Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe nadekspresji plazmidu drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest transformacja komórek drożdży za pomocą biblioteki macierzy DNA osocza. Osiąga się to poprzez wyhodowanie najpierw odpowiedniej ilości komórek drożdży. Komórki drożdży są następnie traktowane octanem litu, aby były kompetentne do transformacji DNA.

Następnie przekształć kompetentne komórki e, mieszając je z DNA. Ostatnim etapem procedury jest dobór i analiza transformantów. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wpływ DNA osocza na fenotypy drożdży za pomocą testów plamienia drożdży i/lub mikroskopii.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi protokołami, takimi jak standardowe transformacje drożdży, jest to, że pozwala ona na zautomatyzowaną transformację dużej liczby różnych plazmidów w komórki drożdży. Ten wysokowydajny protokół transformacji drożdży jest przeznaczony dla 10 96-dołkowych płytek, ale można go odpowiednio skalować w górę lub w dół. W przypadku eksperymentów na większą skalę kluczem do sukcesu jest uporządkowanie wszystkich płytek i odczynników.

Gdy eksperyment jest w toku, aby uniknąć nieporozumień, w tym protokole zostanie użyty szybki kontroler cieczy na płytce biobota Aby rozpocząć porcję, od pięciu do 10 mikrolitrów DNA osocza z biblioteki plazmidów drożdży tablicowych do każdej studzienki rundy. Dolne płytki 96-dołkowe. Umieść na noc 96 odkrytych płytek dołkowych w czystym okapie stołowym do wyschnięcia.

Następnie zaszczepić 200 mililitrów drożdży, peptydu, dekstrozy lub pożywki YPD szczepem zapytania w 500-mililitrowej kolbie Lin Meyera z przegrodami, inkubować przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem następnego ranka. Rozcieńczyć szczep zapytania do OD 600 0,1 w dwóch litrach pożywki YPD, aby uzyskać optymalny wzrost. Hoduj do jednego litra kultur w oddzielnych kolbach z przegrodami o pojemności 2,8 litra.

Potrząsać kolbami przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż kultury osiągną OD 600 0,8 do 1,0. Gdy kultura drożdży osiągnie OD 600 od 0,8 do 1,0, zbierz komórki przez odwirowanie. Napełnij cztery jednorazowe stożkowe probówki o pojemności 225 mililitrów kulturą i wiruj 3000 obr./min przez pięć minut w wirówce stołowej.

Odlewać supernatant S z każdej probówki. Dodaj więcej kultur do tych samych probówek i ponownie odwiruj, powtarzając w razie potrzeby, aż wszystkie komórki zostaną zebrane. Umyj każdą komórkę w 50 mililitrach wody destylowanej w autoklawie i wydaj Resus przez wirowanie.

Połącz ogniwa w jednej dwustu dwudziestu pięciu mililitrowych stożkowych rurkach i wiruj z prędkością 3000 obr./min przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu S umyj ogniwa w stu mililitrach roztworu octanu litu. Wiruj ponownie z prędkością 3000 obr./min przez pięć minut.

Usuń SNA, ponownie zawieś osad ogniwa w 70 mililitrach roztworu octanu litu. Wiruj z dużą prędkością przez około 30 sekund, aż granulka zostanie całkowicie ponownie zawieszona. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie dodaj beta me kapto etanol do 0,1 molowej inkubacji z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji dodaj dwa mililitry ugotowanego i schłodzonego DNA plemników łososia do mieszaniny komórek. Wlać mieszaninę komórek do autoklawowalnej płytki jednodołkowej, a następnie usunąć wszelkie wytrącające się osady, które mogą zakłócać dalsze pipetowanie.

Za pomocą szybkiej płytki biobot podajcie 50 mikrolitrów mieszaniny komórek do każdego dołka z czterech wcześniej przygotowanych. 96-dołkowe płytki zawierające plazmowe DNA nie mieszają się. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania podczas inkubacji komórek.

Przygotuj 200 mililitrów roztworu octanu litu PEG DMSO. Połącz 160 mililitrów 50% PEG 33, 50 20 mililitrów DMSO i 20 mililitrów jednego molowego octanu litu. Ważne jest, aby ten roztwór był przygotowany tuż przed użyciem.

Dodaj 125 mikrolitrów roztworu octanu litu PEG DMSO do każdego. Dobrze wymieszać, zasysając i dozując zawiesinę komórek osiem razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania.

Następnie szokuj termicznie komórki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 15 minut W suchym inkubatorze nie układaj płytek w stosy po szoku cieplnym, obracaj płytki za pomocą adapterów wirówek, aby pomieścić 96-dołkowe płytki. Po odwirowaniu usuń roztwór PEG, odwracając płytki nad wiadrem na odpady. Następnie osusz odwrócone talerze na ręcznikach papierowych.

Aby usunąć resztki cieczy, komórki pozostaną na dnie studzienek. Wypłucz komórki, dodając do każdej z nich 200 mikrolitrów minimalnej ilości pożywki. Cóż, ponownie obróć talerze.

Usunąć supernatant, odwracając go nad wiadrem na odpady i osuszając ręczniki papierowe. Dodaj 200 mikrolitrów minimalnej ilości pożywki do każdej studzienki za pomocą szybkiej płytki, inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni bez wstrząsania. Po dwóch dniach na dnie każdej pomyślnie przekształconej komórki powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.

Cóż, aby przygotować się do testu Spatting, najpierw dozuj 200 mikrolitrów minimalnej pożywki na bazie OSE do każdej studzienki nowego mieszkania. Dolna płytka 96-dołkowa. Następny. Wymieszać każdą studzienkę płytki transformacyjnej, zasysając i dozując zawiesinę komórek osiem razy za pomocą szybkiej płytki.

Zaszczepić każdą studzienkę płytki rafinozy pięcioma mikrolitrami mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Następnego dnia. Na dnie każdego z nich powinny znajdować się małe kolonie.

Dobrze wykonaj test plamowania w kapturze, wysterylizuj 96, replikator lub frogger przez płomienie. Wymieszaj kolonie za pomocą żabki, a następnie umieść kolonie na selektywnych płytkach pożywki. Po plamieniu pozostaw płytki do wyschnięcia w kapturze przez pięć do 10 minut.

Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki plazmidu drożdżowego nad ekranem ekspresji w celu identyfikacji supresorów i wzmacniaczy TDP 43.Toksyczność. TDP 43 jest ludzkim białkiem, które bierze udział w patogenezie miotroficznego stwardnienia bocznego lub choroby Lou Gehriga, ekspresja TDP 43 w komórkach drożdży powoduje agregację i cytotoksyczność.

Płytki te wykazują kolonie ze zintegrowanym plazmidem indukowanym galaktozą, plazmidem T DP 43, które zostały również przekształcone za pomocą plazmidów z biblioteki ekspresji genu flex ORF. Kolonie w tym miejscu wydają się mieć czerwony kolor, ponieważ szczep ma mutację, która powoduje nagromadzenie czerwonego pigmentu. Płytka po lewej stronie zawiera glukozę, która hamuje ekspresję T DP 43 lub plazmidów genu flex

Płytka po prawej stronie zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP 43 i O F w plazmidach genu flex. Zielony grot strzałki wskazuje kolonię przekształconą w plazmid, który tłumi toksyczność TDP 43, na co wskazuje szybszy wzrost i gęstsze kolonie. Czerwony grot strzałki wskazuje kolonię przekształconą w plazmid, który zwiększa toksyczność TDP 43, na co wskazuje wolniejszy wzrost i mniej gęste kolonie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przekształcić bibliotekę DNA z plazmy i komórek.