Name: Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego wstrzyknięcia wektora lentiwirusowego do rdzenia kręgowego szczura, umożliwiającą retrogradne śledzenie obwodów nerwowych. Technika ta wspiera badania nad terapią genową i łącznością neuronalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01 R01NS103481 oraz grantów Shriners Hospital for Pediatric Research SHC 84051 i SHC 86000 oraz Departamentu Obrony (SC140089).

Wszystkie poniższe procedury chirurgiczne i opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Temple.
1. Przygotowania przedoperacyjne
<ol>
	<li>Na kilka dni przed zabiegiem należy przygotować wyciągnięte szklane igły do wstrzyknięcia wirusa za pomocą szklanych pipet kapilarnych o pojemności 3,5 nanolitra przeznaczonych do wstrzykiwaczy nanolitrowych. Pociągnij każdą pipetę za pomocą dwustopniowego ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć dwa szablony igieł.</li>
	<li>Udoskonal końcówkę szablonów igieł, odcinając około 1-2 mm nadmiaru szkła mikronożyczkami. Zmierz przybliżoną wielkość apertury pod mikroskopem za pomocą szkiełka kalibracyjnego mikroskopu, aby wyizolować igły o aperturze 30-40 μm.</li>
	<li>Ustawiając igłę pod kątem 30°, użyj ukosowarki do mikropipet, aby utworzyć końcówkę o aperturze 30-40 μm i kącie ukosu 45°. Sprawdź szerokość przysłony za pomocą skali noniusza na szkiełku kalibracyjnym. Przepuścić wodę i etanol przez szklaną igłę za pomocą strzykawki z elastyczną nasadką do igły, aby zmyć zanieczyszczenia i oznaczyć igłę w regularnych odstępach czarnym markerem.</li>
	<li>Umieść igły na przykrytej szalce Petriego, uprzednio oczyszczonej 70% etanolem i sterylizuj przez 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego pod światłem UV.</li>
	<li>Przygotować lentiwirusa HiRet, wyjmując odpowiednią objętość z zamrażarki bezpośrednio przed zabiegiem. 
	UWAGA: Odpowiednia objętość obejmuje ilość potrzebną do wstrzyknięcia (1 μl na wstrzyknięcie x liczba wstrzyknięć) plus niewielką ilość dodatkowej objętości uwzględniającą straty związane z pipetowaniem i obciążeniem. Wirus należy transportować i przechowywać na lodzie, gdy nie jest używany.</li>
	<li>Przygotuj wtryskiwacz, podłączając go do mikropompy i umieszczając w mikromanipulatorze ze skalą noniuszową.</li>
	<li>Aby przygotować szklaną igłę, ostrożnie załaduj kolorowy barwnik, taki jak czerwony olej, za pomocą strzykawki wyposażonej w elastyczną igłę. Upewnij się, że w igle nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Podczas obchodzenia się z igłą należy stosować technikę aseptyczną i powstrzymać się od dotykania końcówki.</li>
	<li>Włóż szklaną igłę do wtryskiwacza, upewniając się, że igła jest prawidłowo osadzona w podkładkach, nasadka wtryskiwacza jest mocno dokręcona, a stalowa igła wtryskiwacza jest przedłużona o około 3/4 długości szklanej igły. Wirus może zostać załadowany do igły w późniejszym kroku.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Zważ zwierzę na wadze cyfrowej. Zapisz masę ciała przed operacją, aby określić wymaganą objętość środka znieczulającego i umożliwić monitorowanie masy ciała po operacji. W tym protokole użyto samic szczurów Sprague-Dawley o wadze około 200–250 g.</li>
	<li>Znieczulić szczura za pomocą inhalacji izofluranu lub wstrzykniętego roztworu ketaminy/ksylazyny (k/x). W tym przypadku ketamina jest wstrzykiwana dootrzewnowo w dawce 67 mg/kg, a ksylazyna w dawce 6,7 mg/kg.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, mocno ściskając stopę. Jeśli dojdzie do odruchowego wycofania, odczekaj kilka dodatkowych minut przed kontynuowaniem. 
	UWAGA: Obserwuj również wąsy, oczy i częstość oddechów pod kątem oznak świadomości. Jeśli wąsy drgają, oko mruga przy delikatnym dotyku lub oddech jest szybki i płytki, poczekaj, aż płaszczyzna znieczulenia znajdzie się głębiej, aby kontynuować protokół. Należy również monitorować te objawy przez cały czas trwania laminektomii i operacji iniekcji. Jeśli zwierzę wykazuje płytką płaszczyznę znieczulania, podaj zastrzyk przypominający z ketaminy równej 1/2 pierwotnej dawki k/x.</li>
	<li>Ogol szczura wzdłuż grzbietowej linii środkowej od bioder do dolnego kąta łopatek. Napnij skórę zwierzęcia, aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne golenie.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy.</li>
	<li>Zastosuj środek antyseptyczny na ogolony obszar, aby wysterylizować miejsce. Do pierwszego peelingu nasącz sterylną gazę 5% roztworem jodu i zetrzyj wszystkie włosy i zanieczyszczenia. Następnie przesuń jednokierunkowo sterylną gazą nasączoną 70% etanolem, tak aby żaden obszar nie stykał się dwukrotnie. Użyj tej samej techniki z naprzemiennym jodem i gazą nasączoną etanolem jeszcze dwa razy.</li>
</ol>
3. Pole operacyjne i przygotowanie narzędzi
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw autoklawowanych narzędzi chirurgicznych, który zawiera skalpel, rongeurs, kleszczyki do zębów szczura, nożyczki sprężynowe, hemostatyki, kleszcze i retraktory o średnim czubku zakrzywionym lub obciążone haczyki, rozwijając sterylną folię, aby stworzyć sterylne pole.</li>
	<li>Otwórz opakowanie sterylnych rękawic chirurgicznych i połóż sterylną folię na rękawiczki na stole. Użyj tego jako dodatkowego sterylnego pola dla używanych narzędzi, aby zapobiec zanieczyszczeniu sterylnej folii.</li>
	<li>Upuść ostrze skalpela #10 na sterylne pole. Przymocuj ostrze do uchwytu za pomocą hemostatów. W dostępnym miejscu umieść sterylną sól fizjologiczną, chromowy szew katgutowy 4.0 oraz materiały do tamowania krwawienia, takie jak kauteryzator, sterylna gaza, sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką (w przypadku krwawień mięśniowych) lub pianka żelowa lub wosk kostny (w przypadku krwawień kostnych).</li>
	<li>Weź zwierzę i połóż je na sterylnej szmatce. Umieść gazę pod pęcherzem, aby zebrać mocz. Podeprzyj obszar docelowy zwiniętym ręcznikiem pod brzuchem. Jeśli to możliwe, umieść chirurgiczną poduszkę grzewczą pod sterylną szmatką, szczególnie w przypadku dłuższych zabiegów. 
	UWAGA: Sterylność jest ważna podczas operacji przeżycia. Miej pod ręką butelkę z rozpylaczem zawierającą 70% etanol, aby utrzymać sterylność rąk w rękawiczkach, oraz sterylizator kulkowy, jeśli sterylność narzędzi jest zagrożona lub między poszczególnymi operacjami.</li>
</ol>
4. Odsłonięcie kręgosłupa i identyfikacja miejsca laminektomii
<ol>
	<li>Zidentyfikuj obszar, w którym zostanie wykonane nacięcie skóry, delikatnie naciskając palce na ostatnie żebro, aby zlokalizować kręg L1. Używając tego jako punktu orientacyjnego, wykonaj 3-4 cm nacięcie skóry za pomocą skalpela chirurgicznego #10 kończącego się nieco poniżej L1, aby odsłonić mięsień. Przytrzymaj skórę napiętą, delikatnie rozprowadzając i mocno dociśnij ostrzem skalpela, aby zapewnić czyste nacięcie.</li>
	<li>W razie potrzeby wytnij i rozprowadź powierzchowny tłuszcz za pomocą kleszczy i nożyczek. (W zależności od kręgu docelowego może istnieć duża poduszeczka tłuszczowa przylegająca do mięśnia). </li>
	<li>Wyczuj wyrostki kolczyste płaską częścią ostrza skalpela lub palcem. Często obszar linii środkowej będzie obrysowany literą "V" białej powięzi po obu stronach. Wykonaj małe nacięcie rostralne, aby zapewnić miejsce na bezpieczne uchwycenie górnego wyrostka za pomocą kleszczy do zębów szczura, a następnie wykonaj 2 długie, głębokie nacięcia jak najbliżej wyrostków. W najgłębszym miejscu nacięcia można wyczuć ostrzem skalpela grzbietową powierzchnię kręgów.</li>
	<li>Trzymaj mięśnie boczne na bok za pomocą zwijaczy lub obciążonych haków, aby poprawić widoczność. Oczyść mięśnie wokół procesów za pomocą skalpela, nożyczek sprężynowych lub rongeurów, aby określić kształt ich głów. 
	UWAGA: Pamiętaj, że rdzeń kręgowy nie rozciąga się na całej długości kręgosłupa, ponieważ tkanka rdzenia kręgowego przestaje rosnąć wcześniej w rozwoju niż kość. Oznacza to, że docelowy poziom kręgosłupa może znajdować się pod inaczej nazwanym kręgiem.</li>
	<li>Zlokalizuj T11 i sąsiednie procesy T12 i T13. 
	UWAGA: Pomoc w celowaniu w prawidłowe poziomy kręgów można znaleźć w atlasie rdzenia kręgowego szczura i wcześniejszych badaniach przedstawiających punkty orientacyjne u myszy, która ma bardzo podobną strukturę kręgów6,33. Pozostaw niezakłócony wyrostek kolczysty rostralny, taki jak T9, aby uzyskać punkt orientacyjny w linii środkowej.</li>
</ol>
5. Wykonywanie laminektomii
<ol>
	<li>Po prawidłowym zidentyfikowaniu obszaru docelowego należy wykonać laminektomię grzbietowych aspektów T11-T13. Delikatnie rozłóż kręgi, aby odsłonić więzadła międzykręgowe, które są dobrymi miejscami do wprowadzenia rongeurs do początkowego ugryzienia kości. Trzymaj rongeurs w pozycji półzamkniętej, aby zwiększyć precyzyjną kontrolę.</li>
	<li>Usuń wyrostki kolczyste i grzbietową część kręgów, biorąc małe kęsy rongeurs. Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego ani nie naruszyć opony twardej. Lekko podnieś kleszcze do zębów szczura, aby pomóc odciągnąć rdzeń kręgowy od kręgów i zmniejszyć skłonność do uderzania w tkankę rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Oczyść kość z dala od linii środkowej, aby można było zaobserwować naczynie krwionośne w linii środkowej. Zostaw okno, które wyraźnie pokazuje tkankę rdzenia kręgowego i jest wolne od zanieczyszczeń.</li>
	<li>Delikatnie dotknij rdzenia kręgowego kleszczami. Niektóre zwierzęta mogą odruchowo skakać, nawet jeśli ich płaszczyzna znieczulenia jest głęboka. Nałóż kilka kropli środka znieczulającego, takiego jak lidokaina, bezpośrednio na rdzeń kręgowy, aby zapobiec skakaniu podczas zabiegu wstrzykiwania.</li>
	<li>Zabezpiecz zwierzę w uchwycie kręgosłupa, mocując kleszcze stabilizujące do wyrostków kolczystych, rostralnych i ogonowych do okna laminektomii. Podnieś brzuch zwierzęcia za pomocą uchwytu kręgosłupa, aby zniwelować efekt ruchów oddechowych. Zwiększy to stabilność igły i zapewni odpowiednią głębokość wstrzyknięcia.</li>
</ol>
6. Wczytywanie wirusa i ustawianie wtryskiwacza
<ol>
	<li>Załadować wirusa do wstrzykiwacza, pipetując około 5 μl na kawałek parafilmu i ustawiając igłę tak, aby końcówka znajdowała się wewnątrz kropli.</li>
	<li>Za pomocą mikropompy należy pobrać do 4 μl wirusa z szybkością 20–100 nL/s.</li>
	<li>Ustawić kontroler tak, aby wstrzykiwał i uwalniał niewielką ilość wirusa z igły, aby upewnić się, że końcówka igły nie jest zablokowana. Zetrzyj nadmiar wirusa za pomocą laboratoryjnej chusteczki do ścierania. 
	UWAGA: Strzykawka Hamilton ze stalową igłą może być używana jako alternatywa dla pipet z wyciąganego szkła.</li>
	<li>Ustawić mikromanipulator tak, aby łuska noniusza była widoczna i umieścić igłę na linii środkowej rdzenia kręgowego. 
	UWAGA: Linia środkowa może być czasami zlokalizowana przez duże naczynie krwionośne biegnące po przedniej powierzchni rdzenia kręgowego. Może się to jednak różnić u poszczególnych szczurów, a celowanie w linię środkową powinno być potwierdzone przez porównanie z nienaruszonym wyrostkiem kolczystym.</li>
	<li>Skierować igłę w bok na 0,8 mm za pomocą skali noniusza na mikromanipulatorze.</li>
	<li>Opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż wbije się, ale nie przebije opony twardej. Szybkim ruchem skręcającym nakłuj oponę twardą igłą, aż zapadnie się na głębokość 1,5 mm.</li>
</ol>
7. Wstrzykiwanie wirusa do rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Po umieszczeniu igły na miejscu zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał z szybkością 400 nL/min. Upewnij się, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika. Nie powinno być widocznego wycieku ani wybrzuszenia tkanki rdzenia kręgowego. W przypadku zaobserwowania nieszczelności można ją czasami złagodzić, zmniejszając prędkość wtrysku do 200 nL/min.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na 2–5 minut (w zależności od wstrzykniętej objętości), aby ułatwić dyfuzję wirusa.</li>
	<li>Powoli wyjąć igłę i przejść do następnego miejsca wstrzyknięcia. Wstrzyknąć 1 μl wirusa do każdego z 6 równomiernie rozmieszczonych miejsc oddalonych od siebie o około 1 mm wzdłuż długości tkanki rdzeniowej L1-L4. Ta sama igła może być używana do każdego wstrzyknięcia, o ile działa prawidłowo.</li>
</ol>
8. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij zwierzę z uchwytu kręgosłupa i wyjmij zwijacze lub haki używane do rozciągania mięśni bocznych. Przed zamknięciem upewnij się, że rana jest wolna od wszelkich zanieczyszczeń.</li>
	<li>Zszyj mięsień za pomocą chromowego szwu katgutowego 4,0. Przetnij nici szwu blisko węzła, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wewnętrznego podrażnienia skóry.</li>
	<li>Zszyj skórę za pomocą spinek do ran o średnicy 9 mm. Aby umożliwić optymalne gojenie, wyrównaj krawędzie skóry przed zszyciem.</li>
	<li>Umieść zwierzę na podkładce do podgrzewania konwekcyjnego wody i monitoruj, aż się obudzi.</li>
	<li>Wstrzyknij podskórnie 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzupełnić płyny i antybiotyk, taki jak cefazolina, aby zapobiec infekcji. Kiedy zwierzę jest w stanie chodzić, umieść je z powrotem w klatce domowej i podaj początkowe środki przeciwbólowe. Monitoruj szczury pod kątem wszelkich oznak bólu i niepokoju i lecz zgodnie z zatwierdzoną przez IACUC procedurą łagodzenia bólu.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Manipulacja genetyczna neuronów w mózgu i rdzeniu kręgowym posłużyła do uwidocznienia szlaków czuciowych, motorycznych i autonomicznych za pomocą śledzenia fluorescencyjnego oraz do zbadania potencjału odrastania dróg neuronalnych po urazie 27,28,29,30,31,32,33. Bezpośrednie wstrzyknięcie ws...

Wektory wirusowe są ważnymi narzędziami biologicznymi, które mogą wprowadzać materiał genetyczny do komórek w celu kompensacji wadliwych genów, zwiększania poziomu ważnych białek wzrostu lub wytwarzania białek markerowych, które podkreślają strukturę i połączenia synaptyczne swoich celów. Ten artykuł koncentruje się na bezpośrednim wstrzyknięciu wysoce wydajnego, transportowalnego wstecznie wektora lentiwirusowego do rdzenia kręgowego szczura w celu uwidocznienia głównych szlaków motorycznych za pomocą śledzenia fluorescencyjnego. Metoda ta jest również wysoce odpowiednia do badań nad regeneracją i odrastaniem aksonów w celu wprowadzenia białek będących przedmiotem zainteresowania do różnych populacji neuronów i została wykorzystana do wyciszenia neuronów w badaniach mapowania funkcjonalnego<klasa sup="xref">1, 2.
Wiele szczegółów anatomicznych ścieżek motorycznych kręgosłupa zostało wyjaśnionych dzięki bezpośrednim badaniom iniekcji z klasycznymi znacznikami, takimi jak BDA i fluoro-gold3,4,5,6,7,8. Te znaczniki są uważane za złoty standard, ale mogą mieć pewne wady, takie jak wychwyt przez uszkodzone aksony lub aksony w przejściu w istocie białej otaczającej miejsce wstrzyknięcia9,10,11. Może to prowadzić do nieprawidłowych interpretacji połączeń szlaków i może być wadą w badaniach regeneracji, w których absorpcja barwnika przez uszkodzone lub odcięte aksony może zostać pomylona z regeneracją włókien podczas późniejszej analizy12.
wektory lentiwirusowe są popularne w badaniach nad terapią genową, ponieważ zapewniają stabilną, długoterminową ekspresję w populacjach neuronów13,14,15,16,17,18,19. Jednak tradycyjnie pakowane wektory lentiwirusowe mogą mieć ograniczony transport wsteczny i mogą wywoływać odpowiedź układu odpornościowego, gdy są stosowane in vivo4,20,21. Wysoce wydajny wektor transportu wstecznego, określany jako HiRet, został opracowany przez Kato i wsp. poprzez modyfikację otoczki wirusa za pomocą glikoproteiny wirusa wścieklizny w celu stworzenia wektora hybrydowego, który poprawia transport wsteczny22,23.
Śledzenie wsteczne wprowadza wektor do przestrzeni synaptycznej docelowego neuronu, umożliwiając jego przejęcie przez akson komórki i przetransportowanie do ciała komórki. Wykazano skuteczny transport HiRet z synaps neuronalnych do mózgów myszy i naczelnych23,24 oraz z mięśni do neuronów ruchowych22. Protokół ten demonstruje wstrzyknięcie do lędźwiowego rdzenia kręgowego, w szczególności ukierunkowanego na zakończenia synaptyczne interneuronów propriordzeniowych i neuronów pnia mózgu. PN otrzymują połączenia z wielu różnych ścieżek rdzeniowych i dlatego mogą być wykorzystywane do celowania w różnorodną populację neuronów w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu. Oznaczone neurony w tym badaniu reprezentują obwody unerwiające pule neuronów ruchowych związane z funkcją motoryczną kończyn tylnych. Solidne oznakowanie jest widoczne w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu, w tym szczegóły o wysokiej wierności trzpieni dendrytycznych i zakończeń aksonów. Zastosowaliśmy również tę metodę w poprzednich badaniach w obrębie rdzenia kręgowego szyjnego do oznaczania ścieżek siateczkowo-rdzeniowych propriordzeniowych i pnia mózgu25.
Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wektora wirusowego do rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego szczura. Jak widać na filmie 1, nacięcie jest celem poprzez identyfikację kręgu L1 znajdującego się na ostatnim żebrze. Jest to używany jako punkt orientacyjny ogona dla 3-4 cm nacięcia, które odsłania mięśnie nad rdzeniem kręgowym L1-L4. Wykonuje się laminektomię grzbietowych aspektów kręgów T11-T13, a ściętą szklaną igłę kieruje się 0,8 mm w bok od linii środkowej i opuszcza na głębokość 1,5 mm w głąb istoty szarej w celu wstrzyknięcia wirusa.

<table><tbody><tr><td>#10 Ostrza skalpela</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-10</td><td>Do użytku ze skalpelem.</td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>Do znieczulającego wstrzykiwania IP, potencjalnych zastrzyków przypominających znieczulanie i zastrzyków z antybiotykiem.</td></tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309604</td><td>Do wstrzykiwania soli fizjologicznej zwierzęciu, po operacji.</td></tr><tr><td>4.0 Chromowy szew katgutowy</td><td>DemeTECH</td><td>NN374-16</td><td>Do ponownego wiązania mięśni podczas zamykania.</td></tr><tr><td>48000 Beveler do mikropipet</td><td>World Precision Instruments</td><td>32416</td><td>Służy do ukosowania końcówek ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w celu utworzenia funkcjonalnych szklanych igieł.</td></tr><tr><td>5% roztwór jodu Purdue</td><td>Products L.P.</td><td>L01020-08</td><td>Do stosowania w sterylizacji pola operacyjnego.</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do sterylizacji nowo przygotowanych igieł szklanych, modeli zwierzęcych podczas przygotowania chirurgicznego i rąk chirurga podczas operacji, a także wszystkich innych drobnych czynności związanych z utrzymaniem sterylności.</td></tr><tr><td>Środek znieczulający (roztwór ketaminy/ksylazyny)</td> <td>Zoetis</td><td>240048</td><td>Do utrzymywania zwierzęcia w prawidłowej płaszczyźnie świadomości podczas operacji.</td></tr><tr><td>Antybiotyk (Cefazolin)</td><td>West-Ward Pharmaceuticals</td><td>NPC 0143-9924-90</td><td>Do wstrzykiwania podskórnego w celu zapobiegania infekcji po operacji.</td></tr><tr><td>Sterylizator koralików</td><td>CellPoint</td><td>5-1450</td><td>Do sterylizacji na gorąco narzędzi chirurgicznych.</td></tr><tr><td>Bonewax</td><td>Fine Science Tools</td><td>19009-00</td><td>Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości.</td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td>Do uszczelniania wszelkich tętnic lub żył przerwanych podczas operacji, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi.</td></tr><tr><td>Waga cyfrowa</td><td>Okaus</td><td>REV.005</td><td>Do ważenia zwierzęcia podczas przygotowania chirurgicznego.</td></tr><tr><td>Elastyczna nasadka do igieł</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Do czyszczenia szklanych igieł i ładowania czerwonego oleju do szklanych igieł.</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pfizer</td><td>H68079</td><td>Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości.</td></tr><tr><td>Szklane rurki kapilarne</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>Do ciągniętych szklanych igieł - powinny być przeznaczone do wtryskiwaczy nanolitrowych.</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>Oster</td><td>111038-060-000</td><td>Do oczyszczania miejsca operowanego z włosów.</td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Roboz</td><td>RS-7231</td><td>Do ogólnego użytku w chirurgii.</td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>Kimtech Kimtech</td><td>34155</td><td>Do ogólnego stosowania w chirurgii.</td></tr><tr><td>Kleszczyki zakrzywione średniego punktu</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>Do ogólnego użytku w chirurgii.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator ze skalą noniuszową</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td>Do precyzyjnego celowania podczas operacji.</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>Do wycinania szklanych szeptów ze świeżo wyciągniętych szklanych rurek kapilarnych.</td></tr><tr><td>Mikroskop ze skalą światła i noniusza Ocular</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>N/A</td><td>Służy do wizualizacji i pomiaru ukosowania ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w funkcjonalne szklane igły.</td></tr><tr><td>Sterownik pompy mikrostrzykawkowej</td><td>World Precision Instruments</td><td>62403</td><td>Do kontrolowania szybkości wtrysku.</td></tr><tr><td>Nanolitr 2000 Pompa Head Injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>500150</td><td>Do ładowania i wstrzykiwania wirusa w kontrolowany sposób.</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>Do podgrzewania i rozsuwania szklanych kapilar w celu uformowania szklanych igieł.</td></tr><tr><td>Maść oftalamowa</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>RAC 0119</td><td>W celu ochrony oczu zwierzęcia podczas operacji.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Aby pomóc w ładowaniu wirusa do nanowtryskiwacza.</td></tr><tr><td>Igły PrecisionGlide (25G x 5/8)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Do stosowania ze strzykawkami 1 ml i 10 ml, aby umożliwić wstrzyknięcie modelu zwierzęcego.</td></tr><tr><td>Kleszczyki do zębów szczurów</td><td>Roboz</td><td>RS-5152</td><td>Do chwytania wyrostków kolczystych.</td></tr><tr><td>Red Oil</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aby zapewnić front do wizualizacji wirusa wnikającego do tkanki podczas wstrzyknięcia.</td></tr><tr><td>Retraktory</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej.</td></tr><tr><td>Rimadyl Tablets</td><td>Bio Serv</td><td>MP275-050</td><td>Do leczenia bólu po operacji.</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>Do usuwania mięśni z kręgosłupa podczas operacji.</td></tr><tr><td>Rękojeść ostrza skalpela</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Do rozcinania skóry i poduszeczki tłuszczowej modelu zwierzęcego podczas operacji.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>Do ogólnego użytku w chirurgii.</td></tr><tr><td>Klipsy do ran ze stali nierdzewnej</td><td>CellPoint</td><td>201-1000</td><td>Do wiązania skóry rany chirurgicznej podczas zamykania.</td></tr><tr><td>Kleszcze do usuwania zszywek</td><td>Kent Scientific INS750347</td><td></td><td>Aby usunąć zszywki, jeśli zostały nałożone nieprawidłowo.</td></tr><tr><td>Sterylna tkanina</td><td>Phenix Research Products</td><td>BP-989</td><td>Aby zapewnić sterylną powierzchnię do operacji.</td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Do wchłaniania krwi w ranie pooperacyjnej przy jednoczesnym zachowaniu sterylności.</td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>Do czyszczenia obszaru operacyjnego i narzędzi chirurgicznych przy zachowaniu sterylności.</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>281324</td><td>Do stosowania w oczyszczaniu krwi i do uzupełniania płynów po operacji.</td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do użytku przez chirurga w celu utrzymania sterylnego pola podczas operacji.</td></tr><tr><td>Chirurgiczna poduszka grzewcza</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do utrzymywania temperatury ciała modelu zwierzęcego podczas operacji.</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dla lepszej wizualizacji rany pooperacyjnej.</td></tr><tr><td>Zszywacz chirurgiczny</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750546</td><td>Do nakładania zszywek.</td></tr><tr><td>T / Pump Pompa wodna do terapii cieplnej</td><td>Gaymar</td><td>TP500C</td><td>Do pompowania ciepłej wody do konwekcyjnej podkładki grzewczej.</td></tr><tr><td>Podkładka do podgrzewania konwekcji wodnej</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>L1K018</td><td>Do stosowania w obszarze rekonwalescencji pooperacyjnej w celu utrzymania temperatury ciała nieprzytomnego zwierzęcia.</td></tr><tr><td>Haki obciążeniowe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej.</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Wprowadzanie interesujących białek do komórek w układzie nerwowym jest wyzwaniem ze względu na wrodzone bariery biologiczne, które ograniczają dostęp do większości molekuł. Wstrzyknięcie bezpośrednio do tkanki rdzenia kręgowego omija te bariery, zapewniając dostęp do ciał komórkowych lub synaps, w których mogą być włączane cząsteczki. Połączenie technologii wektorów wirusowych z tą metodą pozwala na wprowadzenie docelowych genów do tkanki nerwowej w celu terapii genowej lub śledzenia dróg oddechowych. W tym przypadku wirus zaprojektowany do wysoce wydajnego transportu wstecznego (HiRet) jest wprowadzany do synaps interneuronów propriordzeniowych (PN), aby stymulować specyficzny transport do neuronów w rdzeniu kręgowym i jądrach pnia mózgu. Celowanie w PN wykorzystuje liczne połączenia, które otrzymują ze ścieżek motorycznych, takich jak drogi rubrordzeniowe i siateczkowo-rdzeniowe, a także ich wzajemne połączenia w różnych segmentach rdzenia kręgowego. Reprezentatywne śledzenie przy użyciu wektora HiRet z konstytutywnie aktywnym białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wykazało wysoką wierność szczegółów ciał komórkowych, aksonów i trzpieni dendrytycznych w PN klatki piersiowej oraz w neuronach siateczkowo-rdzeniowych w formacji siatkowatej mostu. HiRet dobrze integruje się ze szlakami pnia mózgu i PN, ale wykazuje zależną od wieku integrację z neuronami dróg korowo-rdzeniowych. Podsumowując, iniekcja do rdzenia kręgowego za pomocą wektorów wirusowych jest odpowiednią metodą wprowadzania interesujących białek do neuronów docelowych szlaków.

Prawidłowe wstrzyknięcie i transport wektora wirusowego powinno prowadzić do transdukcji znacznej populacji neuronów jednostronnych w rdzeniu kręgowym oraz w niektórych jądrach pnia mózgu. Rysunek 1 przedstawia stereotypowe znakowanie neuronów i aksonów w piersiowym odcinku rdzenia kręgowego oraz w formacji siateczkowej mostu w pniu mózgu w czwartym tygodniu po wstrzyknięciu. Wyraźna ekspresja GFP jest widoczna w neuronach istoty szarej piersiowego odcinka rdzenia kręgowe...

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Wektory wirusowe mogą wprowadzać materiał genetyczny do komórek, aby skompensować wadliwe geny, zwiększyć regulację ważnych białek wzrostu lub wytworzyć markery, które mogą śledzić obwody neuronalne. Wprowadzenie wektorów wirusowych do układu nerwowego jest trudne ze względu na wrodzone bariery biologiczne. Bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanki rdzenia kręgowego omija te bariery, umożliwiając dostęp do ciał komórkowych lub synaps.Prawidłowe ukierunkowanie na poziomy kręgosłupa od L1 do L4 może być trudne. Ważne jest, aby używać punktów orientacyjnych do weryfikacji celu i pamiętać, że te segmenty łączą się z kręgami od T11 do T13. W dniu zabiegu należy podłączyć wtryskiwacz do mikropompy i umieścić mikropompkę w mikromanipulatorze ze skalą noniuszową.Za pomocą strzykawki z elastyczną igłą ostrożnie załaduj kolorowy barwnik do jednej ze szklanych igieł i włóż szklaną igłę do wstrzykiwacza. Następnie upewnij się, że igła jest prawidłowo wsunięta w podkładki i że nasadka wtryskiwacza jest mocno dokręcona oraz że stalowa igła wtryskiwacza jest wysunięta na około trzy czwarte długości szklanej igły. Przed rozpoczęciem zabiegu należy rozmrozić co najmniej jeden mikrolitr plus niewielką objętość dodatkowego wirusa na wstrzyknięcie z zamrażarki i potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego szczura.Gol się wzdłuż grzbietowej linii środkowej od bioder do dolnego kąta łopatek zwierzęcia, napinając skórę, aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne golenie, a następnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą sekwencyjnych peelingów 5% jodu i 70% etanolu. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy. Następnie umieść zwierzę na sterylnej szmatce i umieść gazę pod pęcherzem, aby zebrać mocz.Aby zidentyfikować miejsce nacięcia skóry, delikatnie dociśnij palce do ostatniego żebra, aby zlokalizować kręg L1. Używając tego kręgu jako punktu orientacyjnego i utrzymując napiętą skórę poprzez delikatne rozprowadzanie, jednocześnie mocno naciskając skalpelem, użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby wykonać trzy- do czterocentymetrowe nacięcie skóry kończące się tuż poniżej L1, aby odsłonić mięsień. Użyj kleszczy i nożyczek, aby wyczuć wyrostki kolczyste.Wykonaj małe nacięcia rostralne, aby zapewnić miejsce na bezpieczne uchwycenie górnego wyrostka za pomocą kleszczy do zębów szczura. I wykonaj dwa długie, głębokie nacięcia jak najbliżej procesów. Po zabezpieczeniu mięśni bocznych na miejscu, oczyść mięśnie wokół wyrostków, aby określić kształt ich głów.Następnie wizualizuj kształty głów wyrostków kolczystych, aby zidentyfikować miejsce laminektomii. T11 i łączące się procesy T12 i T13 będą miejscem laminektomii. Po prawidłowym zidentyfikowaniu obszaru docelowego delikatnie rozłóż kręgi, aby odsłonić więzadła międzykręgowe, i użyj rongeurs, aby pobrać małe kęsy wyrostków kolczystych i grzbietowej części kręgów.Oczyść kość z dala od linii środkowej, aby można było zaobserwować naczynie krwionośne w linii środkowej, pozostawiając okno, które wyraźnie odsłania tkankę rdzenia kręgowego i jest wolne od zanieczyszczeń. Następnie przymocuj kleszcze stabilizujące do wyrostków kolczystych, rostralne i ogonowe do okna laminektomii, aby zabezpieczyć zwierzę w uchwycie kręgosłupa. I podnieś brzuch zwierzęcia, aby zniwelować efekt ruchów oddechowych.Aby załadować wirusa do wstrzykiwacza, należy odpipetować około pięciu mikrolitrów rozmrożonego materiału na kawałek Parafilmu i ustawić szklane igły tak, aby końcówka znajdowała się wewnątrz kropli. Użyj mikropompy, aby pobrać do czterech mikrolitrów wirusa z szybkością od 20 do 100 nanolitrów na sekundę i ustaw kontroler tak, aby wstrzykiwał przed uwolnieniem niewielkiej ilości wirusa z końcówki igły, aby upewnić się, że nie jest zablokowany. Zetrzyj nadmiar wirusa chusteczką laboratoryjną i ustaw mikromanipulatory tak, aby widoczna była łuska noniusza.Umieść igłę na linii środkowej rdzenia kręgowego i użyj skali noniusza na mikromanipulatorze, aby skierować igłę na boki o 0,8 milimetra. Następnie opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż wbije się, ale nie nakłuje opony twardej i użyj szybkiego ruchu skręcającego, aby nakłuć oponę twardą igłą, aż końcówka igły zapadnie się na głębokość 1,5 milimetra. Gdy igła znajdzie się na miejscu, zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby dostarczał wirusa z szybkością 400 nanolitrów na minutę i potwierdź, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika.Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na dwie do pięciu minut, aby ułatwić dyfuzję wirusa, a następnie powoli wycofać igłę w celu umieszczenia w następnym miejscu wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy wyjąć zwierzę z uchwytu kręgosłupa, aby umożliwić usunięcie wszelkich urządzeń używanych do rozszerzania mięśni bocznych. Następnie zamknij mięsień chromowym szwem katgutowym 4,0 i zszyj skórę dziewięciomilimetrowymi klipsami.Cztery tygodnie po udanym wstrzyknięciu obserwuje się znaczną ekspresję GFP w neuronach w istocie szarej piersiowego rdzenia kręgowego po boku, ipsilateralnie w stosunku do wstrzyknięcia. W istocie białej ekspresję GFP obserwuje się w aksonach rdzenia ipsilateralnego, zwłaszcza w obszarach typowych dla aksonów propriordzeniowych. Większe powiększenie neuronów istoty szarej ujawnia przykład typowej ekspresji sygnału w ciałach komórek neuronalnych i dendrytach.Ekspresję GFP w neuronach można również zaobserwować w jądrach pnia mózgu, na przykład w obrębie formacji siatkowatej mostu. Kluczowymi czynnikami udanego zabiegu wstrzyknięcia rdzenia kręgowego są prawidłowe ukierunkowanie na kręgi i zapewnienie, że wirus dostaje się do tkanki Jeśli uraz rdzenia kręgowego rostralnego zostanie wykonany przed tą procedurą, bezpośrednie wstrzyknięcie może być wykorzystane do śledzenia neuronów, które przywracają połączenia wokół urazu.

direct-injection-lentiviral-vector-highlights-multiple-motor-pathways

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Smit, R. D., et al. Celowanie w przewód korowo-rdzeniowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura. Protokół umożliwia precyzyjną ekspresję genów za pomocą następczych i wstecznych iniekcji wirusowych, ułatwiając badania nad regeneracją i plastycznością neuronów po urazie...

Ukierunkowane dostarczanie wirusa do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura w celu zbadania urazu rdzenia kręgowego

Ten film pokazuje proces wstrzykiwania wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania choroby Parkinsona. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, mikrowstrzyknięcia wektora wirusowego do istoty czarnej oraz procedury odzyskiwania.

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania chorób neurodegeneracyjnych

Źródło: Keefe, KM i wsp. Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwypukla wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wstrzyknięcie wysoce wydajnego wektora wirusowego transportu wstecznego (HiRet) do rdzenia kręgowego szczura w celu śledzenia ścieżek neuronalnych. Wirus ma glikoproteiny do wnikania synaptycznego i gen kodujący białka fluorescencyjne. Igłę wprowadza się do rdzenia kręgowego, a zawiesinę wirusa podaje się w...

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do rdzenia kręgowego szczura w celu wstecznego śledzenia neuronów

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Ten artykuł ma na celu przedstawienie metodologii transgenezy lentiwirusowej w zarodkach szczurów przy użyciu wielokrotnych wstrzyknięć zawiesiny wirusa do przestrzeni zygoty periviteliny. Samice szczurów, które są kojarzone płodnym szczepem samców o innym dominującym kolorze futra, są wykorzystywane do generowania pseudociężarnych matek zastępczych.

Wytwarzanie transgenicznych szczurów przy użyciu podejścia wektora lentiwirusowego

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Poznaj metodę bezpośredniego wstrzyknięcia wektora lentiwirusowego do rdzenia kręgowego szczura, umożliwiającą retrogradne śledzenie obwodów nerwowych. Technika ta wspiera badania nad terapią genową i łącznością neuronalną.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Przeglądaj więcej filmów