Name: Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj model immunizacji in vivo u myszy BALB/c do badania indukowanego przez leki autoimmunologicznego zapalenia wątroby. Metoda umożliwia analizę różnic między płciami w patogenezie choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Njoku chciałby podziękować dr Noelowi R. Rose'owi, doktorowi medycyny, za jego wskazówki i wnikliwe dyskusje, które doprowadziły do sformułowania tego modelu.

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Siła tego protokołu polega na jego odtwarzalności; Dlatego bardzo ważne jest, aby przestrzegać sugerowanych kroków. Opracowanie immunogenu może być dla niektórych barierą; jednak odtworzyliśmy nasz model przy użyciu epitopu opisanego w naszym dokumencie, który eliminuje potrzebę izolowania frakcji S100 wątroby. Jest prawdopodobne, że dodatkowe epitopy lub białka mogą zostać zmienione i wywołać zapalenie wątroby po szczepieniach; Opisujemy jednak te białka, których używaliśmy, z wiarygodnymi wynikami. Wykazano, że kilka b...

Celem tej metody jest opisanie mysiego modelu autoimmunologicznego zapalenia wątroby wywołanego przez leki, które rozwija się in vivo i pokazanie, jak można go wykorzystać do zbadania molekularnych, immunologicznych i genetycznych podstaw tej choroby. Długoterminowym celem naszych badań jest odkrycie mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój przewlekłego zapalenia i uszkodzenia wątroby poprzez badanie DIH u podatnych pacjentów. Choroby wątroby i marskość wątroby stanowią szóstą najczęstszą przyczynę zgonów u dorosłych w wieku od 25 do 64 lat. Idiosynkratyczne DILI, czasami określane jako autoimmunologiczne zapalenie wątroby wywołane lekami (DIH), jest trzecią najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w Stanach Zjednoczonych. DIH jest najczęstszym procesem nadwrażliwości wywołanym lekami wątrobowymi obserwowanym u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby1. Zdecydowana większość pacjentów z DIH to kobiety2,3,4. Rodzaj DIH rozwija się u osób podatnych po podaniu fluorowcowanych lotnych środków znieczulających, takich jak izofluran, sewofluran, desfluran lub halotan. Te środki znieczulające kowalencyjnie wiążą się z białkami wątroby z reaktywnymi produktami ich metabolizmu, tworząc w ten sposób nowe autoantygeny zdolne do wywoływania reakcji alergicznych lub autoimmunologicznych5.
Badanie mechanizmów patogennych związanych z rozwojem znieczulenia i jakiejkolwiek formy DIH było wcześniej utrudnione przez brak modelu zwierzęcego, który ściśle naśladowałby indukcję ludzkiej choroby. Opracowaliśmy eksperymentalny mysi model DIH o cechach przypominających DILI o podłożu immunologicznym u pacjentów. Zapalenie wątroby jest wywoływane przez immunizację jednym z dwóch autoantygenów, które zostały kowalencyjnie zmodyfikowane przez metabolit chlorku trifluoroacetylu (TFA), który powstaje w wyniku metabolizmu oksydacyjnego środka znieczulającego przez enzym cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Jednym autoantygenem jest cytozolowa frakcja wątrobowa S100 wątroby, która jest mieszaniną kilku białek 6, a drugi autoantygen to epitop CYP2E1, który jest rozpoznawany przez surowice od pacjentów ze znieczulającym DILI7. Używając myszy BALB/c, które są stosunkowo odporne na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie wątroby, odróżniamy nasz model od modelu immunizacji autoimmunologicznego zapalenia wątroby indukowanego przez S100 u myszy C57Bl/6J8.
Ze względu na różnorodność prezentacji klinicznych, DIH jest trudny do zbadania u pacjentów. Translacyjne modele eksperymentalne dają możliwość oceny patogenezy choroby in vivo i in vitro. Obecnie nie ma innych alternatywnych metod indukowania DIH, które w pełni badałyby in vivo lub in vitro adaptacyjne lub wrodzone odpowiedzi immunologiczne bez użycia zwierząt. Co więcej, ponieważ trifluoroacetylacja S-100 lub epitopu CYP2E1 nie wydaje się wytwarzać drażniącego immunogenu, a my indukujemy DIH poprzez immunizację białkami zmienionymi przez TFA, zwierzęta te nie otrzymają eteru, żadnego halogenowego środka znieczulającego, barbituranów lub alkoholu przed immunizacją lub innymi procedurami, biorąc pod uwagę, że te czynniki mogą zmienić badane przez nas parametry. Mimo to zmniejszyliśmy użycie myszy, wykorzystując symulację komputerową, aby potwierdzić preferencje wiązania naszego odkrytego epitop9 i odzwierciedliliśmy ludzki DIH sugerujący płeć żeńską, wykazując, że samice myszy BALB/c rozwijają cięższy DIH10.
Pomimo różnorodnych prezentacji DIH u pacjentów i wyzwań w badaniu klinicznym choroby, potranslacyjna modyfikacja natywnych białek przez reaktywne metabolity leków jest akceptowanym kluczowym mechanizmem w patogenezie DIH, która następuje po halogenowanych środkach znieczulających11. Badacze zgadzają się również, że CYP2E1 jest głównym autoantygenem w tym procesie12,13. Rola interleukiny (IL)-4-podwyższonej limfocytów T CD4+, które rozpoznają zmodyfikowany potranslacyjnie CYP2E1 i inne białka wątroby, jest akceptowanym inicjatorem znieczulającego DIH poprzez przyciąganie neutrofili, eozynofili i komórek tucznych do wątroby14, a mechanizm ten został potwierdzony w wielu formach DIH15,16. Indukowane limfocyty T CD4 + CD25 + T z ekspresją FoxP3 (Treg) zmniejszają nasilenie DIH, a względne niedobory tych komórek w śledzionie pogarszają DIH 10,7. W związku z tym większość postępów w zrozumieniu DIH była możliwa dzięki wykorzystaniu mysich modeli in vivo do oceny genetycznych, metabolicznych i immunologicznych mechanizmów DIH zarówno in vivo, jak i in vitro.
Ponieważ my i inni badacze odkryliśmy role IL-4, neutrofili i eozynofili w inicjacji DIH przy użyciu różnych modeli mysich, wierzymy, że ta obserwacja potwierdza nasze twierdzenie, że niezależnie od używanego modelu DIH, zapalenie wątroby i uszkodzenia są wywoływane przez IL-4. Siła naszego protokołu polega na wykorzystaniu metodologii in vivo, zarówno samców, jak i samic myszy, oraz powtórzeniu histologii, testów proliferacji limfocytów T CD4 + i cytokin. Mocną stroną naszych badań in vitro jest to, że zmniejszają one liczbę potrzebnych myszy, zapewniając jednocześnie metodologię izolowania interakcji komórkowych, które napędzają DIH. Zalecamy użycie samców i samic myszy, ponieważ zmniejsza to możliwość nieświadomej stronniczości w interpretacji wyników i wzmacnia potencjał translacyjny naszych badań, ponieważ częstość, rozpowszechnienie i nasilenie DIH jest wyższe u kobiet17. Zalecamy, aby myszy były uzyskiwane od jednego dostawcy; Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy zaopatrzyć się w kontrole współmałżonków z miotu lub myszy typu dzikiego od tego samego dostawcy, co myszy zmienione genetycznie.

<table><tbody><tr><td>0,1% Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Zestaw substratów</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c myszy</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Zestaw do proliferacji komórek CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Suplement ogólny</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; komórki kriokonserwowane</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/Martwy Naprawialny Zestaw barwników Aqua Dead Cell&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lista toksyn krztuśca</td><td>Biologiczne</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Inhibitor proteazy Mini tabletki, bez EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-etylotrifluorotiooctan (S-ETFA)</td><td></td>Kasety dializacyjne Slide-a-lyzer <td>Millipore Sigma</td> 177474 <td></td></tr> (<tr><td>10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&handel; Roztwór SDS, 10%</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy balb/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Indukowane lekami autoimmunologiczne zapalenie wątroby (DIH) jest najczęstszym procesem nadwrażliwości wywołanym lekami wątrobowymi obserwowanym u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Zdecydowana większość pacjentów z DIH to kobiety. Mechanizmy leżące u podstaw tych różnic w rozpowszechnieniu płci są niejasne ze względu na niedostatek modeli zwierzęcych, które naśladują ludzkie choroby. Mimo to powszechnie uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw są związane z haplotypami ludzkiego antygenu leukocytów i hormonami płciowymi. W przeciwieństwie do tego, używając mysiego modelu DIH, odkryliśmy, że IL-4 inicjuje limfocyty T CD4 + skierowane przeciwko epitopowi cytochromu P450 2E1 indukują napływ neutrofili, makrofagów i komórek tucznych do wątroby samic myszy BALB / c. Korzystając z tego modelu, wykazaliśmy również, że indukowane przez IL-33 limfocyty T FoxP3 + regulatorowe zapewniają ochronę przed DIH u samic i samców myszy. Ten model DIH jest indukowany przez uodparnienie myszy epitopem CYP2E1, który został kowalencyjnie zmieniony metabolitem leku, który był związany z DIH. Ten epitop jest rozpoznawany przez pacjentów z DIH. Nasza metoda indukuje silne i powtarzalne zapalenie wątroby i autoprzeciwciała, które można wykorzystać do badania patogenezy DIH. Podczas gdy badania in vivo mogą powodować nadmierny ból i niepokój u myszy, jeśli są wykonywane nieprawidłowo, zaletą modelu in vivo jest możliwość oceny patogenezy choroby u dużej liczby myszy. Dodatkowo, biologiczne skutki zmienionych białek wątroby mogą być badane za pomocą inwazyjnych procedur. Dodanie badań in vitro do projektu eksperymentalnego pozwala na szybkie powtórzenie i analizę mechanistyczną na poziomie komórkowym. W ten sposób zademonstrujemy nasz protokół modelowy i sposób, w jaki można go wykorzystać do badania mechanizmów DIH in vivo i in vitro.

Harmonogram immunizacji wykorzystany do indukcji DIH, przedstawiony na Ryc. 1, obrazuje dwa wymagane immunizacje przeprowadzone u podstawy szyi (dzień 0) oraz u podstawy ogona (dzień 7). Ryc. 2 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące proliferacji uzyskane w dniu 14 z wykorzystaniem CFSE w odpowiedzi na CYP2E1, JHDN5, epitop CYP2E1 oraz metabolit trifluoroacetylowy (TFA) środków znieczulających. Ryc. 3 przedstawia strategię bramko...

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Choroby wątroby i marskość wątroby są szóstą najczęstszą przyczyną zgonów u dorosłych w wieku od 25 do 64 lat. Idiosynkratyczne DILI, czasami określane jako zapalenie wątroby wywołane lekami, autoimmunologiczne lub immunologiczne, jest trzecią najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w Stanach Zjednoczonych i jest najczęstszym procesem niedowrażliwości wywołanej lekami w wątrobie. Proces ten zachodzi u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby i ta postać zapalenia wątroby jest najczęstszą przyczyną wycofania leku z rynku komercyjnego.Zdecydowana większość pacjentów z farmakologicznym zapaleniem wątroby to kobiety. Protokół ten opisuje krytyczne cechy obserwowane u pacjentów, takie jak zapalenie wątroby, autoprzeciwciała i różnice płci. Główną zaletą tej techniki jest jej powtarzalność w modelu mysim in vivo, co daje naukowcom szansę obserwowania rozwoju choroby i jej następstw.Korzystając z tego protokołu, odkryliśmy powszechny epitop w znieczuleniu i wirusowym zapaleniu wątroby, który jest dominującym epitopem u pacjentów ze znieczulonym zapaleniem wątroby i jest istotnie związany ze zwłóknieniem u pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby. Wierzymy, że informacje te mogą być wykorzystane do opracowania specyficznych testów diagnostycznych dla polekowego lub wirusowego zapalenia wątroby lub związanego z nim zwłóknienia, które, miejmy nadzieję, mogą przewidzieć osoby zagrożone rozwojem tej choroby lub jej następstwami. Pisemne techniki mogą być przytłaczające, ponieważ zawsze używamy kilku kontroli i równowagi, aby zapewnić powtarzalność naszych wyników.Za pierwszym razem, gdy przeprowadzasz eksperyment, daj sobie wystarczająco dużo czasu. Po pierwszym przejściu idzie dość szybko. Po eutanazji myszy BALB/c należy wykonać nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić zawartość wnętrza jamy brzusznej za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych i wykonać małe nacięcie w żyle głównej dolnej w celu usunięcia krwi.Następnie umieść angiocewnik o rozmiarze 24 w żyle wrotnej. Trzymaj PBS w łaźni wodnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i użyj pompy perystaltycznej, aby obficie napełnić wątrobę 40 mililitrami PBS w tempie 10 mililitrów na minutę. Za pomocą mikronożyczek ostrożnie uwolnij wątrobę z brzucha i zważ wątrobę na tarowanej łodzi wagowej.Pokrój wątrobę na małe 10-15-milimetrowe kawałki. Dodaj próbki wątroby, a także bufor homogenizacyjny, czterokrotnie ważący wątrobę myszy, do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej i uzupełnij kompletnymi tabletkami koktajlowymi inhibitora proteazy zgodnie z rękopisem. Użyj ogólnego laboratoryjnego homogenizatora tkanek o średniej prędkości, aby homogenizować próbki na lodzie, aż będą gładkie.Odwirować homogenaty wątroby w temperaturze 1,500 razy G przez 10 minut, a następnie odlać supernatant cytozolowy S100 Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 100 000 razy G, zatrzaskowo zamrozić supernatant cytozolowy S100 w suchym lodzie i zamrozić probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć trifluoroacetylację, rozmrozić S100 w temperaturze pokojowej. Następnie w kolbie Erlenmeyera rozcieńczyć 20 miligramów mysiego S100 do 10 mililitrów wodą dejonizowaną.Za pomocą pH-metru dostosuj pH do 10 za pomocą 1-normalnego wodorotlenku potasu. W dygestoriach dodaj 4,7 milimoli S-ETFA do roztworu. Utrzymuj pH między 9,9 a 10,0, podając 1-normalny wodorotlenek potasu w postaci kropelkowej przez około godzinę.Zapisać całkowitą objętość wodorotlenku potasu dla każdej reakcji. Przenieść roztwory do oddzielnych kaset do dializy. Umieść kasety w czterech litrach wody dejonizowanej do dializacji przez 72 godziny z trzema zmianami dziennie.Po dializie należy zapisać końcową objętość trifluoroacetylowanego S100, a następnie podwielokrotność do oznakowanych probówek. Zamroź probówki w suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po ustaleniu stężenia białka zgodnie z manuskryptem, jeśli jest większe niż jeden miligram na mililitr, dodaj jeden miligram każdego natywnego i zmienionego TFA białka do jednego mililitra dejonizowanej wody w oddzielnych rurkach kulowych.Przygotuj ślepą próbę w tubie pocisku, używając jednego mililitra wody dejonizowanej. Na 96-dołkowej płytce dodaj po 50 mikrolitrów ślepego, natywnego i zmienionego białka, po kolei. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 4% roztworu wodorowęglanu sodu, a następnie 50 mikrolitrów 0,1%2, 4, 6-trinitrobenzenosulfonowego kwasu do każdej studzienki.Inkubuj płytkę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji dodaj 50 mikrolitrów 10% SDS do każdej studzienki, a następnie 25 mikrolitrów 1-normalnego kwasu solnego. Po uodpornieniu i znieczuleniu myszy należy użyć nożyczek mikrochirurgicznych, aby odsłonić jamę brzuszną.Zidentyfikuj śledzionę. Przeciąć śledzionę na szypułce i umieścić ją na szalce Petriego z PBS zawierającym 2% płodową surowicę cielęcą. Aby uwolnić komórki, wciśnij śledzionę między dwa szkiełka z matowego szkła i pocieraj je o siebie.Użyj pipety elektronicznej, aby przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej. Aby umyć, dodaj PBS zawierający 2% FCS do probówki, aby osiągnąć objętość 50 mililitrów i odwirować przy 335 razy G za pomocą wirówki stołowej z chłodzeniem. Odlej supernatant i powtórz etap mycia.Dodaj jeden mililitr buforu lizującego ACK do probówki, aby myć przez jedną minutę w celu usunięcia czerwonych krwinek. Następnie powtórzyć etap mycia PBS uzupełnionego FCS. Po znakowaniu komórek CFSE przez 30 minut, dodaj 10 mikrogramów na mililitr cytochromu-P450 2E1, JHDN5 lub trifluoroacetylowanej albuminy jaja kurzego, aby stymulować znakowane komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.Po inkubacji wybarwić komórki CD4 znakowanym allofikocyjaniną w stosunku 1:100 przez 30 minut na lodzie. Po laparotomii uodpornionej myszy, zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy kanniulować żyłę wrotną za pomocą igły o rozmiarze 25, a następnie przeciąć żyłę główną dolną poniżej żył nerkowych. W łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza należy perfaktorować każdą wątrobę 40 mililitrami PBS przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę.Po perfuzji za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przeciąć wątrobę przy szypułce wątroby, usunąć woreczek żółciowy, a następnie przeciąć wątrobę przy wnęce. Na sicie ze stali nierdzewnej o oczkach 300 użyj sterylnego tłuczka strzykawkowego o pojemności 20 mililitrów i zimnego PBS, aby zakłócić pracę wątroby. Za pomocą sita przefiltruj powstałą zawiesinę komórek do 50-mililitrowych, wstępnie wysterylizowanych probówek wirówkowych.Doprowadzić każdą zawiesinę do 50 mililitrów za pomocą zimnego PBS, a następnie przemyć zawiesinę przez wirowanie przez 10 minut przy 370 razy G Wyrzucić supernatant, a następnie połączyć granulki przez obróbkę z nowymi 50-mililitrowymi probówkami. Zawieś połączone granulki w 45 mililitrach 35% Percollu w PBS i 100 jednostkach międzynarodowych na mililitr heparyny. Następnie wiruj każdą rurkę z prędkością 500 razy G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS, a następnie dodać jeden mililitr buforu lizującego ACK do każdego granulatu i przechowywać na lodzie przez 10 minut. Po ponownym przemyciu PBS przez odwirowanie w stężeniu 370 razy G, odrzucić supernatant, a następnie przepłukać komórki PBS uzupełnionym FCS przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 370 razy G. Użyć hemocytometru elektronicznego, aby policzyć komórki. W tym eksperymencie odpowiedzi immunologiczne limfocytów T CD4 + określono za pomocą cytometrii przepływowej.Reprezentatywne dane dotyczące proliferacji uzyskano w dniu 14 przy użyciu CFSE w odpowiedzi na metabolit trifluoroacetylu, cytochrom-P450 2E1, epitop cytochromu-P450 2E1, JHDN5. Jako kontrole używano studzienek bez antygenu. W porównaniu z kontrolą, myszy BALB / c rozwinęły proliferację w odpowiedzi na trifluoroacetylowaną albuminę jaja kurzego i cytochrom-P450 2E1, ale nie JHDN5.Trzy tygodnie po emulgacji TFA w pełnej immunizacji uzupełniającej Freunda, samice myszy BALB / c rozwinęły więcej indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby w porównaniu z samcami myszy BALB / c. Analiza histologiczna tkanek wątroby wykazuje również cięższe zapalenie wątroby u samic myszy niż u samców. Liczba komórek wątrobowych CD4 + CD8 + NK + i NKT + była znacznie wyższa u kobiet niż u mężczyzn.podczas gdy nie zaobserwowano różnic w limfocytach B między tymi myszami Pamiętaj, że chociaż jest to długi dzień, ten preparat będzie trwał długo. Procedurę tę można również wykonać w celu trifluoroacetylacji epitopu. Procedura ta pozwoliła naukowcom przeanalizować przebieg rozwoju chorób wątroby w czasie i zwiększyć potencjał nowych odkryć białek i szlaków.S-etylotrifluorotiooctan jest toksyczny i należy go obchodzić w dygestorium. Ponadto zdecydowanie zaleca się dobrą praktykę laboratoryjną i techniki.

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Zakażenie myszy adenowirusem wykazującym ekspresję głównego ludzkiego autoantygenu cytochromu P450 2D6 (hCYP2D6), rozpoznawanego przez surowice pacjentów cierpiących na autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu 2, prowadzi do utrwalonej formy autoimmunologicznej choroby wątroby charakteryzującej się rozległym zapaleniem wątroby, włóknieniem oraz generowaniem swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko CYP2D6.

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Poznaj model immunizacji in vivo u myszy BALB/c do badania indukowanego przez leki autoimmunologicznego zapalenia wątroby. Metoda umożliwia analizę różnic między płciami w patogenezie choroby.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Przeglądaj więcej filmów