Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transformacja komórek drożdży biblioteką macierzy plazmidowego DNA. Jest to realizowane poprzez uprzednie namnożenie odpowiedniej ilości komórek drożdży. Następnie komórki drożdży są traktowane octanem litu, aby uczynić je kompetentnymi do transformacji DNA.

Następnie należy przeprowadzić transformację kompetentnych komórek e poprzez zmieszanie ich z DNA. Ostatnim etapem procedury jest selekcja i analiza transformantów. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ plazmidowego DNA na fenotypy drożdży za pomocą testów kropelkowych (spotting assays) oraz/lub mikroskopii.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami, takimi jak standardowe transformacje drożdży, jest możliwość zautomatyzowanej transformacji dużej liczby różnych plazmidów do komórek drożdży. Ten wysokoprzepustowy protokół transformacji drożdży został opracowany dla 10 płytek 96-dołkowych, jednak można go odpowiednio skalować w górę lub w dół. W przypadku eksperymentów na większą skalę kluczem do sukcesu jest zachowanie odpowiedniej organizacji wszystkich płytek i odczynników.

Aby uniknąć pomyłek w trakcie trwania eksperymentu, w niniejszym protokole zostanie użyty automatyczny dozownik cieczy do płytek biobot rapid plate liquid handler. W celu rozpoczęcia, należy nanieść od 5 do 10 µL plazmidowego DNA drożdży z biblioteki macierzowej do każdego dołka okrągłych płytek 96-dołkowych z płaskim dnem. Płytki 96-dołkowe należy pozostawić niezakryte w czystej komorze z wyciągiem przez noc w celu wysuszenia.

Następnie zaszczep szczep badawczy w 200 mililitrach pożywki dekstrozy z peptydem drożdżowym (YPD) w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodami i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Następnego ranka rozcieńcz szczep badawczy do wartości OD 600 wynoszącej 0.1 w dwóch litrach pożywki YPD w celu zapewnienia optymalnego wzrostu. Hoduj kultury do objętości jednego litra w osobnych 2,8-litrowych kolbach z przegrodami.

Inkubuj kolby z wytrząsaniem przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 30 °C, aż kultury osiągną wartość OD 600 od 0,8 do 1,0. Po osiągnięciu przez kulturę drożdży wartości OD 600 w zakresie 0,8–1,0, zebrać komórki poprzez wirowanie. Napełnić kulturą cztery jednorazowe stożkowate probówki o pojemności 225 ml i wirować z prędkością 3000 RPM przez pięć minut w wirówce laboratoryjnej.

Odlać supernatant S z każdej probówki. Dodać więcej kultury do tych samych probówek i ponownie odwirować, powtarzając czynność w razie potrzeby, aż do zebrania wszystkich komórek. Przemyć każdy osad komórkowy w 50 mililitrach wody destylowanej autoklawowanej i resuspendować poprzez wstrząsanie na wirówce typu vortex.

Połączyć komórki w jednej probówce stożkowej o pojemności 225 ml i wirować przy 3000 RPM przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu S, przemyć komórki w 100 ml roztworu octanu litu. Ponownie wirować przy 3000 RPM przez pięć minut.

Usunąć SNA i zawiesić osad komórkowy w 70 mililitrach roztworu octanu litu. Mieszać w wstrząsarzu typu vortex z dużą prędkością przez około 30 sekund, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie dodać beta-merkaptoetanol do roztworu 0,1 M i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez kolejne 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji dodać 2 mL przegotowanego i schłodzonego DNA z nasienia łososia do mieszaniny komórkowej. Przelać mieszaninę komórkową do autoklawowalnej płytki jednodobowej, a następnie usunąć wszelkie powstałe osady, ponieważ mogą one utrudniać późniejszą pipetację.

Używając biobota do szybkiego rozlewania, nanieś 50 µL mieszaniny komórek do każdej studni czterech wcześniej przygotowanych płytek 96-dołkowych zawierających plazmowe DNA; nie mieszaj. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania podczas inkubacji komórek.

Przygotować 200 ml roztworu PEG DMSO i octanu litu. Połączyć 160 ml 50%PEG 33,50, 20 ml DMSO oraz 20 ml jednomolarnego octanu litu. Ważne jest, aby roztwór ten przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Do każdej próbki dodać 125 µL roztworu PEG, octanu litu i DMSO. Dokładnie wymieszać, aspirując i dozując zawiesinę komórkową osiem razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.

Następnie poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 15 minut w suchym inkubatorze. Po szoku termicznym nie układaj płytek w stosy; wiruj je, używając adapterów do wirówki dostosowanych do płytek 96-dołkowych. Po wirowaniu usuń roztwór PEG, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady. Następnie osusz odwrócone płytki za pomocą ręczników papierowych.

Aby usunąć pozostałą ciecz, komórki pozostaną na dnie dołków. Przepłucz komórki, dodając 200 µL minimalnego medium do każdego z nich. Ponownie odwiruj płytki.

Usunąć nadsącz, odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady i osuszając ją ręcznikami papierowymi. Do każdej studni dodać 200 µL pożywki minimalnej za pomocą inkubatora do płytek i inkubować w temperaturze 30 °C przez dwa dni bez wytrząsania. Po dwóch dniach na dnie każdej skutecznie przetransformowanej studni powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.

Aby przygotować się do testu Spatting, najpierw należy odmierzyć 200 µL minimalnego podłoża na bazie OSE do każdego dołka nowej płaskodنnej płytki 96-dołkowej. Następnie należy wymieszać zawartość każdego dołka na płytce transformacyjnej, aspirując i dozując zawiesinę komórkową osiem razy za pomocą szybkiego pipetowania.

Każdy dołek płytki z rafinozą zaszczepić pięcioma mikrolitrami mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej i inkubować w temperaturze 30 °C przez jeden dzień. Następnego dnia na dnie każdego dołka powinny być obecne małe kolonie.

Test plamkowy (spotting assay) zostanie przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza; należy wysterylizować 96-dołkowy replikator lub tzw. frogger poprzez opalenie płomieniem. Kolonie należy wymieszać za pomocą replikatora, a następnie nanieść je w formie plamek na płytki z podłożem selektywnym. Po naniesieniu plamek należy pozostawić płytki do wyschnięcia w komorze przez 5 do 10 minut.

Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla przesiewu nadekspresji plazmidów drożdżowych w celu zidentyfikowania supresorów i enhancerów toksyczności TDP 43. TDP 43 to ludzkie białko, które jest zaangażowane w patogenezę stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) lub choroby Lou Gehriga; ekspresja TDP 43 w komórkach drożdży prowadzi do agregacji i cytotoksyczności.

Na tych płytkach widoczne są kolonie z zintegrowanym plazmidem T DP 43 indukowanym galaktozą, które zostały również przekształcone plazmidami z biblioteki ekspresji ORF genów flex. Kolonie te mają kolor czerwony, ponieważ szczep posiada mutację skutkującą gromadzeniem czerwonego pigmentu. Płytka po lewej stronie zawiera glukozę, która represuje ekspresję T DP 43 lub plazmidów genów flex.

Szalka po prawej stronie zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP 43 oraz O Fs w plazmidach genu flex. Zielona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który znosi toksyczność TDP 43, co objawia się szybszym wzrostem i większą gęstością kolonii. Czerwona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który nasila toksyczność TDP 43, co objawia się wolniejszym wzrostem i mniejszą gęstością kolonii.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić transformację biblioteki plazmidowego DNA z komórek.