Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Choroby wątroby i marskość wątroby są szóstą najczęstszą przyczyną zgonów u dorosłych w wieku od 25 do 64 lat. Idiosynkratyczne DILI, czasami określane jako zapalenie wątroby wywołane lekami, autoimmunologiczne lub immunologiczne, jest trzecią najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w Stanach Zjednoczonych i jest najczęstszym procesem niedowrażliwości wywołanej lekami w wątrobie. Proces ten zachodzi u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby i ta postać zapalenia wątroby jest najczęstszą przyczyną wycofania leku z rynku komercyjnego.

Zdecydowana większość pacjentów z farmakologicznym zapaleniem wątroby to kobiety. Protokół ten opisuje krytyczne cechy obserwowane u pacjentów, takie jak zapalenie wątroby, autoprzeciwciała i różnice płci. Główną zaletą tej techniki jest jej powtarzalność w modelu mysim in vivo, co daje naukowcom szansę obserwowania rozwoju choroby i jej następstw.

Korzystając z tego protokołu, odkryliśmy powszechny epitop w znieczuleniu i wirusowym zapaleniu wątroby, który jest dominującym epitopem u pacjentów ze znieczulonym zapaleniem wątroby i jest istotnie związany ze zwłóknieniem u pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby. Wierzymy, że informacje te mogą być wykorzystane do opracowania specyficznych testów diagnostycznych dla polekowego lub wirusowego zapalenia wątroby lub związanego z nim zwłóknienia, które, miejmy nadzieję, mogą przewidzieć osoby zagrożone rozwojem tej choroby lub jej następstwami. Pisemne techniki mogą być przytłaczające, ponieważ zawsze używamy kilku kontroli i równowagi, aby zapewnić powtarzalność naszych wyników.

Za pierwszym razem, gdy przeprowadzasz eksperyment, daj sobie wystarczająco dużo czasu. Po pierwszym przejściu idzie dość szybko. Po eutanazji myszy BALB/c należy wykonać nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić zawartość wnętrza jamy brzusznej za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych i wykonać małe nacięcie w żyle głównej dolnej w celu usunięcia krwi.

Następnie umieść angiocewnik o rozmiarze 24 w żyle wrotnej. Trzymaj PBS w łaźni wodnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i użyj pompy perystaltycznej, aby obficie napełnić wątrobę 40 mililitrami PBS w tempie 10 mililitrów na minutę. Za pomocą mikronożyczek ostrożnie uwolnij wątrobę z brzucha i zważ wątrobę na tarowanej łodzi wagowej.

Pokrój wątrobę na małe 10-15-milimetrowe kawałki. Dodaj próbki wątroby, a także bufor homogenizacyjny, czterokrotnie ważący wątrobę myszy, do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej i uzupełnij kompletnymi tabletkami koktajlowymi inhibitora proteazy zgodnie z rękopisem. Użyj ogólnego laboratoryjnego homogenizatora tkanek o średniej prędkości, aby homogenizować próbki na lodzie, aż będą gładkie.

Odwirować homogenaty wątroby w temperaturze 1,500 razy G przez 10 minut, a następnie odlać supernatant cytozolowy S100 Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 100 000 razy G, zatrzaskowo zamrozić supernatant cytozolowy S100 w suchym lodzie i zamrozić probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć trifluoroacetylację, rozmrozić S100 w temperaturze pokojowej. Następnie w kolbie Erlenmeyera rozcieńczyć 20 miligramów mysiego S100 do 10 mililitrów wodą dejonizowaną.

Za pomocą pH-metru dostosuj pH do 10 za pomocą 1-normalnego wodorotlenku potasu. W dygestoriach dodaj 4,7 milimoli S-ETFA do roztworu. Utrzymuj pH między 9,9 a 10,0, podając 1-normalny wodorotlenek potasu w postaci kropelkowej przez około godzinę.

Zapisać całkowitą objętość wodorotlenku potasu dla każdej reakcji. Przenieść roztwory do oddzielnych kaset do dializy. Umieść kasety w czterech litrach wody dejonizowanej do dializacji przez 72 godziny z trzema zmianami dziennie.

Po dializie należy zapisać końcową objętość trifluoroacetylowanego S100, a następnie podwielokrotność do oznakowanych probówek. Zamroź probówki w suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po ustaleniu stężenia białka zgodnie z manuskryptem, jeśli jest większe niż jeden miligram na mililitr, dodaj jeden miligram każdego natywnego i zmienionego TFA białka do jednego mililitra dejonizowanej wody w oddzielnych rurkach kulowych.

Przygotuj ślepą próbę w tubie pocisku, używając jednego mililitra wody dejonizowanej. Na 96-dołkowej płytce dodaj po 50 mikrolitrów ślepego, natywnego i zmienionego białka, po kolei. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 4% roztworu wodorowęglanu sodu, a następnie 50 mikrolitrów 0,1%2, 4, 6-trinitrobenzenosulfonowego kwasu do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji dodaj 50 mikrolitrów 10% SDS do każdej studzienki, a następnie 25 mikrolitrów 1-normalnego kwasu solnego. Po uodpornieniu i znieczuleniu myszy należy użyć nożyczek mikrochirurgicznych, aby odsłonić jamę brzuszną.

Zidentyfikuj śledzionę. Przeciąć śledzionę na szypułce i umieścić ją na szalce Petriego z PBS zawierającym 2% płodową surowicę cielęcą. Aby uwolnić komórki, wciśnij śledzionę między dwa szkiełka z matowego szkła i pocieraj je o siebie.

Użyj pipety elektronicznej, aby przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej. Aby umyć, dodaj PBS zawierający 2% FCS do probówki, aby osiągnąć objętość 50 mililitrów i odwirować przy 335 razy G za pomocą wirówki stołowej z chłodzeniem. Odlej supernatant i powtórz etap mycia.

Dodaj jeden mililitr buforu lizującego ACK do probówki, aby myć przez jedną minutę w celu usunięcia czerwonych krwinek. Następnie powtórzyć etap mycia PBS uzupełnionego FCS. Po znakowaniu komórek CFSE przez 30 minut, dodaj 10 mikrogramów na mililitr cytochromu-P450 2E1, JHDN5 lub trifluoroacetylowanej albuminy jaja kurzego, aby stymulować znakowane komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Po inkubacji wybarwić komórki CD4 znakowanym allofikocyjaniną w stosunku 1:100 przez 30 minut na lodzie. Po laparotomii uodpornionej myszy, zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy kanniulować żyłę wrotną za pomocą igły o rozmiarze 25, a następnie przeciąć żyłę główną dolną poniżej żył nerkowych. W łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza należy perfaktorować każdą wątrobę 40 mililitrami PBS przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę.

Po perfuzji za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przeciąć wątrobę przy szypułce wątroby, usunąć woreczek żółciowy, a następnie przeciąć wątrobę przy wnęce. Na sicie ze stali nierdzewnej o oczkach 300 użyj sterylnego tłuczka strzykawkowego o pojemności 20 mililitrów i zimnego PBS, aby zakłócić pracę wątroby. Za pomocą sita przefiltruj powstałą zawiesinę komórek do 50-mililitrowych, wstępnie wysterylizowanych probówek wirówkowych.

Doprowadzić każdą zawiesinę do 50 mililitrów za pomocą zimnego PBS, a następnie przemyć zawiesinę przez wirowanie przez 10 minut przy 370 razy G Wyrzucić supernatant, a następnie połączyć granulki przez obróbkę z nowymi 50-mililitrowymi probówkami. Zawieś połączone granulki w 45 mililitrach 35% Percollu w PBS i 100 jednostkach międzynarodowych na mililitr heparyny. Następnie wiruj każdą rurkę z prędkością 500 razy G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS, a następnie dodać jeden mililitr buforu lizującego ACK do każdego granulatu i przechowywać na lodzie przez 10 minut. Po ponownym przemyciu PBS przez odwirowanie w stężeniu 370 razy G, odrzucić supernatant, a następnie przepłukać komórki PBS uzupełnionym FCS przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 370 razy G. Użyć hemocytometru elektronicznego, aby policzyć komórki. W tym eksperymencie odpowiedzi immunologiczne limfocytów T CD4 + określono za pomocą cytometrii przepływowej.

Reprezentatywne dane dotyczące proliferacji uzyskano w dniu 14 przy użyciu CFSE w odpowiedzi na metabolit trifluoroacetylu, cytochrom-P450 2E1, epitop cytochromu-P450 2E1, JHDN5. Jako kontrole używano studzienek bez antygenu. W porównaniu z kontrolą, myszy BALB / c rozwinęły proliferację w odpowiedzi na trifluoroacetylowaną albuminę jaja kurzego i cytochrom-P450 2E1, ale nie JHDN5.

Trzy tygodnie po emulgacji TFA w pełnej immunizacji uzupełniającej Freunda, samice myszy BALB / c rozwinęły więcej indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby w porównaniu z samcami myszy BALB / c. Analiza histologiczna tkanek wątroby wykazuje również cięższe zapalenie wątroby u samic myszy niż u samców. Liczba komórek wątrobowych CD4 + CD8 + NK + i NKT + była znacznie wyższa u kobiet niż u mężczyzn.

podczas gdy nie zaobserwowano różnic w limfocytach B między tymi myszami Pamiętaj, że chociaż jest to długi dzień, ten preparat będzie trwał długo. Procedurę tę można również wykonać w celu trifluoroacetylacji epitopu. Procedura ta pozwoliła naukowcom przeanalizować przebieg rozwoju chorób wątroby w czasie i zwiększyć potencjał nowych odkryć białek i szlaków.

S-etylotrifluorotiooctan jest toksyczny i należy go obchodzić w dygestorium. Ponadto zdecydowanie zaleca się dobrą praktykę laboratoryjną i techniki.