Name: Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe nadekspresji plazmidu drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowej transformacji Saccharomyces cerevisiae przy użyciu robota do pipetowania ciekłego. Protokół umożliwia systematyczne badania nadekspresji plazmidów w celu identyfikacji modyfikatorów genetycznych toksyczności białek neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z Packard Center for ALS Research na Johns Hopkins (A.D.G.), NIH Director’s New Innovator Award 1DP2OD004417-01 (A.D.G), NIH R01 NS065317 (A.D.G.) oraz Rita Allen Foundation Scholar Award. A.D.G. jest stypendystą Pew Scholar in the Biomedical Sciences, wspieranym przez The Pew Charitable Trusts.

1. Przygotowania do transformacji drożdży
Niniejszy protokół został opracowany dla dziesięciu płytek 96-dołkowych, lecz można go odpowiednio przeskalować w górę lub w dół. Stwierdziliśmy, że protokół ten nie sprawdza się w przypadku więcej niż dwudziestu płytek 96-dołkowych w jednej serii transformacji. Cała procedura transformacji (od kroku I.3) zajmie około ośmiu godzin.
<ol>
<li>Za pomocą systemu do dozowania cieczy Biorobot RapidPlate nanieś aliquoty 5-10μL plazmidowego DNA (100 ng/μl) z biblioteki Yeast FLEXGene ORF do każdego dołka okrągłego płyty 96-dołkowej. Pozostaw nieprzykryte płyty 96-dołkowe w czystej komorze z wyciągiem na noc w celu wysuszenia. Odnotowaliśmy podobną wydajność transformacji w przypadku plazmidów drożdżowych CEN i 2μ.</li>
<li>Zaszczep 200mL pożywki peptone dextrose (YPD) dla drożdży (10g/L ekstraktu drożdżowego, 20g/L peptonu, 20g/L glukozy) szczepem badanym w kolbie Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 500mL. Inkubuj przez noc w temperaturze 30°C przy potrząsaniu (200 rpm). W razie potrzeby do tych kultur startowych można zastosować również pożywki selektywne.</li>
<li>Następnego ranka rozcieńcz szczep badany do OD600=0,1 w 2L pożywki YPD. Potrząsaj przez 4-6 godzin w temperaturze 30°C (200 rpm), aż kultura osiągnie OD600=0,8-1,0. Dla uzyskania optymalnego wzrostu wyhoduj dwie kultury po 1L w oddzielnych kolbach z przegrodami o pojemności 2,8 L. W razie potrzeby zamiast YPD można zastosować pożywki selektywne.</li>
</ol>
2. Transformacja drożdży
<ol>
<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie. Napełnić cztery jednorazowe probówki stożkowe o pojemności 225mL kulturą drożdży i wirować przy 3000rpm (˜1800 x g) przez 5 minut w wirówce laboratoryjnej (Eppendorf 5810R). Odlać nadsącz i powtarzać czynność aż do zebrania wszystkich komórek.</li>
<li>Przemyć komórki w 200mL autoklawowanej wody destylowanej H2O. Resuspender osad komórkowy poprzez potrząsanie lub wortexowanie. Połączyć komórki w jednej probówce stożkowej 225mL. Wirować przy 3000rpm przez 5 minut. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Przygotować roztwór 0.1MLiOAc/1XTE (0.1M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 w autoklawowanej wodzie destylowanej). Przemyć komórki w 100mL 0.1MLiOAc/1XTE. Wirować przy 3000rpm przez 5 minut. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Resuspender osad komórkowy w 70mL 0.1M LiOAc/1xTE. Potrząsać i/lub wortexować, aby upewnić się, że osad został całkowicie zresuspendowany.</li>
<li>Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 rpm).</li>
<li>Dodać β-merkaptoetanol do stężenia 0.1M. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 rpm). Uwaga: Ten krok można pominąć w przypadku stosowania szczepów drożdży wrażliwych na β-merkaptoetanol. Stwierdzono, że krok ten nie jest niezbędny do pomyślnej transformacji, jednak zwiększa on jej wydajność.</li>
<li>Gotować 2mL sonikowanego DNA z plemników łososia (10mg/mL) przez 15 minut, a następnie schłodzić na lodzie.</li>
<li>Dodać 2mL gotowanego DNA z plemników łososia do mieszaniny komórkowej. Uwaga: Po dodaniu DNA z plemników łososia do mieszaniny komórkowej może powstać osad. Używając pipety automatycznej z końcówką 200 μl, ostrożnie usunąć wszelki powstały osad, ponieważ może on utrudniać późniejsze pipetowanie.</li>
<li>Nanieść 50μL mieszaniny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej za pomocą BioRobot Rapidplate (można również użyć pipety wielokanałowej). Nie mieszać.</li>
<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.</li>
<li>Przygotować 200mL roztworu 40%PEG-3350/10%DMSO/0.1M LiOAc (160mL 50% PEG-3350, 20mL DMSO, 20mL 1M LiOAc). Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
<li>Dodać 125μL roztworu PEG/LioAc/DMSO do każdej studni. Wymieszać poprzez ośmiokrotne odessanie i wydanie zawiesiny komórkowej za pomocą RapidPlate.</li>
<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.</li>
<li>Poddać komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42°C przez 15 minut w inkubatorze suchym. Nie układać płytek w stosy. Uwaga: Stwierdzono, że ten krok szoku termicznego nie jest niezbędny do pomyślnej transformacji. Dla niektórych szczepów drożdży (np. mutantów wrażliwych na temperaturę) szok termiczny jest szkodliwy. Wcześniej skrócono czas szoku termicznego do jednej minuty, co pozwoliło na pomyślną transformację szczepu drożdży posiadającego mutację temperaturozależną ypt1 przy użyciu tego protokołu.</li>
<li>Wirować płytki przy 2500rpm (˜1100 x g) przez 5 minut, używając adapterów do wirówek przeznaczonych dla płytek 96-dołkowych. Usunąć roztwór PEG, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady. Osuszyć odwróconą płytkę ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki cieczy (komórki pozostaną na dnie studni).</li>
<li>Przepłukać komórki, dodając 200μL pożywki minimalnej (np. SD/-Ura) do każdej studni za pomocą RapidPlate.</li>
<li>Wirować płytki przy 2500rpm przez 5 minut i usunąć nadsącz, odwracając je nad pojemnikiem na odpady i osuszając ręcznikami papierowymi.</li>
<li>Dodać 200μL pożywki minimalnej (np. SD/-Ura) do każdej studni za pomocą RapidPlate.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 30°C przez 2 dni bez wytrząsania. Po 2 dniach na dnie każdej pomyślnie transformowanej studni powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.</li>
</ol>
3. Analiza kropelkowa (Spotting assay)
<ol>
<li>Do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej o płaskim dnie nalać 200μL minimalnego podłoża opartego na rafinozie (np. SRaf/-Ura).</li>
<li>Wymieszać zawartość każdego dołka na płytce transformacyjnej, ośmiokrotnie aspirując i dozując zawiesinę komórkową za pomocą Rapidplate.</li>
<li>Zaszczepić płytki SRaf, przenosząc 5μL mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 30°C przez jeden dzień. Po jednym dniu na dnie każdego dołka powinny pojawić się małe kolonie.</li>
<li>Przenieść kolonie na płytki SD/-Ura oraz SGal/-Ura w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zestaw do replikacji 96-dołkowej (frogger) wysterylizować przez opalanie płomieniem. Przed przeniesieniem na selektywne podłoża wymieszać kolonie za pomocą replikatora. Po przeniesieniu pozostawić płytki do wyschnięcia w komorze przez 5-10 minut.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 dni.</li>
</ol>

Wykonaj zdjęcia płytek za pomocą aparatu cyfrowego i wizualnie porównaj wzrost kolonii na płytkach SGal/-Ura, aby zidentyfikować kolonie, w których toksyczność szczepu badanego jest zwiększona (wolniejszy wzrost/mniej gęste kolonie) lub zredukowana (szybszy wzrost/bardziej gęste kolonie). 
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Test na mikropłytkach porównujący ekspresję TDP-43 w glukozie i galaktozie, podkreślający regulację genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przesiewowe badanie nadekspresji plazmidowej u drożdży w celu identyfikacji supresorów i enhancerów toksyczności TDP-43. TDP-43 to ludzkie białko, które jest zaangażowane w patogenezę stwardnienia bocznego zanikowego (choroby Lou Gehriga). Cytoplazmatyczne agregaty TDP-43 gromadzą się w neuronach mózgu i rdzenia kręgowego pacjentów z ALS 17. Ekspresja TDP-43 w komórkach drożdży prowadzi do agregacji i cytotoksyczności 18. Wykorzystaliśmy ten model systemowy do zdefiniowania mechanizmów toksyczności TDP-43 19,20. Przedstawiono reprezentatywne przykłady płytek z naszego badania modyfikatorów toksyczności TDP-43 u drożdży. Płytki te zawierają kolonie z zintegrowanym plazmidem TDP-43 indukowanym galaktozą, które zostały również przekształcone plazmidami z biblioteki ekspresji ORF FLEXGene. Płytka po lewej zawiera glukozę, która represuje ekspresję TDP-43 lub plazmidów FLEXGene. Płytka po prawej zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP-43 oraz ORF w plazmidach FLEXGene. Zielona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który supresuje toksyczność TDP-43. Czerwona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który wzmacnia toksyczność TDP-43.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania wysokoprzepustowego screeningu nadekspresji plazmidowej w drożdżach. Podejście to umożliwia szybki i bezstronny screening genetycznych modyfikatorów wielu różnych fenotypów komórkowych. Stosując tę metodę, badacz może przeanalizować znaczną część genomu drożdży w ciągu kilku tygodni. To bezstronne podejście pozwala również na identyfikację modyfikatorów, których nie można było przewidzieć na podstawie wcześniejszych odkryć. Wykorzystaliśmy tę metodę do ident...

<table><tbody><tr><td>BioRobot RapidPlate</td><td>Qiagen</td><td>9000490</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy replikator (frogger)</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP404</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka ORF FLEXGene</td><td>Institute of Proteomics, Harvard Medical School</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kolba z przegrodami 500mL</td><td>Bellco Glass</td><td>2543-00500</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Fernbacha z potrójnymi przegrodami 2.8L</td><td>Bellco Glass</td><td>2551-02800</td><td></td></tr><tr><td>Napiwniki do pipet Rapidplate 100&amp;mu;L</td><td>Axygen Scientific</td><td>ZT-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Napiwniki do pipet Rapidplate 200&amp;mu;L</td><td>Axygen Scientific</td><td>ZT-200-R-S</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Drożdże pączkujące, Saccharomyces cerevisiae, stanowią potężny system modelowy do definiowania fundamentalnych mechanizmów wielu istotnych procesów komórkowych, w tym tych bezpośrednio związanych z chorobami ludzi. Ze względu na krótki czas generacji i dobrze scharakteryzowany genom, główną zaletą eksperymentalną modelu drożdżowego jest możliwość przeprowadzania przesiewów genetycznych w celu identyfikacji genów i szlaków zaangażowanych w dany proces. W ciągu ostatnich trzydziestu lat takie przesiewy genetyczne były wykorzystywane do wyjaśnienia cyklu komórkowego, szlaku wydzielniczego oraz wielu innych wysoce konserwatywnych aspektów biologii komórki eukariotycznej 1-5. W ostatnich kilku latach stworzono kilka bibliotek szczepów drożdży i plazmidów obejmujących cały genom 6-10. Kolekcje te umożliwiają obecnie systematyczne badanie funkcji genów z wykorzystaniem podejść opartych na zwiększeniu (gain-of-function) i utracie funkcji (loss-of-function) 11-16. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół wykorzystania wysokoprzepustowej metody transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia przesiewu nadekspresji plazmidowej z wykorzystaniem uporządkowanej biblioteki 5 500 plazmidów drożdżowych. Wykorzystujemy te przesiewy do identyfikacji genetycznych modyfikatorów toksyczności związanej z akumulacją białek chorób neurodegeneracyjnych człowieka podatnych na agregację. Przedstawione tutaj metody można łatwo zaadaptować do badania innych interesujących fenotypów komórkowych.

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Drożdże pączkujące, Saccharomyces cerevisiae, stanowią potężny system modelowy do definiowania podstawowych mechanizmów wielu istotnych procesów komórkowych, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transformacja komórek drożdży biblioteką macierzy plazmidowego DNA. Jest to realizowane poprzez uprzednie namnożenie odpowiedniej ilości komórek drożdży. Następnie komórki drożdży są traktowane octanem litu, aby uczynić je kompetentnymi do transformacji DNA.Następnie należy przeprowadzić transformację kompetentnych komórek e poprzez zmieszanie ich z DNA. Ostatnim etapem procedury jest selekcja i analiza transformantów. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ plazmidowego DNA na fenotypy drożdży za pomocą testów kropelkowych (spotting assays) oraz/lub mikroskopii.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami, takimi jak standardowe transformacje drożdży, jest możliwość zautomatyzowanej transformacji dużej liczby różnych plazmidów do komórek drożdży. Ten wysokoprzepustowy protokół transformacji drożdży został opracowany dla 10 płytek 96-dołkowych, jednak można go odpowiednio skalować w górę lub w dół. W przypadku eksperymentów na większą skalę kluczem do sukcesu jest zachowanie odpowiedniej organizacji wszystkich płytek i odczynników.Aby uniknąć pomyłek w trakcie trwania eksperymentu, w niniejszym protokole zostanie użyty automatyczny dozownik cieczy do płytek biobot rapid plate liquid handler. W celu rozpoczęcia, należy nanieść od 5 do 10 µL plazmidowego DNA drożdży z biblioteki macierzowej do każdego dołka okrągłych płytek 96-dołkowych z płaskim dnem. Płytki 96-dołkowe należy pozostawić niezakryte w czystej komorze z wyciągiem przez noc w celu wysuszenia.Następnie zaszczep szczep badawczy w 200 mililitrach pożywki dekstrozy z peptydem drożdżowym (YPD) w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodami i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Następnego ranka rozcieńcz szczep badawczy do wartości OD 600 wynoszącej 0.1 w dwóch litrach pożywki YPD w celu zapewnienia optymalnego wzrostu. Hoduj kultury do objętości jednego litra w osobnych 2,8-litrowych kolbach z przegrodami.Inkubuj kolby z wytrząsaniem przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 30 °C, aż kultury osiągną wartość OD 600 od 0,8 do 1,0. Po osiągnięciu przez kulturę drożdży wartości OD 600 w zakresie 0,8–1,0, zebrać komórki poprzez wirowanie. Napełnić kulturą cztery jednorazowe stożkowate probówki o pojemności 225 ml i wirować z prędkością 3000 RPM przez pięć minut w wirówce laboratoryjnej.Odlać supernatant S z każdej probówki. Dodać więcej kultury do tych samych probówek i ponownie odwirować, powtarzając czynność w razie potrzeby, aż do zebrania wszystkich komórek. Przemyć każdy osad komórkowy w 50 mililitrach wody destylowanej autoklawowanej i resuspendować poprzez wstrząsanie na wirówce typu vortex.Połączyć komórki w jednej probówce stożkowej o pojemności 225 ml i wirować przy 3000 RPM przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu S, przemyć komórki w 100 ml roztworu octanu litu. Ponownie wirować przy 3000 RPM przez pięć minut.Usunąć SNA i zawiesić osad komórkowy w 70 mililitrach roztworu octanu litu. Mieszać w wstrząsarzu typu vortex z dużą prędkością przez około 30 sekund, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie dodać beta-merkaptoetanol do roztworu 0,1 M i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez kolejne 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji dodać 2 mL przegotowanego i schłodzonego DNA z nasienia łososia do mieszaniny komórkowej. Przelać mieszaninę komórkową do autoklawowalnej płytki jednodobowej, a następnie usunąć wszelkie powstałe osady, ponieważ mogą one utrudniać późniejszą pipetację.Używając biobota do szybkiego rozlewania, nanieś 50 µL mieszaniny komórek do każdej studni czterech wcześniej przygotowanych płytek 96-dołkowych zawierających plazmowe DNA; nie mieszaj. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania podczas inkubacji komórek.Przygotować 200 ml roztworu PEG DMSO i octanu litu. Połączyć 160 ml 50%PEG 33,50, 20 ml DMSO oraz 20 ml jednomolarnego octanu litu. Ważne jest, aby roztwór ten przygotować bezpośrednio przed użyciem.Do każdej próbki dodać 125 µL roztworu PEG, octanu litu i DMSO. Dokładnie wymieszać, aspirując i dozując zawiesinę komórkową osiem razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.Następnie poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 15 minut w suchym inkubatorze. Po szoku termicznym nie układaj płytek w stosy; wiruj je, używając adapterów do wirówki dostosowanych do płytek 96-dołkowych. Po wirowaniu usuń roztwór PEG, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady. Następnie osusz odwrócone płytki za pomocą ręczników papierowych.Aby usunąć pozostałą ciecz, komórki pozostaną na dnie dołków. Przepłucz komórki, dodając 200 µL minimalnego medium do każdego z nich. Ponownie odwiruj płytki.Usunąć nadsącz, odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady i osuszając ją ręcznikami papierowymi. Do każdej studni dodać 200 µL pożywki minimalnej za pomocą inkubatora do płytek i inkubować w temperaturze 30 °C przez dwa dni bez wytrząsania. Po dwóch dniach na dnie każdej skutecznie przetransformowanej studni powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.Aby przygotować się do testu Spatting, najpierw należy odmierzyć 200 µL minimalnego podłoża na bazie OSE do każdego dołka nowej płaskodنnej płytki 96-dołkowej. Następnie należy wymieszać zawartość każdego dołka na płytce transformacyjnej, aspirując i dozując zawiesinę komórkową osiem razy za pomocą szybkiego pipetowania.Każdy dołek płytki z rafinozą zaszczepić pięcioma mikrolitrami mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej i inkubować w temperaturze 30 °C przez jeden dzień. Następnego dnia na dnie każdego dołka powinny być obecne małe kolonie.Test plamkowy (spotting assay) zostanie przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza; należy wysterylizować 96-dołkowy replikator lub tzw. frogger poprzez opalenie płomieniem. Kolonie należy wymieszać za pomocą replikatora, a następnie nanieść je w formie plamek na płytki z podłożem selektywnym. Po naniesieniu plamek należy pozostawić płytki do wyschnięcia w komorze przez 5 do 10 minut.Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla przesiewu nadekspresji plazmidów drożdżowych w celu zidentyfikowania supresorów i enhancerów toksyczności TDP 43. TDP 43 to ludzkie białko, które jest zaangażowane w patogenezę stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) lub choroby Lou Gehriga; ekspresja TDP 43 w komórkach drożdży prowadzi do agregacji i cytotoksyczności.Na tych płytkach widoczne są kolonie z zintegrowanym plazmidem T DP 43 indukowanym galaktozą, które zostały również przekształcone plazmidami z biblioteki ekspresji ORF genów flex. Kolonie te mają kolor czerwony, ponieważ szczep posiada mutację skutkującą gromadzeniem czerwonego pigmentu. Płytka po lewej stronie zawiera glukozę, która represuje ekspresję T DP 43 lub plazmidów genów flex.Szalka po prawej stronie zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP 43 oraz O Fs w plazmidach genu flex. Zielona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który znosi toksyczność TDP 43, co objawia się szybszym wzrostem i większą gęstością kolonii. Czerwona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który nasila toksyczność TDP 43, co objawia się wolniejszym wzrostem i mniejszą gęstością kolonii.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić transformację biblioteki plazmidowego DNA z komórek.

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajne przesiewowe badanie nad nadmierną ekspresją plazmidów drożdży

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowej transformacji Saccharomyces cerevisiae przy użyciu robota do pipetowania ciekłego. Protokół umożliwia systematyczne badania nadekspresji plazmidów w celu identyfikacji modyfikatorów genetycznych toksyczności białek neurodegeneracyjnych.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów