Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Wykazano, że globalna dynamika chromatyny jest ważnym mediatorem kilku stanów chorobowych, takich jak rak i starzenie się. Nasz protokół zapewnia fizjologicznie istotny model do badania tego procesu. Standardowa analiza laboratoryjna modyfikacji potranslacyjnych histonów lub PTMS jest zwykle ograniczona do sondowania pojedynczego PTM na raz przy użyciu testów opartych na przeciwciałach.

Analiza spektrometrii mas histonów PTMS metodą chromatografii cieczowej pozwala nam zmierzyć obfitość setek PTMS w jednym eksperymencie. Procedurę zademonstrują Stephanie Stransky, Ronald Cutler i Julie Kim, odpowiednio doktorantka, doktorantka i technik badawczy z laboratorium. Najpierw, używając standardowych pożywek wzrostowych, hoduj komórki jako monowarstwę, aż osiągną 80% zgrywki.

Następnie umyj komórki HBSS. Dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej w HBSS. Inkubuj komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Użyj mikroskopu, aby sprawdzić oderwanie komórek. Po zliczeniu komórek rozcieńczyć zawiesinę komórkową świeżą pożywką wzrostową. Dodaj 0,5 mililitra pożywki wzrostowej, aby zrównoważyć 24-dołkową okrągłą płytkę dolną o bardzo niskim mocowaniu z wieloma mikrodołkami w każdej.

Następnie odwirować płytki o sile 3000 x g, aby usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni płytki. Teraz przenieś wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek na płytkę 24-dołkową i odwiruj przez trzy minuty przy 120 x g. Sprawdź komórki w 24-dołkowej płytce, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny w celu wytworzenia sferoidów.

W międzyczasie, aby zrównoważyć bioreaktor, dodaj 25 mililitrów sterylnej wody do komory wilgotnościowej i dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej do komory komórkowej. Inkubować bioreaktor w obrotowym inkubatorze klinostatu przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Odłącz sferoidy od 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu, delikatnie pipetując za pomocą końcówek o szerokości jednego mililitra, a następnie przenieś je do naczynia do hodowli tkankowych.

Aby wybrać wystarczająco kształtujące się sferoidy, sprawdź jakość sferoid pod mikroskopem. Dobrej jakości sferoidy mają jednolity rozmiar, zwartość i okrągłość. Napełnij zrównoważony bioreaktor pięcioma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej i przenieś do niego sferoidy.

Następnie całkowicie napełnij bioreaktor świeżą pożywką wzrostową i umieść bioreaktor w inkubatorze klinostatu z prędkością od 10 do 11 obr./min. Co dwa do trzech dni wymieniaj pożywki wzrostowe, zastępując 10 mililitrów starych pożywek świeżymi. Wraz ze wzrostem rozmiaru i liczby sferoid zwiększa się prędkość obrotowa inkubatora.

Po uzyskaniu sferoidalnego osadu dodaj pięć objętości zimnego 0,2 molowego kwasu siarkowego do osadu i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić osad i uwolnić histony. Po uzyskaniu supernatantu po odwirowaniu dodać zimny stężony kwas trójchlorooctowy, tak aby końcowe stężenie osiągnęło 25 do 30% objętości. I wymieszaj go, odwracając probówkę kilka razy i odwiruj zgodnie z opisem w rękopisie.

Po odrzuceniu supernatantu, za pomocą szklanej pipety pastewnej, przemyć osad i ścianki probówki około 500 mikrolitrami zimnego acetonu i 0,1% kwasu solnego, a następnie odwirować przy 3,400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant. Używając szklanej pipety pastwiskowej, dodaj 500 mikrolitrów 100% zimnego acetonu, aby umyć osad i odwirować, jak pokazano wcześniej.

Po odrzuceniu supernatantu należy całkowicie usunąć aceton, ostrożnie pipetując, i pozostawić próbkę do wyschnięcia pod otwartą pokrywką na około 20 minut. Zawiesić osad w 20 mikrolitrach od 15 do 20% acetonitrylu w 100 milimolowym wodorowęglanie amonu o pH 8. Po wirowaniu wiruj zawieszenie przy 1000 x g przez 30 sekund.

W przypadku ośmiu lub więcej próbek każdą ponownie zawieszoną próbkę przenieść na płytkę 96-dołkową. Następnie w kapturze dodaj dwa mikrolitry bezwodnika propionowego i wymieszaj, pipetując pięć razy. Szybko dodaj 10 mikrolitrów wodorotlenku amonu i wymieszaj pipetując pięć razy.

Wymieszaj żywicę HLB na magnetycznej płytce mieszającej. Następnie dodać 70 mikrolitrów zawiesiny HLB do każdego dołka 96-dołkowej płytki filtracyjnej na 96-dołkowej płytce zbiorczej. Po wyrzuceniu przepływu przemyj żywicę 100 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego.

Po ponownym zamieszczeniu każdej próbki w 100 mikrolitrach 0,1% kwasu trifluorooctowego, załaduj każdą próbkę do każdej studzienki i zapobiegaj rozpryskiwaniu się za pomocą próżni. Po odlaniu przepływu, umyć próbki 100 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego i umieścić płytkę filtracyjną na nowej płytce zbiorczej. Następnie dodaj 60 mikrolitrów 60% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym do każdej studzienki i zapobiegaj rozpryskiwaniu się za pomocą próżni.

Zbierz przepływ i wysusz w próżni o dużej prędkości. Załadować wysuszoną płytkę zbiorczą do HPLC i uruchomić metodę LC/MS/MS zgodnie z opisem w manuskrypcie. W tym badaniu zaobserwowano względną obfitość powszechnych modyfikacji potranslacyjnych histonów w hepatocytach C3A hodowanych jako trójwymiarowe sferoidy.

Modyfikacje potranslacyjne można było również zaobserwować na pojedynczej reszcie w peptydach generowanych z białek histonowych. Traktowanie sferoidów maślanem sodu zwiększało względną obfitość acetylacji histonów, podczas gdy traktowanie bursztynianem sodu zwiększało sukcynylację reszt histonowych. Metoda wykazała również wzorzec dystrybucji acetylacji histonów po traktowaniu maślanem sodu oraz sukcynylacji histonów po leczeniu bursztynianem sodu.

Wynik pokazał również wspólne wzorce różnych modyfikacji histonów. Leczenie maślanem sodu znacznie zwiększyło acetylację reszty lizyny 14 na peptydzie wygenerowanym z białka histonowego H3, tylko wtedy, gdy jego dziewiąta reszta lizyny miała dwie grupy metylowe, ale nie jedną lub trzy grupy metylowe. Obliczono również względną obfitość poszczególnych modyfikacji i różnych kombinacji modyfikacji potranslacyjnych w peptydzie pochodzącym z H3.

Kombinatoryczne wzorce modyfikacji potranslacyjnych po leczeniu maślanem sodu zaobserwowano również w peptydzie generowanym z białka histonowego H4. Również w tym przypadku leczenie maślanem sodu spowodowało znaczny wzrost acetylacji. Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby sferoidy znajdowały się na stole w jak najmniejszym stopniu i na etapie odsalania, aby uniknąć rozlania próbki. Ten przepływ pracy można wykorzystać do badania chromatyny w tkankach stałych przy użyciu bardziej fizjologicznego modelu niż szybko replikujące się płaskie hodowle komórkowe.