Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura
15 marca 2019
Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.
Wektory wirusowe mogą wprowadzać materiał genetyczny do komórek, aby skompensować wadliwe geny, zwiększyć regulację ważnych białek wzrostu lub wytworzyć markery, które mogą śledzić obwody neuronalne. Wprowadzenie wektorów wirusowych do układu nerwowego jest trudne ze względu na wrodzone bariery biologiczne. Bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanki rdzenia kręgowego omija te bariery, umożliwiając dostęp do ciał komórkowych lub synaps.
Prawidłowe ukierunkowanie na poziomy kręgosłupa od L1 do L4 może być trudne. Ważne jest, aby używać punktów orientacyjnych do weryfikacji celu i pamiętać, że te segmenty łączą się z kręgami od T11 do T13. W dniu zabiegu należy podłączyć wtryskiwacz do mikropompy i umieścić mikropompkę w mikromanipulatorze ze skalą noniuszową.
Za pomocą strzykawki z elastyczną igłą ostrożnie załaduj kolorowy barwnik do jednej ze szklanych igieł i włóż szklaną igłę do wstrzykiwacza. Następnie upewnij się, że igła jest prawidłowo wsunięta w podkładki i że nasadka wtryskiwacza jest mocno dokręcona oraz że stalowa igła wtryskiwacza jest wysunięta na około trzy czwarte długości szklanej igły. Przed rozpoczęciem zabiegu należy rozmrozić co najmniej jeden mikrolitr plus niewielką objętość dodatkowego wirusa na wstrzyknięcie z zamrażarki i potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego szczura.
Gol się wzdłuż grzbietowej linii środkowej od bioder do dolnego kąta łopatek zwierzęcia, napinając skórę, aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne golenie, a następnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą sekwencyjnych peelingów 5% jodu i 70% etanolu. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy. Następnie umieść zwierzę na sterylnej szmatce i umieść gazę pod pęcherzem, aby zebrać mocz.
Aby zidentyfikować miejsce nacięcia skóry, delikatnie dociśnij palce do ostatniego żebra, aby zlokalizować kręg L1. Używając tego kręgu jako punktu orientacyjnego i utrzymując napiętą skórę poprzez delikatne rozprowadzanie, jednocześnie mocno naciskając skalpelem, użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby wykonać trzy- do czterocentymetrowe nacięcie skóry kończące się tuż poniżej L1, aby odsłonić mięsień. Użyj kleszczy i nożyczek, aby wyczuć wyrostki kolczyste.
Wykonaj małe nacięcia rostralne, aby zapewnić miejsce na bezpieczne uchwycenie górnego wyrostka za pomocą kleszczy do zębów szczura. I wykonaj dwa długie, głębokie nacięcia jak najbliżej procesów. Po zabezpieczeniu mięśni bocznych na miejscu, oczyść mięśnie wokół wyrostków, aby określić kształt ich głów.
Następnie wizualizuj kształty głów wyrostków kolczystych, aby zidentyfikować miejsce laminektomii. T11 i łączące się procesy T12 i T13 będą miejscem laminektomii. Po prawidłowym zidentyfikowaniu obszaru docelowego delikatnie rozłóż kręgi, aby odsłonić więzadła międzykręgowe, i użyj rongeurs, aby pobrać małe kęsy wyrostków kolczystych i grzbietowej części kręgów.
Oczyść kość z dala od linii środkowej, aby można było zaobserwować naczynie krwionośne w linii środkowej, pozostawiając okno, które wyraźnie odsłania tkankę rdzenia kręgowego i jest wolne od zanieczyszczeń. Następnie przymocuj kleszcze stabilizujące do wyrostków kolczystych, rostralne i ogonowe do okna laminektomii, aby zabezpieczyć zwierzę w uchwycie kręgosłupa. I podnieś brzuch zwierzęcia, aby zniwelować efekt ruchów oddechowych.
Aby załadować wirusa do wstrzykiwacza, należy odpipetować około pięciu mikrolitrów rozmrożonego materiału na kawałek Parafilmu i ustawić szklane igły tak, aby końcówka znajdowała się wewnątrz kropli. Użyj mikropompy, aby pobrać do czterech mikrolitrów wirusa z szybkością od 20 do 100 nanolitrów na sekundę i ustaw kontroler tak, aby wstrzykiwał przed uwolnieniem niewielkiej ilości wirusa z końcówki igły, aby upewnić się, że nie jest zablokowany. Zetrzyj nadmiar wirusa chusteczką laboratoryjną i ustaw mikromanipulatory tak, aby widoczna była łuska noniusza.
Umieść igłę na linii środkowej rdzenia kręgowego i użyj skali noniusza na mikromanipulatorze, aby skierować igłę na boki o 0,8 milimetra. Następnie opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż wbije się, ale nie nakłuje opony twardej i użyj szybkiego ruchu skręcającego, aby nakłuć oponę twardą igłą, aż końcówka igły zapadnie się na głębokość 1,5 milimetra. Gdy igła znajdzie się na miejscu, zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby dostarczał wirusa z szybkością 400 nanolitrów na minutę i potwierdź, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika.
Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na dwie do pięciu minut, aby ułatwić dyfuzję wirusa, a następnie powoli wycofać igłę w celu umieszczenia w następnym miejscu wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy wyjąć zwierzę z uchwytu kręgosłupa, aby umożliwić usunięcie wszelkich urządzeń używanych do rozszerzania mięśni bocznych. Następnie zamknij mięsień chromowym szwem katgutowym 4,0 i zszyj skórę dziewięciomilimetrowymi klipsami.
Cztery tygodnie po udanym wstrzyknięciu obserwuje się znaczną ekspresję GFP w neuronach w istocie szarej piersiowego rdzenia kręgowego po boku, ipsilateralnie w stosunku do wstrzyknięcia. W istocie białej ekspresję GFP obserwuje się w aksonach rdzenia ipsilateralnego, zwłaszcza w obszarach typowych dla aksonów propriordzeniowych. Większe powiększenie neuronów istoty szarej ujawnia przykład typowej ekspresji sygnału w ciałach komórek neuronalnych i dendrytach.
Ekspresję GFP w neuronach można również zaobserwować w jądrach pnia mózgu, na przykład w obrębie formacji siatkowatej mostu. Kluczowymi czynnikami udanego zabiegu wstrzyknięcia rdzenia kręgowego są prawidłowe ukierunkowanie na kręgi i zapewnienie, że wirus dostaje się do tkanki Jeśli uraz rdzenia kręgowego rostralnego zostanie wykonany przed tą procedurą, bezpośrednie wstrzyknięcie może być wykorzystane do śledzenia neuronów, które przywracają połączenia wokół urazu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie retrogradalnie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura, umożliwiając śledzenie obwodów neuronalnych i potencjalne zastosowania terapii genowej. Procedura pozwala na przyjęcie wektora w synapsie i transport do ciała komórki docelowych neuronów, ułatwiając wgląd w drogi rdzeniowe.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Terapia genowa
- Neuroanatomia
Wprowadzenie
- Wektory wirusowe mogą kompensować uszkodzone geny i wprowadzać materiał genetyczny do komórek.
- Bezpośrednie wstrzyknięcie do rdzenia kręgowego omija bariery biologiczne dla skutecznego celowania.
- Poprawne celowanie w poziomy kręgowe ma kluczowe znaczenie dla pomyślnych rezultatów.
- Punkty orientacyjne, takie jak kręgi, pomagają w podejściu chirurgicznym.
Cel Badań
- Dostarczenie szczegółowego protokołu wstrzykiwania wektorów wirusowych do rdzenia kręgowego.
- Umożliwienie retrogradowego śledzenia dróg rdzeniowych.
- Ułatwienie badań nad zastosowaniami terapii genowej.
Wykorzystane Metody
- Protokół obejmuje chirurgiczne wstrzyknięcie bezpośrednio do rdzenia kręgowego szczura.
- Obszar docelowy obejmuje poziomy kręgowe L1 do L4, wykorzystując punkty orientacyjne dla dokładnego celowania.
- Szczegółowo opisano ostrożne podawanie wektorów wirusowych z określonymi ramami czasowymi dla wstrzyknięcia i monitorowania.
- Obserwacje po wstrzyknięciu koncentrują się na ekspresji GFP w neuronach.
Główne Wyniki
- Pomyślne wstrzyknięcie prowadzi do znaczącej ekspresji GFP w sąsiednich neuronach i aksonach.
- Ujawnione drogi neuronalne demonstrują skuteczność retrogradowego transportu wektora wirusowego.
- Wzorce ekspresji GFP wskazują na udane celowanie i pobieranie w odcinku piersiowym rdzenia kręgowego.
- Wnioski podkreślają znaczenie dokładnego celowania w kręgi dla pomyślnych zastosowań.
Wnioski
- Badanie to dostarcza niezawodnej metodologii do wstrzykiwania wektorów wirusowych do rdzenia kręgowego.
- Procedura pogłębia nasze zrozumienie neuronalnych połączeń i potencjalnych strategii terapii genowej.
- Ma znaczenie dla śledzenia obwodów neuronalnych i celowania w określone populacje neuronów.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Direct spinal cord injection of lentiviral vectors enables targeted delivery of genetic material to specific neuronal populations, bypassing biological barriers that limit systemic approaches. This method supports mechanistic de-risking in target validation by allowing precise tracing of motor pathways such as rubrospinal and reticulospinal tracts. The approach provides predictive confidence in preclinical models by revealing neuronal connectivity patterns relevant to motor circuit function and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing specific spinal motor pathways and their interconnections.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation through retrograde transport of viral vectors to neuronal cell bodies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying pathway engagement and neuronal uptake efficiency in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining neuronal targets with high anatomical fidelity.
- Operational Value: Ensures assay standardization through consistent viral delivery to propriospinal interneurons and brainstem nuclei.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across spinal cord segments and injury models for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates continuity from discovery to preclinical validation by mapping GFP expression in thoracic spinal cord and pontine reticular formation.
- Mechanistic De-risking: Highlights age-dependent integration patterns that inform risk-adjusted advancement decisions in neurodegenerative models.
- Predictive Confidence: Supports biomarker alignment by identifying neuronal populations that reestablish connections post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, particularly for motor circuit disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling retrograde tracing of spinal pathways to clarify motor circuit architecture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized viral injection and quantitative GFP expression readouts in defined neuronal populations.
- Analytics: Provides quantitative measurements of transduction efficiency and axonal transport that help compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracing neurons that reestablish connections around injury sites, informing repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for spinal cord targeting across multiple disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal motor pathway engagement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through landmark-based targeting and controlled viral delivery parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of targets involved in motor circuit function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on neuronal uptake patterns and pathway-specific transduction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent spinal surgery and microsurgical techniques for accurate vertebral targeting.
- Depends on microsyringe pumps, micromanipulators with vernier scales, and sterile surgical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of viral titer, injection volume, and post-operative monitoring protocols.
- Involves adaptation considerations across rodent ages and injury models due to observed age-dependent integration into corticospinal tracts.
- Limited by the need for precise dorsal laminectomy and spinal stabilization to avoid tissue damage during needle insertion.
