Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Rozproszony rozkład i ograniczony zasięg widzenia TEM stanowią wyzwanie dla analizy infrastrukturalnej. Protokół ten przedstawia innowacyjną i wydajną metodę przygotowania próbki, która przewyższa konwencjonalne podejście. Ta zaawansowana metoda przygotowania próbki TEM jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną, pozwalając próbkom pozostać płaskimi podczas późniejszego odwodnienia.

W zależności od rodzaju próbki należy dokonać doboru odczynników i dostosowania dawkowania. W procesie przygotowania próbki stosuje się wiele toksycznych odczynników chemicznych. Procedurę zademonstruje Sheng Qingyuan, mistrz z laboratorium dr Gan Guangminga.

Na początek przeprowadź sekcję wędrujących larw Drosophila w późnym trzecim stadium rozwojowym w roztworze Jana i uzyskaj całą ścianę ciała zgodnie ze standardowymi procedurami. Przymocuj ścianę ciała larwy za pomocą utrwalacza w komorze rozwarstwiającej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś ścianę ciała larwy z komory rozwarstwiania do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i przepłucz ją kilkakrotnie buforem kakodylanu sodu.

Zamocuj ścianę ciała larwy w 1% tetratlenku osmu na dwie godziny. Po utrwaleniu próbki należy kilkakrotnie przemyć wodą destylowaną. Dodaj 2% nasycony roztwór octanu pisuaru do probówki, aby zabarwić połączenie nerwowo-mięśniowe PHI.

A po dwóch godzinach spłucz próbki wodą dejonizowaną. Następnie za pomocą nożyczek wytnij dwa okrągłe kawałki metalowej siatki o wielkości porów 270 mikronów. Umieść metalową siatkę u podstawy butelki z płaskim dnem.

Następnie umieść utrwalone larwy na siatce, a następnie umieść kolejną siatkę. Odwadniać próbki w rosnącym stężeniu etanolu przez 20 minut każda w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przepłukać próbki tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej przez pięć minut każda.

Następnie umieść próbki w roztworze tlenku propylenu i żywicy epoksydowej, a następnie w czystej żywicy epoksydowej na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Do zatapiania pokrój folię polietylenową na duży kwadrat i małą, pustą prostokątną podporę. Przyklej mały kwadrat do dużego kwadratu.

Dodaj wystarczającą ilość żywicy epoksydowej na środku dużego kwadratu. Następnie włącz stereoskop i umieść próbki we wstępnie umieszczonej żywicy epoksydowej stroną mięśniową skierowaną do góry. Dodaj kilka kropli żywicy epoksydowej na próbki i przykryj je folią polietylenową.

Umieścić próbki do polimeryzacji w rosnących temperaturach na 24 godziny każda. Po polimeryzacji za pomocą ostrego ostrza usuń nadmiar części ciała larwy, zachowując trapez, w tym segment A2 i A3. Usuń trapez z pozostałej ściany ciała larwy i przymocuj go do kapsułki wypełnionej żywicą za pomocą kleju AB.

Pod mikroskopem świetlnym potwierdź położenie szóstego i siódmego mięśnia segmentów A2 i A3, utrzymując płaszczyznę styczną równoległą do szóstego mięśnia. Następnie odciąć jedną piątą próbki wzdłuż dwóch stron segmentu A3. Za pomocą mikrotomu przygotuj ultra cienki fragment próbki, zaczynając od szóstego mięśnia.

Po pokrojeniu przymocuj jak najwięcej plasterków do każdej siatki miedzianej. Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby obserwować próbki. Spośród żywicy Lowicryl K4M i żywicy epoksydowej, żywica Lowicryl K4M zapewniła ostrzejsze i łatwiejsze do zaobserwowania wyniki mięśni ciała Drosophila.

Obrazowanie konfokalne wykazało lepszą wizualizację połączenia nerwowo-mięśniowego między szóstym a siódmym mięśniem. Transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła przypominające koraliki połączenia nerwowo-mięśniowe, oferujące lepsze informacje o strukturze synaptycznej. Próbki pozostały płaskie przez cały proces odwadniania ze względu na ograniczenie metalowych oczek.

Poza tym próbki zostały spolimeryzowane między produktami z tworzyw sztucznych, zapobiegając ich składaniu. W przyszłości metoda przygotowania próbki TEM może zostać zastosowana do neuropilu mózgu i brzusznego rdzenia nerwowego, zwiększając w ten sposób potencjał badań ultrastrukturalnych.