Ekspresja, solubilizacja w detergencie i oczyszczanie transportera błonowego – białka oporności wielolekowej MexB

Aby oczyścić białko błonowe Mex B, najpierw przeprowadza się ekspresję Mex B w e coli z wykorzystaniem metod rekombinacji DNA. Następnie izoluje się błony, a białka błonowe solubilizuje przy użyciu łagodnego detergentu. Solubilizowane białko błonowe jest oczyszczane za pomocą chromatografii iMac, a następnie poddawane dalszemu oczyszczaniu poprzez chromatografię filtracyjną żelową.

Poziom oczyszczenia białka jest określany za pomocą elektroforezy w żelach poliakrylamidowych SDS-PAGE. Chociaż procedura ta może dostarczyć informacji na temat transmembraneowych transporterów oporności wielolekowej, można ją zastosować również do innych białek błonowych. Procedury zaprezentowane dzisiaj zostaną wykonane przez doktoranta z mojego laboratorium. W tej procedurze białko Mex B z Pseudomonas aeruginosa zostanie subklonowane do wektora ekspresyjnego PET 30 B plus, aby Mex B było eksprymowane z C-końcowym tagiem histydynowym HEXA. Prace należy rozpocząć wieczorem od zaszczepienia czterech kultur LB z kanamycyną o objętości 3 mL świeżymi transformantami lub z wykorzystaniem zamrożonego materiału, a następnie inkubować kultury na walcaku w temperaturze 37 °C przez noc.

Wykorzystaj hodowle nocne do zaszczepienia 150 mililitrów pożywki LB zawierającej 30 mikrogramów na mililitr kanamycyny; inkubuj hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce przez popołudnie. Wykorzystaj tę małą hodowlę do zaszczepienia sześciu probówek o pojemności jednego litra każdej z pożywek XYT zawierających 30 mikrogramów na mililitr.

Czy można dodać mycyinę do kolb z paprocią? Użyć 25 mililitrów na kulturę dla rozcieńczenia 1:40. Hodować kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną odpowiednią gęstość optyczną.

600 z 0,4 do 0,6, około 1,5 godziny. Gdy hodowle osiągną odpowiednią gęstość, indukować ekspresję białka, dodając 0,5 mililitra roztworu jeden molarnego IPTG. Wszystkie kolby umieścić z powrotem w inkubatorze wytrząsowym i kontynuować ich wzrost w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc, aż do zbioru bakterii następnego ranka.

Wyjmij kultury z inkubatora z wytrząsaniem i schłodź je. Następnie, aby zebrać komórki, przenieś kultury do probówek wirówkowych i wiruj w temperaturze 4°C przez 30 minut przy 5 000 obr./min w wirówce o dużej pojemności. W czasie wirowania komórek uzupełnij 100 ml buforu do resuspensji komórek inhibitorami proteaz DNAs oraz lizozymem.

Należy również uzupełnić dwie alikwoty buforu do resuspensji membran o inhibitory proteaz, zgodnie z zamieszczoną tabelą. Po zakończeniu wirowania wszystkie trzy roztwory należy przechowywać w lodzie. Osady komórkowe resuspenderować w 100 mililitrach buforu do resuspensji komórek.

Następnie należy wyizolować komórki. Zawiesinę komórkową wprowadza się do komory ciśnieniowej French press, a następnie komorę umieszcza się w prasie. Ciśnienie jest zwiększane, aż osiągnie wartość 12 000 pounds per square inch.

Zawór otwiera się bardzo lekko, tak aby rozbite komórki powoli wyciekały. Ważne jest, aby nie otwierać zaworu zbyt szeroko i nie dopuścić do gwałtownego wypływu komórek, ponieważ zostaną one uwolnione przy zbyt niskim ciśnieniu, co uniemożliwi ich efektywne rozbicie. Lizat komórkowy należy zbierać do butelki utrzymywanej w niskiej temperaturze na lodzie.

Ponownie przepuść roztwór komórek przez prasę francuską pod ciśnieniem 12 000 psi. Przenieś lizat komórkowy do probówek wirówkowych SS 34 i wiruj w celu usunięcia szczątków komórkowych przy 10 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze 4 °C, używając rotora SS 34. Następnie otrzymany zostanie oczyszczony lizat.

Stosowane do przygotowania frakcji błonowej. Ostrożnie przenieś supernatant do probówek do ultrawirówki TI 6 4 7 0,5, odwiruj w rotorze TI 6 4 7 0,5 z prędkością 40 000 obr./min przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza.

Odciąć nadsącz. Za pomocą pipety delikatnie resuspender osad zawierający błony komórkowe w około 25 mililitrach buforu do resuspensji błon, przenieść zawiesinę błon do czystej probówki do wirowania i ponownie wirować w rotorze TI I 6 4 7 0.5 z prędkością 40 000 obr./min przez 50 minut w temperaturze 4 °C, a następnie resuspender przemyty osad błon w 25 mililitrach buforu do resuspensji błon. Następnie przeprowadzić solubilizację białek błonowych w resuspenderowanych błonach w objętości około 25 mililitrów.

Dodaj sześć mililitrów 10%DDM w taki sposób, aby końcowe stężenie detergentu wynosiło 2%DDM. Mieszaninę inkubuj w ruchu kołyszącym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwugodzinnej inkubacji w obecności DDM odwiruj mieszaninę z prędkością 40 000 obrotów na minutę przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy użyciu rotora TI I 6 4 7 0,5, aby oddzielić rozpuszczalne kompleksy białkowo-detergentowe od białek nierozpuszczalnych. Pobierz nadsącz zawierający kompleksy białkowo-detergentowe Mex B do wykorzystania w procesie oczyszczania. Wymieszaj nadsącz zawierający kompleksy białkowo-detergentowe Mex B z dwoma mililitrami kulek do powinowactwa do jonów metali, równoważonych w buforze Resus. Inkubuj przez jedną godzinę na walcarku w temperaturze czterech stopni Celsjusza po związaniu białek z żywicą.

Wlej zawiesinę do korpusu kolumny do przepływu grawitacyjnego i odrzuć frakcję przepływową. Przemyj kolumnę 20 mililitrami lub 10 objętości kolumny buforu wiążącego i płuczącego do IMAC, aż proces płukania kolumny zostanie zakończony. Eluuj związane białka za pomocą 10 mililitrów buforu elucyjnego do IMAC.

Pobrać próbki o objętości 10 µL z każdej frakcji elucji. Zmieszać je z 10 µL dwukrotnego buforu do próbek SDS i analizować na 10% żelu poliakrylamidowym SDS.

Oszacuj ilość i czystość białka mex B w każdej frakcji. Pobierz frakcje zawierające kompleksy białka Mex B z detergentem i zagęść je w koncentratorze wirówkowym w temperaturze czterech stopni Celsius.

Wykonaj kilka krótkich wirowań i obserwuj, czy nie powstaje osad. Po każdym wirowaniu przystąp do oczyszczania połączonych frakcji przy użyciu kolumny do filtracji żelowej. Wstępnie wyrównaj kolumnę Superose 12 HL 30 10 za pomocą 24 ml buforu roboczego i poczekaj do uzyskania stabilnej linii bazowej.

Następnie należy przemyć pętlę załadowczą systemu actor płynnym buforem. Przed nałożeniem białka na kolumnę, roztwór białka należy przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego. Następnie na kolumnę nanosi się do 240 µL roztworu białka o stężeniu do 5 mg/mL.

Przepuść 1,5 objętości kolumny buforu i zbieraj frakcje o objętości 0,25 ml. Kompleksy białka XB z detergentem eluują w postaci piku przy objętości elucji około 10 do 15 ml. Pobierz próbki o objętości 5 µl z frakcji piku.

Wymieszaj każdą próbkę w stosunku jeden do jednego z dwukrotnie stężonym buforem do próbek SDS. Próbki analizuj na żelu poliakrylamidowym 10%, aby ocenić ilość i czystość Mex B w każdej frakcji, a następnie wydziel frakcje zawierające czysty Mex B. Żel poliakrylamidowy ten został załadowany wydzielonymi frakcjami z kolumny iMac oraz poszczególnymi frakcjami z kolumny do filtracji żelowej. Po filtracji żelowej białko wydaje się czyste na żelu poliakrylamidowym barwionym Coomassie.

Ślad z kolumny do filtracji żelowej pokazuje główny pik kompleksu białko-detergent wypłukiwanego z kolumny. Średnia wydajność białka mxb wynosi około dwóch miligramów na sześć litrów hodowli two XYT. Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać przeprowadzona w osiem godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ekspresować, solubilizować i oczyszczać białko błonowe.