29+cell-based+3D+model+for+genotoxicity+testing+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals.</a> Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).</li>
<li>Calitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+anti-prolific+properties+of+Xysmalobium+undulatum+water+extract+during+short-term+exposure+to+two-dimensional+and+three-dimensional+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+window+acquisition+of+all+theoretical+mass+spectra+%28SWATH%29+analysis+for+characterization+and+quantification+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).</li>
<li>Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+histone+PTMs+using+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+quantifies+histone+peptides+with+modifications+by+extracting+retention+time+and+intensity+in+high-resolution+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Pino, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skyline+ecosystem%3A+Informatics+for+quantitative+mass+spectrometry+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).</li>
<li>Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+protein+fold+change+and+p-value+calculation+for+non-experts+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics.</a> Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).</li>
<li>Lex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UpSet%3A+Visualization+of+intersecting+sets%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">UpSet: Visualization of intersecting sets.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Shah, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTome2%3A+a+database+of+histone+proteins%2C+modifiers+for+multiple+organisms+and+epidrugs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs.</a> Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+succinylation+and+lysine+malonylation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine succinylation and lysine malonylation in histones.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+succinylation+and+its+function+on+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Histone succinylation and its function on the nucleosome.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).</li>
<li>Howe, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+H3K4me3+instructive+for+transcription+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Is H3K4me3 instructive for transcription activation.</a> Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+H3K9me3+heterochromatin+in+cell+identity+establishment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).</li>
<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
<li>Sellers, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Farrelly, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+serotonylation+is+a+permissive+modification+that+enhances+TFIID+binding+to+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3.</a> Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+histone+glycation+is+associated+with+disease-related+changes+in+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture.</a> Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Analiza histonów PTM zasadniczo różni się od typowego procesu analizy proteomicznej. Większość histonów PTM nadal ma enigmatyczne funkcje biologiczne; w związku z tym adnotacje, takie jak ontologia genów lub bazy danych ścieżek, nie są dostępne. Istnieje kilka zasobów, które wiążą modyfikacje histonów z enzymem odpowiedzialnym za ich katalizę lub białkami zawierającymi domeny, które wiążą te PTM (np. HISTome36). Możliwe jest również spekulowanie na temat ogólnego stanu chromatyny, gdy regulowane s...

Od końca XIX wieku systemy hodowli komórkowych są używane jako model do badania wzrostu i rozwoju komórek poza ludzkim ciałem1,2. Ich zastosowanie zostało również rozszerzone o badanie, jak tkanki i narządy funkcjonują zarówno w kontekście zdrowym, jak i chorym1,3. Komórki zawiesinowe (np. komórki krwi) rosną na szalkach Petriego lub kolbach bezproblemowo i zamiennie, ponieważ nie łączą się w trójwymiarowe (3D) struktury in vivo. Komórki pochodzące z narządów stałych mogą rosnąć w dwuwymiarowych (2D) lub 3D systemach hodowli. W hodowli 2D komórki są hodowane w monowarstwie, która przylega do płaskiej powierzchni2,4. Systemy hodowli komórkowych 2D charakteryzują się wykładniczym wzrostem i szybkim czasem podwajania, zwykle od 24 godzin do kilku dni5. Komórki w systemach 3D rosną, tworząc skomplikowane interakcje komórka-komórka, dokładniej modelując konglomeraty tkankopodobne i charakteryzują się zdolnością do osiągnięcia dynamicznej równowagi, w której ich czas podwojenia może osiągnąć 1 miesiąc lub dłużej5.
W tym artykule przedstawiono innowacyjną metodologię hodowli sferoid 3D w obrotowych systemach hodowli komórkowych, które symulują zmniejszoną grawitację6. Jest to uproszczona pochodna systemu hodowli komórkowych wprowadzonego przez NASA w latach 90. XX wieku7. Takie podejście minimalizuje siły ścinające, które występują w istniejących metodach, takich jak kolby przędzalnicze, i zwiększa odtwarzalność sferoidów6. Ponadto obracający się bioreaktor zwiększa aktywną dyfuzję składników odżywczych, minimalizując powstawanie nekrotyczne, które występuje w systemach takich jak hodowla komórek wiszących, gdzie wymiana pożywki jest niepraktyczna6. W ten sposób komórki rosną w większości niezakłócone, co pozwala na tworzenie cech strukturalnych i fizjologicznych związanych z komórkami rosnącymi w tkance. Hepatocyty C3A (HepG2/C3A) hodowane w ten sposób nie tylko miały ultrastrukturalne organelle, ale także wytwarzały ilości ATP, kinazy adenylanowej, mocznika i cholesterolu porównywalne z poziomami obserwowanymi in vivo1,2. Ponadto komórki hodowane w systemach hodowli komórkowych 2D vs. 3D wykazują różne wzorce ekspresji genów8. Analiza ekspresji genów hepatocytów C3A hodowanych jako sferoidy 3D wykazała, że komórki te wyrażają szeroki zakres białek specyficznych dla wątroby, a także geny zaangażowane w kluczowe szlaki regulujące czynność wątroby8. Wcześniejsze publikacje wykazały różnice między proteomami komórek rosnących wykładniczo w hodowli 2D a komórkami w równowadze dynamicznej w hodowlach sferoidalnych 3D5. Różnice te obejmują metabolizm komórkowy, który z kolei wpływa na strukturę, funkcję i fizjologię komórki5. Proteom komórek hodowanych w hodowli 2D był bardziej wzbogacony w białka biorące udział w replikacji komórek, podczas gdy proteom sferoid 3D był bardziej wzbogacony w funkcjonalność wątroby5.
Wolniejsze tempo replikacji komórek wyhodowanych jako sferoidy 3D dokładniej modeluje specyficzne zjawiska związane ze stanem chromatyny i jej modyfikacjami (np. obcinanie histonów9). Obcinanie histonów to nieodwracalna modyfikacja potranslacyjna histonów (PTM), która powoduje proteolityczne rozszczepienie części N-końcowego ogona histonowego. Chociaż jego funkcja biologiczna jest nadal przedmiotem dyskusji10,11,12,13, jasne jest, że jego obecność w komórkach pierwotnych i tkance wątroby jest modelowana przez komórki HepG2/C3A hodowane jako sferoidy, ale nie jako płaskie komórki9. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ stan chromatyny i modyfikacje regulują odczyt DNA głównie poprzez modulowanie dostępności do genów, a tym samym ich ekspresji14. Histonistyczne PTM wpływają albo bezpośrednio na stan chromatyny, wpływając na ładunek netto nukleosomów, w których histony są składane, albo pośrednio, poprzez rekrutację osób zapisujących, czytających i ścierających chromatynę14. Do tej pory zidentyfikowano setki histonów PTM15, wzmacniając hipotezę, że chromatyna zawiera "kod histonowy" używany przez komórkę do interpretacji DNA16. Jednak zidentyfikowanie niezliczonych kombinacji PTM15 oraz odkrycie, że kombinacje histonów PTM często mają inne funkcje biologiczne niż PTM obecne w izolacji (np. Fischle, et al.17), podkreśla, że potrzeba więcej pracy, aby odszyfrować "kod histonowy".
Obecnie, analiza PTM histonów opiera się na technikach wykorzystujących przeciwciała (np. Western Blots, immunofluorescencja lub immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie [ChIP-seq]) lub spektrometria mas (MS). Techniki oparte na przeciwciałach mają wysoką czułość i mogą dostarczyć szczegółowych informacji na temat lokalizacji znaczników histonowych w całym genomie, ale często są ograniczone w badaniu rzadkich PTM lub PTM obecnych w kombinacjach18,19,20. MS jest bardziej odpowiedni do wysokoprzepustowej i bezstronnej identyfikacji i kwantyfikacji pojedynczych i współistniejących modyfikacji białek, w szczególności białek histonowych18,19,20. Z tych powodów to i kilka innych laboratoriów zoptymalizowało potok MS do analizy peptydów histonowych (MS od dołu do góry), nienaruszonych ogonów histonów (MS od środka do dołu) i białek histonowych o pełnej długości (MS od góry do dołu)21,22,23.
Poniżej szczegółowo opisano proces uprawy sferoidów HepG2/C3A i przygotowania ich do analizy peptydów histonowych (MS od dołu do góry) za pomocą chromatografii nanocieczowej, sprzężonej online z tandemową spektrometrią mas (nLC-MS/MS). Wyhodowano hodowlę komórkową 2D, a komórki zebrano i przeniesiono do bioreaktora, gdzie zaczęły tworzyć sferoidy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Po 18 dniach w hodowli sferoidy traktowano maślanem sodu lub bursztynianem sodu w celu zwiększenia względnej obfitości acetylacji histonów i sukcynylacji. Warto zauważyć, że kultury 3D mogą być traktowane związkami genotoksycznymi tak samo dobrze, jak ich płaskie odpowiedniki hodowlane; w rzeczywistości ostatnie publikacje podkreślają, że odpowiedź toksykologiczna komórek w hodowli 3D jest bardziej podobna do tkanek pierwotnych niż w hodowli płaskiej 2D24,25. Komórki zostały następnie pobrane w określonych punktach czasowych i przeprowadzono izolację jądrową. Następnie histony zostały wyekstrahowane i derywatyzowane bezwodnikiem propionowym przed i po trawieniu trypsyny zgodnie z protokołem opracowanym po raz pierwszy przez Garcia et al.26. Procedura ta generuje peptydy o odpowiedniej wielkości do separacji online za pomocą chromatografii odwróconych faz (C18) i wykrywania za pomocą MS. Na koniec zidentyfikowano peptydy histonowe i określono je ilościowo, a wygenerowane dane przedstawiono na wiele sposobów w celu uzyskania pełniejszej interpretacji biologicznej.

<table><tbody><tr><td>0,05% roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,5-20 &mikro; Końcówki do pipet L</td><td>BRAND</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pipeta wielokanałowa L</td><td>BRAND</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td><td>Końcówka Luer lock, wyskalowana do 12 ml</td></tr><tr><td>10, 20, 200 i 1000 &mikro; L pipety jednokanałowe</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>18 G igła strzykawkowa</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td> <td>Długość 3", średnica 0,05"</td></tr><tr><td>200 i mikro; L pipeta wielokanałowa</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &micro; L końcówki do pipet</td><td>BRAND</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa mikropłytka z ultraniskim mocowaniem</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2&nbsp; Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>Niepoddana obróbce, z nasadką odpowietrzającą</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z osłoną</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>Aceton powinien być używany na zimno</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu rozwiązanie</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>Bioreaktor do hodowli komórkowych 3D</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Inkubator Clinostat CO2 do hodowli komórkowych 3D</td></tr><tr><td>Jednostka sterująca</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Tabletka do ClinoStar Ustawienia</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X roztwór z 4,5 g/l glukozy i pirogronianu sodu, bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Model 7121000</td></tr><tr><td>Szkło Pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", bawełniana, szkło borokrzemowe, niesterylny</td></tr><tr><td>suplement Glutagro</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-ananylo-L-glutamina</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1X roztwór bez wapnia, magnezu i fenolu czerwony</td></tr><tr><td>acetonitryl klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>Roztwór Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Żywica Oasis HLB</td><td>Wody</td><td>186007549</td><td>Żywica hydrofilowo-lipofilowo-zrównoważona (HLB) z 30&mikro; m wielkość cząstek</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Oro-Flex I polipropylenowa płyta filtracyjna Orochem</td><td></td><td>OF1100</td><td>96-dołkowa polipropylenowa płyta filtracyjna z 10 i mikro; M PE fryta</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X roztwór</td></tr><tr><td>Papier pH</td><td>Hydrion</td><td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 Papier testowy pH</td></tr><tr><td>Pistolet do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polimikrokapila</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Elastyczna rurka kapilarna z topionej krzemionki z powłoką polimkową, 75 &mikro; M ID x 363 i mikro; M OD</td></tr><tr><td>Polistyren 10 ml pipety serologiczne, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik propionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Reprosil-Pur</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.0003</td><td>120 & Aring; wielkość porów, faza C18-AQ, 3 &mikro; Rozmiar koralików</td></tr><tr><td>M Rotator</td><td>Clay Adams</td><td>25477 (American Laboratory Trading)</td><td>Mikser nutatorów 1105</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy SpeedVac (probówki do mikrowirówek 1,5 ml)</td><td>Savant</td><td>20249 (American Laboratory Trading)</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy SpeedVac (96-dołkowy)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterylny kaptur</td><td>Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>klasa II, typ A2</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker Analizowany odczynnik</td></tr> <tr><td>ACSNaczynie 100 mm x 20 mm poddane hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy (TCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td><td>Zawiesić 100% w/v w wodzie klasy HPLC</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>Stopień sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy 96-dołkowy</td><td>Milipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze 1000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze 200 i mikro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3d hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Płaskie hodowle komórek ssaków są szeroko stosowanym podejściem in vitro do zrozumienia fizjologii komórki, ale ten system jest ograniczony w modelowaniu tkanek stałych z powodu nienaturalnie szybkiej replikacji komórek. Jest to szczególnie trudne w przypadku modelowania dojrzałej chromatyny, ponieważ szybko replikujące się komórki są często zaangażowane w replikację DNA i mają niejednorodną populację poliploidalną. Poniżej przedstawiono przepływ pracy do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie spoczynku przy użyciu trójwymiarowego (3D) systemu hodowli komórkowych. Korzystając z tego protokołu, linie komórkowe raka wątrobowokomórkowego są hodowane jako powtarzalne sferoidy 3D w inkubatorze, zapewniając aktywną dyfuzję składników odżywczych i niskie siły ścinające. Leczenie maślanem sodu i bursztynianem sodu powodowało odpowiednio wzrost acetylacji histonów i sukcynylacji. Wzrost poziomu acetylacji histonów i sukcynylacji jest związany z bardziej otwartym stanem chromatyny. Następnie pobiera się sferoidy w celu wyizolowania jąder komórkowych, z których ekstrahuje się białka histonowe w celu analizy ich modyfikacji potranslacyjnych. Analiza histonów jest przeprowadzana za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej online z tandemową spektrometrią mas, a następnie za pomocą wewnętrznego potoku obliczeniowego. Na koniec przedstawiono przykłady reprezentacji danych w celu zbadania częstości i występowania kombinatorycznych znaczników histonowych.

W niniejszym protokole sferoidy HepG2/C3A poddano działaniu 20 mM NaBut oraz 10 mM NaSuc, z których oba wpłynęły na globalne poziomy PTM histonów (Rysunek 3A). Następnie zidentyfikowano i ilościowo określono PTM histonów na poziomie pojedynczych reszt poprzez akwizycję MS/MS (Rysunek 3B).
Gdy próbki są analizowane w powtórzeniach, można przeprowadzić analizę statystyczną w celu oceny krotności zmiany (fold change) wzbogacenia...

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Wykazano, że globalna dynamika chromatyny jest ważnym mediatorem kilku stanów chorobowych, takich jak rak i starzenie się. Nasz protokół zapewnia fizjologicznie istotny model do badania tego procesu. Standardowa analiza laboratoryjna modyfikacji potranslacyjnych histonów lub PTMS jest zwykle ograniczona do sondowania pojedynczego PTM na raz przy użyciu testów opartych na przeciwciałach.Analiza spektrometrii mas histonów PTMS metodą chromatografii cieczowej pozwala nam zmierzyć obfitość setek PTMS w jednym eksperymencie. Procedurę zademonstrują Stephanie Stransky, Ronald Cutler i Julie Kim, odpowiednio doktorantka, doktorantka i technik badawczy z laboratorium. Najpierw, używając standardowych pożywek wzrostowych, hoduj komórki jako monowarstwę, aż osiągną 80% zgrywki.Następnie umyj komórki HBSS. Dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej w HBSS. Inkubuj komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Użyj mikroskopu, aby sprawdzić oderwanie komórek. Po zliczeniu komórek rozcieńczyć zawiesinę komórkową świeżą pożywką wzrostową. Dodaj 0,5 mililitra pożywki wzrostowej, aby zrównoważyć 24-dołkową okrągłą płytkę dolną o bardzo niskim mocowaniu z wieloma mikrodołkami w każdej.Następnie odwirować płytki o sile 3000 x g, aby usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni płytki. Teraz przenieś wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek na płytkę 24-dołkową i odwiruj przez trzy minuty przy 120 x g. Sprawdź komórki w 24-dołkowej płytce, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny w celu wytworzenia sferoidów.W międzyczasie, aby zrównoważyć bioreaktor, dodaj 25 mililitrów sterylnej wody do komory wilgotnościowej i dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej do komory komórkowej. Inkubować bioreaktor w obrotowym inkubatorze klinostatu przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Odłącz sferoidy od 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu, delikatnie pipetując za pomocą końcówek o szerokości jednego mililitra, a następnie przenieś je do naczynia do hodowli tkankowych.Aby wybrać wystarczająco kształtujące się sferoidy, sprawdź jakość sferoid pod mikroskopem. Dobrej jakości sferoidy mają jednolity rozmiar, zwartość i okrągłość. Napełnij zrównoważony bioreaktor pięcioma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej i przenieś do niego sferoidy.Następnie całkowicie napełnij bioreaktor świeżą pożywką wzrostową i umieść bioreaktor w inkubatorze klinostatu z prędkością od 10 do 11 obr./min. Co dwa do trzech dni wymieniaj pożywki wzrostowe, zastępując 10 mililitrów starych pożywek świeżymi. Wraz ze wzrostem rozmiaru i liczby sferoid zwiększa się prędkość obrotowa inkubatora.Po uzyskaniu sferoidalnego osadu dodaj pięć objętości zimnego 0,2 molowego kwasu siarkowego do osadu i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić osad i uwolnić histony. Po uzyskaniu supernatantu po odwirowaniu dodać zimny stężony kwas trójchlorooctowy, tak aby końcowe stężenie osiągnęło 25 do 30% objętości. I wymieszaj go, odwracając probówkę kilka razy i odwiruj zgodnie z opisem w rękopisie.Po odrzuceniu supernatantu, za pomocą szklanej pipety pastewnej, przemyć osad i ścianki probówki około 500 mikrolitrami zimnego acetonu i 0,1% kwasu solnego, a następnie odwirować przy 3,400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant. Używając szklanej pipety pastwiskowej, dodaj 500 mikrolitrów 100% zimnego acetonu, aby umyć osad i odwirować, jak pokazano wcześniej.Po odrzuceniu supernatantu należy całkowicie usunąć aceton, ostrożnie pipetując, i pozostawić próbkę do wyschnięcia pod otwartą pokrywką na około 20 minut. Zawiesić osad w 20 mikrolitrach od 15 do 20% acetonitrylu w 100 milimolowym wodorowęglanie amonu o pH 8. Po wirowaniu wiruj zawieszenie przy 1000 x g przez 30 sekund.W przypadku ośmiu lub więcej próbek każdą ponownie zawieszoną próbkę przenieść na płytkę 96-dołkową. Następnie w kapturze dodaj dwa mikrolitry bezwodnika propionowego i wymieszaj, pipetując pięć razy. Szybko dodaj 10 mikrolitrów wodorotlenku amonu i wymieszaj pipetując pięć razy.Wymieszaj żywicę HLB na magnetycznej płytce mieszającej. Następnie dodać 70 mikrolitrów zawiesiny HLB do każdego dołka 96-dołkowej płytki filtracyjnej na 96-dołkowej płytce zbiorczej. Po wyrzuceniu przepływu przemyj żywicę 100 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego.Po ponownym zamieszczeniu każdej próbki w 100 mikrolitrach 0,1% kwasu trifluorooctowego, załaduj każdą próbkę do każdej studzienki i zapobiegaj rozpryskiwaniu się za pomocą próżni. Po odlaniu przepływu, umyć próbki 100 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego i umieścić płytkę filtracyjną na nowej płytce zbiorczej. Następnie dodaj 60 mikrolitrów 60% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym do każdej studzienki i zapobiegaj rozpryskiwaniu się za pomocą próżni.Zbierz przepływ i wysusz w próżni o dużej prędkości. Załadować wysuszoną płytkę zbiorczą do HPLC i uruchomić metodę LC/MS/MS zgodnie z opisem w manuskrypcie. W tym badaniu zaobserwowano względną obfitość powszechnych modyfikacji potranslacyjnych histonów w hepatocytach C3A hodowanych jako trójwymiarowe sferoidy.Modyfikacje potranslacyjne można było również zaobserwować na pojedynczej reszcie w peptydach generowanych z białek histonowych. Traktowanie sferoidów maślanem sodu zwiększało względną obfitość acetylacji histonów, podczas gdy traktowanie bursztynianem sodu zwiększało sukcynylację reszt histonowych. Metoda wykazała również wzorzec dystrybucji acetylacji histonów po traktowaniu maślanem sodu oraz sukcynylacji histonów po leczeniu bursztynianem sodu.Wynik pokazał również wspólne wzorce różnych modyfikacji histonów. Leczenie maślanem sodu znacznie zwiększyło acetylację reszty lizyny 14 na peptydzie wygenerowanym z białka histonowego H3, tylko wtedy, gdy jego dziewiąta reszta lizyny miała dwie grupy metylowe, ale nie jedną lub trzy grupy metylowe. Obliczono również względną obfitość poszczególnych modyfikacji i różnych kombinacji modyfikacji potranslacyjnych w peptydzie pochodzącym z H3.Kombinatoryczne wzorce modyfikacji potranslacyjnych po leczeniu maślanem sodu zaobserwowano również w peptydzie generowanym z białka histonowego H4. Również w tym przypadku leczenie maślanem sodu spowodowało znaczny wzrost acetylacji. Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby sferoidy znajdowały się na stole w jak najmniejszym stopniu i na etapie odsalania, aby uniknąć rozlania próbki. Ten przepływ pracy można wykorzystać do badania chromatyny w tkankach stałych przy użyciu bardziej fizjologicznego modelu niż szybko replikujące się płaskie hodowle komórkowe.

global-level-quantification-histone-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj metodę kwantyfikacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w trójwymiarowej hodowli komórek C3A hepatocytów. Technika LC-MS umożliwia analizę setek PTMs w jednym eksperymencie, badając dynamikę chromatyny.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Przeglądaj więcej filmów