Name: Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Technika zapobiega zwijaniu się próbek, poprawiając jakość analizy ultrastrukturalnej synaps.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Natural Science Foundation of China Grant 32070811, oraz Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Dziękujemy Laboratorium Mikroskopii Elektronowej i Centrum Analizy Morfologicznej, Szkoła Medyczna, Uniwersytet Południowo-Wschodni, Nankin, Chiny.

UWAGA: Metoda przygotowania próbki z transmisyjnej mikroskopii elektronowej użyta w tym artykule została opisana wcześniej16. Należy zauważyć, że dobór odczynników i dostosowanie dawkowania są konieczne w zależności od próbki. W procesie przygotowania próbki stosuje się wiele toksycznych odczynników chemicznych, dlatego operator musi podjąć pewne środki ochronne, takie jak noszenie odzieży ochronnej i rękawic oraz praca pod wyciągiem.
1. Procedura preparacji, utrwalania i umieszczania
<ol>
	<li>Rozwarstwienie
	<ol>
		<li>Wypreparuj wędrujące larwy późno w trzecim stadium w roztworze Jana i uzyskaj całą ścianę ciała w oparciu o standardowe procedury17. Przygotuj roztwór Jana w następujący sposób: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35 mM sacharozy, 5 mM HEPES, pH 7,4 
		UWAGA: Ściana ciała larw Drosophila odnosi się do zewnętrznej powłoki lub powłoki stadium larwalnego muszki owocowej Drosophila. Obejmuje to naskórek, komórki naskórka i leżące poniżej tkanki, które tworzą egzoszkielet larwalny. Ściana ciała zapewnia wsparcie strukturalne i ochronę oraz służy jako bariera między ciałem larwy a środowiskiem zewnętrznym17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Utrwalać ścianę ciała larwy w komorze rozwarstwiającej w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą utrwalacza. Aby przygotować utrwalacz, zmieszać 2% aldehydu glutarowego i 2% formaldehydu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,4)</li>
		<li>Przepłukać próbki kilkakrotnie buforem kakodylanu sodu.</li>
		<li>Przygotować 1% OsO4 w buforze kakodylowym. Utrwalić próbki w 1% OsO4 przez 2 godziny, a następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie destylowanej. 
		UWAGA: Podwójne utrwalenie aldehydami i OsO4 zapewnia lepszą ochronę ultrastruktury komórkowej. Poza tym OsO4 może zabarwić tkankę próbki, dzięki czemu kontrast między światłem a próbką jest bardziej widoczny18.</li>
		<li>Wybarwić próbki połączeń nerwowo-mięśniowych Drosophila 2% nasyconym octanem uranylu przez 2 godziny, a następnie kilkakrotnie przepłukać wodą dejonizowaną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmieszczenie próbek
	<ol>
		<li>Wytnij nożyczkami dwa okrągłe kawałki metalowej siatki o podobnej wielkości (wielkość porów 270 μm).</li>
		<li>Umieść wcześniej metalową siatkę (270 μm) u podstawy butelki z płaskim dnem.</li>
		<li>Umieść utrwalone próbki larw na siatce, a następnie umieść na nich kolejną siatkę, tak aby próbki zostały umieszczone między dwiema siatkami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odwodnienie
UWAGA W tym artykule zastosowano metodę odwadniania etanolu metodą gradientu.
<ol>
	<li>Próbki należy odwadniać kolejno w rosnącym gradiencie stężeń etanolu (50%, 70%, 85%, 95% raz każda, 100% dwukrotnie), każda przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać próbki dwukrotnie tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej przez 5 minut za każdym razem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
3. Infiltracja
UWAGA: Infiltracja jest jednym z niezbędnych kroków do przygotowania próbki TEM. Infiltracja pozwala na stopniową wymianę pożywki odwadniającej na pożywkę zatapiającą w próbce, aby umożliwić wypełnienie szczeliny komórki pożywką do zatapiania19.
<ol>
	<li>Umieścić próbki w zmieszanym roztworze tlenku propylenu i żywicy epoksydowej w stosunku 1:1 i 1:2 przez 1 godzinę każda, a następnie czystą żywicę epoksydową przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Osadzanie
<ol>
	<li>Przygotuj folię polietylenową i pokrój ją na duży kwadrat (około 5 × 5 cm) i małą pustą prostokątną podporę (około 2 × 2 cm). Przyklej mały kwadrat do dużego kwadratu.</li>
	<li>Umieść wystarczającą ilość żywicy epoksydowej na środku dużego kwadratu.</li>
	<li>Umieść próbki we wstępnie umieszczonej żywicy epoksydowej stroną mięśniową skierowaną do góry. Użyj stereoskopu.</li>
	<li>Dodaj kilka kropli żywicy do próbek, a następnie przykryj je folią PE (nieco większą niż przekładka) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D-E).</li>
	<li>Polimeryzuj próbki w temperaturze odpowiednio 37 °C, 42 °C i 60 °C przez 24 godziny (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
</ol>
5. Procedura podziału na sekcje
<ol>
	<li>Usunąć nadmiar części ścianki ciała larwy ostrym ostrzem i zachować trapez, w tym segment A2/A3. 
	UWAGA: Górna linia powinna znajdować się w pobliżu 13. mięśnia, a linia bazowa powinna znajdować się z dala od próbki do żywicy epoksydowej. Wysokość między linią grzbietu a linią podstawową wynosi około 5-8 mm.</li>
	<li>Usuń trapez z pozostałej części próbki i przyklej go do kapsułki wypełnionej żywicą za pomocą kleju A/B.</li>
	<li>Potwierdź położenie 6 i 7 mięśnia segmentów A2 i A3 pod mikroskopem świetlnym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G) i utrzymuj płaszczyznę styczną równoległą do 6 mięśnia.</li>
	<li>Odciąć jedną piątą próbki wzdłuż dwóch stron segmentu A3. 
	UWAGA: Usuń większość 6. mięśnia i zachowaj 1/3 szerokości 7. mięśnia.</li>
	<li>Za pomocą ultracienkiego mikrotomu przygotuj ultracienki fragment próbki, zaczynając od 6. mięśnia. 
	UWAGA: Każdy plasterek ma grubość około 90 nm.</li>
	<li>Dołącz jak najwięcej plasterków do każdej siatki miedzianej.</li>
	<li>Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową zgodnie z wcześniejszym opisem16.</li>
</ol>

<ol><li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+fat+crystal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li>
<li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li>
<li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).</li>
<li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin%2C+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+and+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li>
<li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).</li>
<li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%3A+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li>
<li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li>
<li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li>
<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li>
<li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li>
<li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Science+International%22%5BJournal%5D)">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).</li>
<li>Lovrić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li>
<li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p150%28Glued%29+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li>
<li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li>
<li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Próbki larw Drosophila mają tendencję do zwijania się podczas odwodnienia, ponieważ próbki są cienkie, co utrudnia dokładne zlokalizowanie połączenia nerwowo-mięśniowego, zwiększając w ten sposób trudność i nakład pracy związany z przygotowaniem próbki. Tradycyjnym ulepszeniem jest skrócenie próbki7, ale próbki nadal były zwinięte w różnym stopniu.
W naszej metodzie występują dwa kluczowe etapy: po pierwsze, próbki pozostają płaskie przez cały proces odwadniani...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Mikroskopia elektronowa to jedna z najbardziej idealnych metod badania ultrastruktury materiałów biologicznych, która może wizualnie i dokładnie pokazać wewnętrzną strukturę komórek na poziomie nanoskali1. Jednak ze względu na złożoność procesu przygotowania próbki i wysokie koszty, mikroskopia elektronowa nie jest tak popularna jak mikroskopia lekka. Ostatnie postępy w technikach mikroskopii elektronowej doprowadziły do znacznej poprawy jakości obrazu, co zbiegło się w czasie ze znacznym zmniejszeniem związanego z tym obciążenia pracą. W związku z tym mikroskopia elektronowa odegrała ważną rolę w rozwoju wiedzy naukowej w różnych dziedzinach2.
Drosophila to doskonały model zwierzęcy do wykonywania manipulacji genetycznych w celu precyzyjnej kontroli przestrzennej i czasowej ekspresji docelowych genów3. Poza tym Drosophila ma zalety krótkiego okresu wzrostu i łatwej hodowli w porównaniu z modelami ssaków; dlatego Drosophila jest szeroko stosowana w badaniach morfologicznych4,5.
U larw Drosophila, bulony połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) są szeroko rozpowszechnione w mięśniach6,7, a barwienie immunologiczne NMJ może łatwo dostarczyć informacji o ilości i morfologii synaps8,9 . Butony NMJ znajdujące sięw 6/7 mięśniach segmentówA2 iA3 doskonale nadają się do badań ilościowych i morfologicznych przy użyciu mikroskopii świetlnej. Dzieje się tak ze względu na ich rozmiar i obfitość10,11. Dlatego larwy Drosophila NMJ są uważane za użyteczny model do badań neurobiologicznych12. 
Jednak trudno jest obserwować ultrastrukturę NMJ przez TEM. Ponieważ okno skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wąskie, trudno jest ustawić szeroko rozpowszechnione boutons13. Innym powodem jest to, że ściana ciała Drosophila jest podatna na zwijanie się podczas etapu dehydratacji alkoholowej w protokole przygotowania próbki7.
Tradycyjne badania zazwyczaj wybierały jako próbki bulony między 6 a 7 mięśniem segmentów A2 iA 3 ze względu na ich obfitość i rozmiar14,15. Szóstyi siódmy mięsień segmentówA2 i A3 są większe niż inne mięśnie i zawierają więcej batutonów. Jednak, gdy próbki zostały przygotowane do mikroskopii elektronowej, utrwalone próbki miały tendencję do stawania się cienkimi i podatnymi na zwijanie się, co prowadziło do niewłaściwego ustawienia 6. i 7. mięśnia segmentówA2 iA3.
Niniejszym informujemy o nowej procedurze przetwarzania, która jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu do tradycyjnej metody przygotowania próbek7,16, pozwalając próbkom pozostać płaskimi podczas późniejszego odwodnienia, ułatwiając tym samym lepsze umiejscowienie połączeń nerwowo-mięśniowych larw Drosophila.

<table><tbody><tr><td>1,2-epoksypropan</td><td>SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD</td><td>JYJ 037-2015</td><td>Środek penetrujący</td></tr><tr><td>Drosophila Zapasy</td><td>Bloomington</td><td>brak</td><td>Wszystkie szczepy kontrolne Drosophila typu dzikiego użyte w tych badaniach to W1118 i były hodowane zgodnie ze standardowymi metodami hodowli</td></tr><tr><td>Probówki szklane z płaskim dnem</td><td>Haimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma&nbsp;</td><td>brak</td><td>Probówki szklane płaskodenne (butelka) z korkiem z gąbki (lub korkiem do butelki)</td></tr><tr><td>Sieciownik K4M</td><td>&nbsp; Agar Scientific</td><td>Cat# 1924B</td><td>Żywice do zatapiania oparte są na formule wysoce usieciowanego akrylanu i metakrylanu&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywica K4M (monomer B)</td><td>&nbsp; Agar Scientific</td><td>Lot # 631557</td><td>Monomer żywicy</td></tr><tr><td>Folia poliwinylowa</td><td>Haimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma&nbsp;</td><td>brak</td><td>Przezroczysta folia polietylenowa jest najlepsza, grubość około 0,2 mm</td></tr><tr><td>SPI Chem DDSA</td><td>SPI</td><td>SpI#02827-AF</td><td>Dodecenyl Bezwodnik bursztynowy</td></tr><tr><td>SPI-Chem DMP-30 Epoksyd</td><td>SPI</td><td>02823-DA</td><td>Akcelerator</td></tr><tr><td>SPI-Chem NMA</td><td></td><td>SPI SpI#02828-AF</td><td>Hardner do żywicy epoksydowej</td></tr><tr><td>SPI-PON 812 Epoksydowej</td><td>SPI</td><td>SPI#0259-AB</td><td>Monomer</td></tr> <tr><td>żywicySiatka stalowa&nbsp;</td><td>Sklep ogrodniczy Yuhuiyuan (online)</td><td>none</td><td>Siatka miedziana lub ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi H-7650</td><td>11416692</td><td>Wszystkie siatki (na których zebrano próbki) zabarwiono cytrynianem ołowiu i obserwowano pod transmisyjną mikroskopią elektronową.</td></tr><tr><td>Ultracienki mikrotom</td><td>Leica UC7 ultracienki</td><td>mikrotom 595915</td><td>Wszystkie operacje cięcia są wykonywane na ultracienkim mikrotomie Leica UC7 za pomocą noża diamentowego</td></tr></tbody></table>

optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw drosophila

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) stało się cennym systemem modelowym w dziedzinie neuronauki. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej w Drosophila NMJ umożliwia naukowcom uzyskanie informacji synaptycznych, obejmujących zarówno dane ilościowe dotyczące obfitości synaps, jak i szczegółowy wgląd w ich morfologię. Jednak rozproszony rozkład i ograniczony zasięg widzenia TEM stanowią wyzwanie dla analizy ultrastrukturalnej. Niniejsze badanie wprowadza innowacyjną i wydajną metodę przygotowania próbki, która przewyższa konwencjonalne podejście. Procedura rozpoczyna się od umieszczenia metalowej siatki u podstawy płaskodennej butelki lub probówki, a następnie umieszczenia utrwalonych próbek larw na siatce. Nad próbkami umieszcza się dodatkową siatkę, upewniając się, że są one umieszczone między dwoma siatkami. Utrwalone próbki są dokładnie odwadniane i infiltrowane przed przystąpieniem do procedury zatapiania. Następnie zatapianie próbek w żywicy epoksydowej odbywa się w sposób płaski, co pozwala na przygotowanie mięśni do ułożenia i przekroju. Korzystając z tych kroków, wszystkie mięśnie larw Drosophila można uwidocznić pod mikroskopem świetlnym, co ułatwia późniejsze pozycjonowanie i cięcie. Nadmiar żywicy usuwa się po zlokalizowaniu6 i 7 mięśnia segmentów ciałaA2 i A3. Wykonuje się seryjne ultracienkie cięcie 6. lub 7. mięśnia.

Ściana ciała larwy Drosophila składa się z 30 identyfikowalnych włókien mięśniowych ułożonych w regularny wzór i po sekcji oraz fiksacji przypomina cienki plaster21(Rysunek 1A). Próbka pozostaje płaska podczas procesu odwodnienia dzięki zastosowaniu metalowych siatek (Rysunek 1B, C). Mięśnie ciała larwy są zatopione w cienkiej płytce wykonanej z żywicy epoksydowej (Rysunek 1D...

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Rozproszony rozkład i ograniczony zasięg widzenia TEM stanowią wyzwanie dla analizy infrastrukturalnej. Protokół ten przedstawia innowacyjną i wydajną metodę przygotowania próbki, która przewyższa konwencjonalne podejście. Ta zaawansowana metoda przygotowania próbki TEM jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną, pozwalając próbkom pozostać płaskimi podczas późniejszego odwodnienia.W zależności od rodzaju próbki należy dokonać doboru odczynników i dostosowania dawkowania. W procesie przygotowania próbki stosuje się wiele toksycznych odczynników chemicznych. Procedurę zademonstruje Sheng Qingyuan, mistrz z laboratorium dr Gan Guangminga.Na początek przeprowadź sekcję wędrujących larw Drosophila w późnym trzecim stadium rozwojowym w roztworze Jana i uzyskaj całą ścianę ciała zgodnie ze standardowymi procedurami. Przymocuj ścianę ciała larwy za pomocą utrwalacza w komorze rozwarstwiającej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś ścianę ciała larwy z komory rozwarstwiania do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i przepłucz ją kilkakrotnie buforem kakodylanu sodu.Zamocuj ścianę ciała larwy w 1% tetratlenku osmu na dwie godziny. Po utrwaleniu próbki należy kilkakrotnie przemyć wodą destylowaną. Dodaj 2% nasycony roztwór octanu pisuaru do probówki, aby zabarwić połączenie nerwowo-mięśniowe PHI.A po dwóch godzinach spłucz próbki wodą dejonizowaną. Następnie za pomocą nożyczek wytnij dwa okrągłe kawałki metalowej siatki o wielkości porów 270 mikronów. Umieść metalową siatkę u podstawy butelki z płaskim dnem.Następnie umieść utrwalone larwy na siatce, a następnie umieść kolejną siatkę. Odwadniać próbki w rosnącym stężeniu etanolu przez 20 minut każda w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przepłukać próbki tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej przez pięć minut każda.Następnie umieść próbki w roztworze tlenku propylenu i żywicy epoksydowej, a następnie w czystej żywicy epoksydowej na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Do zatapiania pokrój folię polietylenową na duży kwadrat i małą, pustą prostokątną podporę. Przyklej mały kwadrat do dużego kwadratu.Dodaj wystarczającą ilość żywicy epoksydowej na środku dużego kwadratu. Następnie włącz stereoskop i umieść próbki we wstępnie umieszczonej żywicy epoksydowej stroną mięśniową skierowaną do góry. Dodaj kilka kropli żywicy epoksydowej na próbki i przykryj je folią polietylenową.Umieścić próbki do polimeryzacji w rosnących temperaturach na 24 godziny każda. Po polimeryzacji za pomocą ostrego ostrza usuń nadmiar części ciała larwy, zachowując trapez, w tym segment A2 i A3. Usuń trapez z pozostałej ściany ciała larwy i przymocuj go do kapsułki wypełnionej żywicą za pomocą kleju AB.Pod mikroskopem świetlnym potwierdź położenie szóstego i siódmego mięśnia segmentów A2 i A3, utrzymując płaszczyznę styczną równoległą do szóstego mięśnia. Następnie odciąć jedną piątą próbki wzdłuż dwóch stron segmentu A3. Za pomocą mikrotomu przygotuj ultra cienki fragment próbki, zaczynając od szóstego mięśnia.Po pokrojeniu przymocuj jak najwięcej plasterków do każdej siatki miedzianej. Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby obserwować próbki. Spośród żywicy Lowicryl K4M i żywicy epoksydowej, żywica Lowicryl K4M zapewniła ostrzejsze i łatwiejsze do zaobserwowania wyniki mięśni ciała Drosophila.Obrazowanie konfokalne wykazało lepszą wizualizację połączenia nerwowo-mięśniowego między szóstym a siódmym mięśniem. Transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła przypominające koraliki połączenia nerwowo-mięśniowe, oferujące lepsze informacje o strukturze synaptycznej. Próbki pozostały płaskie przez cały proces odwadniania ze względu na ograniczenie metalowych oczek.Poza tym próbki zostały spolimeryzowane między produktami z tworzyw sztucznych, zapobiegając ich składaniu. W przyszłości metoda przygotowania próbki TEM może zostać zastosowana do neuropilu mózgu i brzusznego rdzenia nerwowego, zwiększając w ten sposób potencjał badań ultrastrukturalnych.

optimizing-sample-preparation-process-for-transmission-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Opisujemy technikę sekcji, która zachowuje architekturę połączenia nerwowo-mięśniowego i umożliwia szczegółowe badanie immunocytochemiczne neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila.

Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj zoptymalizowaną metodę przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Technika zapobiega zwijaniu się próbek, poprawiając jakość analizy ultrastrukturalnej synaps.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów