Ekspresja, solubilizacja detergentu i oczyszczanie transportera błonowego, białka oporności wielolekowej MexB

W celu oczyszczenia białka błonowego Mex B, Mex B jest najpierw wyrażany w E. coli przy użyciu metod rekombinacji DNA. Następnie błony są izolowane, a białka błonowe są rozpuszczane w łagodnym detergencie. Rozpuszczone białko błonowe jest oczyszczane za pomocą iMaca, a białko jest dalej oczyszczane za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.

Poziom oczyszczenia białka określa się za pomocą elektroforezy w żelu poli AKRYLAMIDOWYM SDS. Chociaż procedura ta może dostarczyć informacji na temat transbłonowych transporterów oporności wielolekowej, można ją również zastosować do innych białek błonowych, pokazując, że dzisiejsze procedury zostaną opracowane przez doktoranta z mojego laboratorium W tej procedurze Mex B z pseudomonas Aosa zostanie sklonowany do wektora ekspresyjnego PET 30 B plus, tak aby Mex B uległ ekspresji za pomocą końcowego znacznika histaminy HEXA C. Zacznij wieczorem od zaszczepienia czterech trzymililitrowych kultur micyny w puszce świeżymi transformantami lub użyj zamrożonego bulionu, hoduj kultury na walcu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc rano.

Użyj kultur nocnych do zaszczepienia 150 mililitrów LB zawierających 30 mikrogramów na mililitr. Czy Mycin może wyhodować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na shakerze po południu? Użyj małej kultury do zaszczepienia sześć razy po jednym litrze, dwóch pożywkach XYT zawierających 30 mikrogramów na mililitr.

Czy mycyna może w kolbach paproci? Użyj 25 mililitrów na kulturę w rozcieńczeniu od jednego do 40. Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną gęstość optyczną.

600 od 0,4 do 0,6, około 1,5 godziny. Gdy kultury osiągną odpowiednią gęstość, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mililitra jednego zęba trzonowego. Protokół IPTG. Włóż wszystkie kolby z powrotem do wytrząsarki i kontynuuj ich uprawę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc, aż do zebrania bakterii następnego ranka.

Wyjmij kultury z shakera i schłodź je. Następnie, aby zebrać komórki, przenieś kultury do probówek wirówkowych i odwiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut przy 5 000 obrotów na minutę w wirówce na dużą skalę, podczas gdy komórki wirują. Uzupełnij 100 mililitrów buforu zawiesinowego komórek w DNA, inhibitory proteazy i lizozym.

Uzupełnij również dwie podwielokrotności błonowego buforu zawiesinowego Resus inhibitorami proteazy, jak pokazano w tej tabeli. Trzymaj wszystkie trzy roztwory na lodzie po zakończeniu wirowania. Resus wydaje granulki komórek w 100 mililitrach bufora zawiesiny resus komórek.

Następnie wyodrębnij komórki. Zawiesina ogniwa jest ładowana do francuskiej komory ciśnieniowej, a komórka jest umieszczana na prasie francuskiej. Ciśnienie jest stosowane, aż osiągnie 12 000 funtów na cal kwadratowy.

Zawór jest otwierany w bardzo małej ilości, aby uszkodzone komórki wyciekały. Ważne jest, aby nie otwierać zaworu zbyt mocno i nie pozwolić ogniwom wytrysnąć, ponieważ zostaną one uwolnione przy zbyt małym ciśnieniu i nie zostaną skutecznie złamane. Zbierz lizat komórkowy do butelki, trzymanej w chłodzie na lodzie.

Przepuść roztwór komórkowy ponownie przez francuską celę ciśnieniową o temperaturze 12 000 funtów na cal kwadratowy. Przenieś lizat komórkowy do probówek wirówkowych SS 34 i odwiruj w celu usunięcia resztek komórek z prędkością 10 000 obrotów na minutę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirniku SS 34. Następny jest oczyszczony lizat.

Służy do przygotowania frakcji membranowej. Ostrożnie przenieś supinat do ti. 6 4, 7 0,5 ultra probówek wirówkowych, wirować w wirniku TI 6 4 7 0,5 z prędkością 40 000 obrotów na minutę przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzuć supinat. Za pomocą pipety delikatnie zawiesić osad, który zawiera błony komórkowe w około 25 mililitrach membranowego buforu zawiesiny Resus, przenieść zawiesinę membrany do czystej probówki wirówkowej i odwirować przyrost w wirniku TI I 6 4 7 0,5 o prędkości 40 000 obrotów na minutę przez 50 minut w czterech stopniach Celsjusza i ponownie zawiesić przemytą paletę membran w 25 mililitrach membranowego bufora zawiesinowego Reus. Następnie rozpuść białka błonowe do zawieszonych błon w ilości około 25 mililitrów.

Dodać sześć mililitrów 10% DDM, tak aby końcowe stężenie detergentu wynosiło 2%DDM, rozdrabniać mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny po dwugodzinnej inkubacji w obecności wirówki DDM, mieszaninę z prędkością 40 000 obrotów na minutę przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirniku TI I 6 4 7 0,5. W celu oddzielenia rozpuszczalnych kompleksów detergentów białkowych od białek nierozpuszczalnych. Zachowaj natant leżący na wznak, który zawiera kompleksy detergentów białkowych Mex B do użycia w oczyszczaniu, wymieszaj natant leżący zawierający kompleksy detergentów białkowych Mex B z dwoma mililitrami kulek powinowactwa do metalu lon, zrównoważonych w zawiesinie Resus Bufor inkubować przez godzinę na walcu w temperaturze czterech stopni Celsjusza po związaniu białek z żywicą.

Wlej gnojowicę do korpusu kolumny przepływu grawitacyjnego i wylej przepływ. Umyj kolumnę 20 mililitrami lub 10 objętościami kolumn oprawy iMac i buforem myjącym po zakończeniu mycia kolumny. Eluować związane białka za pomocą 10 mililitrów buforu elucyjnego iMac.

Pobrać 10 mikrolitrów próbek każdej frakcji elucyjnej. Wymieszaj z 10 mikrolitrami dwukrotnej próbki SDS, buforuj i analizuj na 10% poliakrylamidzie. Żel SDS.

Oszacuj ilość i czystość mex B w każdej frakcji. Pobrać frakcje zawierające kompleksy detergentów białkowych Mex B i skoncentrować je w koncentratorze wirowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uważaj, aby białko nie wytrąciło się na tym etapie.

Użyj kilku krótkich obrotów i obserwuj opady. Po każdym wirowaniu przystąp do oczyszczania zebranych frakcji za pomocą żelowej kolumny filtracyjnej. Wstępnie zrównoważ kolumnę super rose 12 HL 30 over 10 z 24 mililitrami bufora roboczego i poczekaj na płaską linię bazową.

Następnie przepłucz pętlę ładowania systemu aktora za pomocą uruchomionego bufora. Przed nałożeniem białka na kolumnę należy przefiltrować roztwór białka za pomocą filtra strzykawkowego. Następnie załaduj do 240 mikrolitrów roztworu białkowego na kolumnę z białkiem do pięciu miligramów na mililitr.

Uruchom 1,5 kolumny buforu i zbierz ułamki o wielkości 0,25 mililitra. Kompleksy detergentów białkowych XB eluują się w postaci piku przy około 10 do 15 mililitrach objętości elucji. Pobrać pięć mikrolitrów próbek frakcji szczytowych.

Wymieszaj każdą próbkę jeden do jednego z dwukrotnie pomnożonym buforem próbki SDS. Przeanalizuj próbki na 10% żelu poliakrylamidowym, aby oszacować ilość i czystość me Mex B w każdej frakcji, wyciągnij frakcje zawierające czysty ME B. Ten żel poliakrylamidowy został załadowany frakcjami wyciągniętymi z kolumny iMac i pojedynczymi frakcjami z kolumny filtracyjnej żelu. Po żelowej kolumnie filtracyjnej białko wydaje się czyste na zabarwionym żelu z poliakryloamidu w kolorze kumasi.

Ślad z żelowej kolumny filtracyjnej pokazuje główny pik kompleksu detergentu białkowego eluującego z kolumny. Średnia wydajność białka mxb wynosi około dwóch miligramów na sześć litrów dwóch kultur XYT Po opanowaniu tej procedury można wykonać w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać rozpuszczalność i oczyszczać białko błonowe.