Name: Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy BN-PAGE. Ta metoda pozwala ocenić złożenie kompleksów fosforylacji oksydacyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bibliotece Uniwersyteckiej w Helsinkach dziękujemy za wsparcie finansowe w wydawaniu.

spaUWAGA: Ten protokół jest oparty na powiązanej publikacji Hilander et al.13 .
1. Przygotowanie i roztworów
UWAGA: Wszystkie i rozwiązania użyte w protokole są podsumowane w Tabeli 1. Podane objętości są wystarczające do przygotowania i przeprowadzenia 10 próbek. Wszystkie mogą być przechowywane w temperaturze +4 °C przez okres do jednego roku. 
<ol>
	<li>Przygotować 20 ml 3x buforu żelowego zawierającego 1,5 M kwasu aminokapronowego, 150 mM Bis-tris w wodzie destylowanej (dH2O). Dostosuj pH do 7,0.</li>
	<li>Przygotować 10 ml 2 M kwasu aminokapronowego w dH2O.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml buforu mitochondrialnego, łącząc następujące elementy: 0,5 ml 3x buforu żelowego, 0,5 ml 2 M kwasu aminokapronowego i 4 μl 500 mM EDTA.</li>
	<li>Przygotować 1 000 ml buforu katodowego zawierającego 15 mM Bis-tris i 50 mM trycyny w dH2O. Dostosować pH do 7,0.
	<ol>
		<li>Przygotować 200 ml buforu z niebieską katodą, dodając 0,04 g niebieskiego G-250 Coomassie do 200 ml buforu katodowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 000 ml buforu anodowego zawierającego 50 mM Bis-tris w dH2O. Dostosować pH do 7,0.</li>
	<li>Przygotować 2,5 ml buforu do próbek zawierającego 750 mM kwasu aminokapronowego i 5% błękitu Coomassie G-250 w dH2O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lizatów mitochondrialnych
<ol>
	<li>Umieść komórki na płytce dzień przed pobraniem. W przypadku komórek HEK293 lub 143B należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą, 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze +37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO2 . Upewnij się, że w dniu pobrania na każdą próbkę przypada co najmniej 500 000 komórek.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki raz lodowatym PBS. Unikaj odrywania komórek od płytki. Zeskrobać komórki i granulować je w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. </li>
	<li>Przemyć osad komórkowy dwukrotnie lodowatym PBS i odwirować jak w kroku 2.2. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą komercyjnego zestawu. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. 
	UWAGA: Po pobraniu komórek wykonaj wszystkie kroki w temperaturze +4 °C i nie wiruj. </li>
	<li>Przygotuj 20 ml PBS z inhibitorem proteazy, dodając 200 μl 100x inhibitora proteazy do 20 ml PBS. Trzymaj na lodzie. Zawiesić komórki w PBS z inhibitorem proteazy do końcowego stężenia białka 5 mg / ml.
	<ol>
		<li>Aby obliczyć objętość PBS z inhibitorem proteazy potrzebną do ponownego zawieszenia komórek w dawce 5 mg/ml, należy obliczyć ilość białka w każdej próbce. Do tego obliczenia należy wykorzystać stężenie białka zmierzone w kroku 2.3 oraz objętość PBS użytą do ponownego zawieszenia komórek po myciu w kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy. Dodać 3,3 mM digitoniny do końcowego stężenia 1,65 mM. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy, rozpuścić 4 mg digitoniny w 1 ml PBS w temperaturze 100 °C do momentu, gdy nie będzie widoczny osad i natychmiast schłodzić na lodzie. Dodać 10 μl 100x inhibitora proteazy do 1 ml roztworu digitoniny. 
		UWAGA: Stosować wyłącznie świeży roztwór digitoniny. 
		UWAGA: Digitonina jest toksyczna! Używaj maski na twarz, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać PBS z inhibitorem proteinazy (przygotowanym w kroku 2.4) do końcowej objętości 1,5 ml. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. Usunąć supernatant. Na tym etapie mitochondria są granulowane. </li>
	<li>Ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze mitochondrialnym. Objętość buforu mitochondrialnego stanowi połowę objętości PBS w kroku 2.4.</li>
	<li>Przygotować świeży 10% maltozyd laurylowy w PBS zawierający inhibitor proteazy (przygotowany w kroku 2.4). 1 ml wystarcza na 10 próbek. Dodać 10% maltozydu laurylu do końcowego stężenia 1%. Inkubuj na lodzie przez 15 minut (ten krok może być dłuższy do kilku godzin).</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze +4 °C. Zebrać supernatant do nowej probówki. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą zestawu. Dodać bufor próbki, objętość stanowiącą połowę objętości maltozydu laurylowego użytego w kroku 2.8. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie żelu gradientowego dla BN-PAGE
<ol>
	<li>Wlać żel gradientowy do BN-PAGE w temperaturze pokojowej. Umieść ekspres do gradientu na płytce mieszającej i podłącz go elastyczną rurką do pompy perystaltycznej. Podłączyć zestaw do infuzji z igłą do rurki. Umieść mieszadło magnetyczne w proksymalnej komorze ekspresu gradientu. Myć rurki za pomocądH2O przy maksymalnej prędkości obrotowej pompy przez 10 minut.</li>
	<li>Opróżnij rurkę i ekspres do gradientów. Za pomocą pipety usunąć resztki dH2O w kanale między komorami urządzenia do tworzenia gradientów. Zamknij kanał i rurkę za pomocą zaworu.</li>
	<li>Za pomocą ramy odlewniczej i zacisków zmontuj dwie szklane płytki w uchwycie, który ma otwór na dole, i umieść go na stojaku. Upewnij się, że znajduje się mniej więcej na prostej powierzchni z bilansem wodnym. Umieść igłę podłączoną do rurki między szklanymi płytkami. </li>
	<li>Przygotować 6% i 15% roztwory żelu (Tabela 2). Trzymaj na lodzie. Na końcu dodać nadsiarczan amonu (APS) i tetrametylenodiaminę (TEMED) (rozpoczynają polimeryzację). Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Załaduj proksymalny koniec komory rurkowej mieszalnika z gradientowym żelem 6% żelu, a dystalny koniec 15% żelu. Całkowita objętość żelu powinna być równa objętości żelu rozdzielającego między szklanymi płytkami. Dlatego użyj 2,6 ml 6% żelu i 2,1 ml 15% żelu do gradientowego miksera do żelu na jeden żel o wymiarach 8,3 cm x 7,3 cm.</li>
	<li>Włącz mieszadło magnetyczne i otwórz rurkę i kanał między komorami ekspresu gradientów. Natychmiast włączyć pompę perystaltyczną na 5 ml/min. Napełnij szklane płytki i nie pozwól, aby bąbelki dostały się do żelu. Wyjmij igłę, gdy w rurki nie ma żelu.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć na żel dH2O. Żel należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w celu polimeryzacji.</li>
	<li>Natychmiast po nalaniu żelu należy umyć rurkę wypełniając komory gradientowedH2Oi używając pompy perystaltycznej na maksymalnych obrotach. Przygotowując dwa i więcej żeli, zawsze czyść system pomiędzy nimi.</li>
	<li>Przygotować 1x bufor żelowy, mieszając 3 ml 3x buforu żelowego i dodać 6 ml dH2O. Delikatnie usuń dH2O z powierzchni żelu bibułą filtracyjną. Umyj powierzchnię żelu 1x buforem żelowym. Delikatnie usuń 1x bufor żelowy bibułą filtracyjną.
	<ol>
		<li>Unikaj włókien z bibuły filtracyjnej na żelu. Aby to zapewnić, pokrój papier na małe kawałki nożyczkami, ale nie rozdzieraj papieru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść grzebień między szklanymi płytkami, ale nie zanurzaj go całkowicie, aby móc wlać żel do układania pod grzebieniem. Przygotować 4% żel do układania w stos (Tabela 2). Dodaj APS i TEMED na końcu, ponieważ łatwo rozpoczynają polimeryzację. Mieszaj delikatnie, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Nałóż żel do układania, unikając pęcherzyków pod grzebieniem, i całkowicie zanurz grzebień. Pozwól żelowi do układania polimeryzować przez co najmniej 30 minut. Wyjmij grzebień i umyj studzienki 1x buforem żelowym za pomocą pipety.
	<ol>
		<li>Po polimeryzacji żel można przechowywać w temperaturze +4 °C przez kilka dni. Aby przechowywać żel, zawiń żel w papier nasączonydH2Oi folią z tworzywa sztucznego, aby zapobiec wysychaniu żelu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Niebieska elektroforeza w natywnym żelu
UWAGA: Aby zapobiec degradacji kompleksów OXPHOS, uruchom elektroforezę w temperaturze +4 °C. Użyj wstępnie schłodzonych. 
<ol>
	<li>Załaduj kasetę z żelem buforem z niebieską katodą aż do dna studzienek. Ładowanie próbek jest łatwiejsze, gdy kaseta nie jest wypełniona do góry. Umyj studzienki buforem z niebieską katodą, a następnie napełnij studzienki buforem z niebieską katodą za pomocą pipety.</li>
	<li>Załaduj próbki (5-30 μg białka) do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik z buforem anodowym.</li>
	<li>Uruchom żel na 15 minut przy stałym napięciu 40 V. Następnie zwiększ napięcie do 80 V (lub użyj stałego prądu 6 mA), nie przekraczaj 10 mA. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu.</li>
	<li>Zastąp bufor niebieskiej katody buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż skończy się czoło barwnika. W sumie elektroforeza trwa około 3 godzin.</li>
	<li>Pobrać szklane płytki i przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą półsuchego blottingu. Używaj stałego napięcia 25 V i prądu ograniczonego do 1,0 A przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, użyj mokrego blottingu, aby przenieść kompleksy OXPHOS do membrany PVDF. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj blokowanie błony i inkubację przeciwciał zgodnie ze standardowym protokołem immunoblottingu. Pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko podjednostkom kompleksów OXPHOS należy stosować sekwencyjnie. 
	UWAGA: Na przykład należy użyć przeciwciała anty-NDUFA9 (1:2000) dla kompleksu I, przeciwciała anty-SDHA (1:2000) dla kompleksu II, przeciwciała anty-UQCRC2 (1:1000) dla kompleksu III, przeciwciała anty-COX1 (1:2000) dla kompleksu IV i przeciwciała anty-ATP5A (1:2000) dla kompleksu V. Wykaz przeciwciał znajduje się w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>

<ol><li>Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice%2C+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function.</a> Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).</li>
<li>Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in aging.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3662-3670 (2018).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. , (2018).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+oxidative+phosphorylation+system+in+humans%3A+what+we+have+learned+by+studying+its+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).</li>
<li>Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mammalian+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+and+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Gotz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+identifies+mitochondrial+alanyl-tRNA+synthetase+mutations+in+infantile+mitochondrial+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy.</a> American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gradient+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).</li>
<li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28BN-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Preston, C. .C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-induced+alterations+in+gene+transcripts+and+functional+activity+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+complexes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).</li>
<li>Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Protein+Synthesis%3A+De+Novo+Translation%2C+Steady-State+Levels%2C+and+Assembled+OXPHOS+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+In+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes.</a> Current Protocols In Toxicology. , e56(2018).</li>
<li>Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%3A+Structures%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).</li>
<li>Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF+in+the+mitochondria%3A+the+last+frontier%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">ARF in the mitochondria: the last frontier?</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 7 (23), 3641-3646 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).</li>
<li>Konovalova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+GRPEL2+nucleotide+exchange+factor+for+mitochondrial+HSP70+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone.</a> Redox Biology. 19, 37-45 (2018).</li>
<li>Konovalova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+arginine+analog+canavanine+induces+aberrant+mitochondrial+translation+products%2C+mitoribosome+stalling%2C+and+instability+of+the+mitochondrial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).</li>
<li>Ahmed, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+quantitative+quadruple+immunofluorescent+assay+to+diagnose+isolated+mitochondrial+Complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Jedną z najbardziej krytycznych części protokołu jest zachowanie nienaruszonych kompleksów OXPHOS podczas przygotowywania, przechowywania i elektroforezy żelowej. W związku z tym mitochondria należy wyizolować w temperaturze +4 °C, a próbki nie powinny być poddawane cyklom zamrażania i rozmrażania. Kompleksy OXPHOS tolerują tylko jeden cykl zamrażania i rozmrażania podczas całej procedury. Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania niszczą kompleksy OXPHOS (ryc. 1B). Próbki kontrolne i doświadczalne, które mają być porównywane, powinny być przygotowywane równolegle, aby uniknąć jakichkolwiek różnic w warunkach przechowywania, które mogłyby dać mylące wyniki. Jeżeli nie jest możliwe wykonanie wszystkich etapów protokołu równolegle ze wszystkimi próbkami, zalecamy zamrożenie umytych granulek komórek w temperaturze -80 °C (krok 1.4 w niniejszym protokole), a następnie przeprowadzenie pozostałej części protokołu dla wszystkich próbek razem, co najmniej do momentu elektroforezy żelowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na czystość aparatu do elektroforezy (zbiornik, kaseta). Jeśli ten sam aparat jest używany do SDS-PAGE, umyj go bardzo dobrze przed BN-PAGE. Wszelkie resztki SDS mogą powodować dysocjację kompleksów OXPHOS podczas elektroforezy.
Wysokiej jakości żele gradientowe to kolejna krytyczna część protokołu. Prefabrykaty żelowe dla niebieskiej natywnej strony są dostępne na rynku; Nie zaleca się jednak ich stosowania, ponieważ stosowane w żelach dostępnych na rynku mogą mieć skład inny niż do próbek. Gradient zastosowanego żelu (6-15%) jest optymalny do separacji poszczególnych kompleksów OXPHOS. Aby wykryć struktury supramolekularne wyższego rzędu OXPHOS, znane również jako superkompleksy łańcucha oddechowego14, wymagana jest pewna optymalizacja11.
Do wizualizacji kompleksów OXPHOS należy stosować specyficzne przeciwciała sekwencyjnie, w oparciu o ich właściwości. Na przykład najpierw użyj przeciwciała, które daje najsłabszy sygnał, a przeciwciała z najsilniejszym sygnałem na końcu. Jest to ważne, ponieważ usuwanie osłabia detekcję (rysunek 1D). Skład kompleksów łańcuchów oddechowych można zbadać, jeśli po BN-PAGE żel zostanie poddany działaniu drugiego wymiaru SDS-PAGE15.
Opisany tutaj protokół sugeruje sekwencyjne stosowanie przeciwciał przeciwko poszczególnym kompleksom OXPHOS. Jednak dostępny na rynku koktajl przeciwciał OXPHOS może być używany do jednoczesnego wykrywania wszystkich pięciu kompleksów OXPHOS. Niemniej jednak, aby móc wykryć niekompletnie złożone kompleksy OXPHOS i określić ich tożsamość, przeciwciała przeciwko poszczególnym kompleksom OXPHOS powinny być stosowane sekwencyjnie. Ten krok jest czasochłonny; Może to być jednak niezbędne do testowania nowych warunków i modeli eksperymentalnych.
Stężenie digitoniny stosowanej do izolacji mitochondriów powinno być zoptymalizowane dla określonego typu komórki. Jako detergent digitonina przenika przez błony komórkowe. Optymalne stężenie digitoniny skutecznie przenika przez błonę plazmatyczną komórek, pozostawiając nienaruszone błony mitochondrialne. Zbyt niskie stężenie digitoniny powoduje duże zanieczyszczenie ekstraktów mitochondrialnych, natomiast zbyt wysokie stężenie uszkadza błony mitochondrialne i zmniejsza całkowitą wydajność mitochondriów. Optymalny stosunek digitoniny do białka (g/g) waha się od 0,3 do 1. Analiza Western blot białek ekstrahowanych z osadów i supernatantów może być wykorzystana do zbadania optymalnego stężenia digitoniny16.
Protokół ten nie obejmuje kontroli obciążenia białka na immunoblot; W związku z tym stężenie białka w ekstrahowanych kompleksach powinno być dokładnie mierzone co najmniej w trzech egzemplarzach, aby zapewnić równe obciążenie. Ponadto próbki mogą być uruchamiane w BN-PAGE w replikacjach. Jeśli montaż selektywnych kompleksów OXPHOS jest zaburzony, nienaruszone kompleksy mogą służyć jako kontrole obciążenia.
Oszacowanie masy cząsteczkowej kompleksów białkowych w BN-PAGE jest trudne18. Obecny protokół nie obejmuje markera masy cząsteczkowej; w związku z tym, aby oszacować składanie się kompleksów OXPHOS, do analizy należy zawsze włączyć próbki kontrolne zawierające nienaruszone kompleksy. Próbkami kontrolnymi dla BN-PAGE są zwykle komórki niepoddane działaniu substancji lub komórki typu dzikiego.
Przedstawiona tutaj metoda jest zoptymalizowana pod kątem wykrywania mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego; Można go jednak również zastosować do oceny oligomeryzacji białek mitochondrialnych19. Ponadto szybkość składania kompleksów OXPHOS można badać, najpierw zubożając kodowaną przez mitochondria podjednostkę zawierającą kompleksy przez chloramfenikol, a następnie po ich odzyskaniu po usunięciu chloramfenikolu10. W związku z tym BN-PAGE może być wykorzystywany do oceny poziomów w stanie ustalonym i składania OXPHOS do różnych zastosowań, w tym do diagnostyki molekularnej ludzkich zaburzeń mitochondrialnych 9,11.

Mitochondria to wielofunkcyjne organelle odgrywające ważną rolę w produkcji energii, regulacji metabolizmu komórkowego, sygnalizacji, apoptozie, starzeniu się itd.1,2,3. Produkcja energii w mitochondriach opiera się na funkcji fosforylacji oksydacyjnej, która łączy oddychanie z syntezą ATP. W komórkach ludzkich mitochondrialny system fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) składa się z pięciu kompleksów. Kompleksy I-IV tworzą elektrochemiczny gradient protonów w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, który jest wykorzystywany przez kompleks V do produkcji ATP. Każdy kompleks OXPHOS jest multimeryczny i, z wyjątkiem kompleksu II, składa się z podjednostek kodowanych zarówno przez geny jądrowe, jak i mitochondrialne. Wszelkie defekty w podstawowych składnikach kompleksów OXPHOS spowodowane mutacjami lub stresem środowiskowym mogą zaburzać montaż i funkcjonalność systemu fosforylacji oksydacyjnej. Ponadto prawidłowy montaż funkcjonalnych kompleksów OXPHOS wymaga dużej liczby czynników montażowych4,5,6. 
Naturalna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) jest podstawową techniką umożliwiającą analizę nienaruszonych kompleksów białkowych i może być wykorzystana do badania składania kompleksów OXPHOS. Po pierwsze, mitochondria są izolowane od komórek przez digitoninę, która jest łagodnym detergentem, który przenika przez błonę plazmatyczną komórek. Następnie, za pomocą maltozydu laurylowego, kompleksy OXPHOS są uwalniane z błon mitochondrialnych. Za pomocą gradientowej elektroforezy żelowej kompleksy OXPHOS są rozdzielane ze względu na ich masę. Coomassie blue G-250 (nie R-250) dodany do buforu próbki i niebieski bufor katodowy dysocjuje związki detergentowo-labilne, ale zachowuje nienaruszone poszczególne kompleksy łańcuchów oddechowych8. Podczas elektroforezy bufor z niebieską katodą zawierający barwnik jest zastępowany buforem katodowym bez barwnika, co zapewnia wydajny transfer kompleksów OXPHOS do membrany PVDF8. Aby uwidocznić kompleksy OXPHOS, błonę PVDF inkubuje się sekwencyjnie z przeciwciałami odpowiadającymi wybranym podjednostkom pięciu kompleksów OXPHOS.
Opisana tutaj metoda, z pewnymi modyfikacjami, może być zastosowana do dowolnych hodowanych komórek. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy kompleksów OXPHOS w mitochondriach wyizolowanych z próbek tkanek 9. BN-PAGE wymaga co najmniej 5-10 μg mitochondriów dla każdej próbki na serię. Korzystając z opisanej tutaj metody, 500 000 hodowanych komórek, takich jak HEK293, SH-SY5Y lub komórki 143B, może wytworzyć około 10 μg mitochondriów. Jednak wystarczająca ilość komórek do analizy BN zależy od konkretnego typu komórki.
Najczęstszą metodą badania mitochondrialnych białek OXPHOS jest SDS-PAGE i western blotting. Jednak SDS-PAGE umożliwia badanie tylko pojedynczych podjednostek OXPHOS i, w przeciwieństwie do BN-PAGE, nie może być używany do oceny montażu całych kompleksów OXPHOS. Clear native-PAGE rozdziela kompleksy białkowe w warunkach natywnych bez obecności ujemnie naładowanego barwnika i ma znacznie niższą rozdzielczość w porównaniu do BN-PAGE. Jednak clear native-PAGE jest łagodniejszy niż BN-PAGE, dzięki czemu może zachować labilne supramolekularne zespoły kompleksów białkowych, takich jak superkompleksy OXPHOS, które są dysocjowane w warunkach BN-PAGE10. W tym protokole żel gradientowy służy do oddzielania kompleksów; Alternatywnie, separacja bez gradientu może być użyta, jeśli stosunkowo drogi kreator gradientów nie jest dostępny11. 
Ważne, opisana tutaj metoda pozwala na analizę montażu kompleksów OXPHOS, podczas gdy funkcjonalność kompleksów nie jest oceniana. Wysokowydajny BN-PAGE, a następnie test aktywności w żelu11, a także spektrofotometryczny test aktywności enzymatycznej kompleksów mitochondrialnych12 są skutecznymi technikami analizy funkcjonalnej kompleksów OXPHOS. Jednak obie te metody nie oznaczają składania kompleksów OXPHOS.
Tak więc, BN-PAGE jest optymalną metodą do badania montażu poszczególnych kompleksów OXPHOS. Na przykład niektóre zaburzenia mitochondrialne, takie jak dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera (LHON), encefalopatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizody podobne do udaru (MELAS), są związane ze zmienionym montażem jednego lub więcej składników systemu OXPHOS5. Za pomocą opisanej tu metody BN-PAGE można badać mechanizmy molekularne chorób mitochondrialnych.

<table><tbody><tr><td>Płytki komórkowe 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid/Bis 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas aminokapronowy</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>14748</td><td>Kompleks V podjednostka</td></tr><tr><td>Anty-MTCOI</td><td>Abcam</td><td>14705</td><td>Podjednostka kompleksu VI</td></tr><tr><td>Anty-NDUFA9</td><td>Abcam</td><td>14713</td><td>Podjednostka</td></tr> kompleksu I <tr><td>Anty-SDHA</td><td>Abcam</td><td>14715</td><td>Podjednostka kompleksu II</td></tr><tr><td>Anty-UQCRC2</td><td>Abcam</td><td>14745</td><td>Podjednostka kompleksu III</td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B7535</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Bradford</td><td>Skrobaki do komórek BioRad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>11597692</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F/12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologie</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>(Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker</td><td>Bio-Rad</td><td>1654120</td><td></td></tr><tr><td>Lauryl maltoside (n-Dodecyl &beta;-D-maltoside)</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EPS 301</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Thermo Scientific 10137963</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot turbo mini PVDF</td><td>BioRad</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T9784</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy aparat do elektroforezy</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu blue native polyacrylamide i immunoblottingu

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Oddychanie mitochondrialne odbywa się za pomocą kompleksów fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w mitochondriach. Czynniki wewnętrzne i środowiskowe mogą zaburzać montaż i stabilność kompleksów OXPHOS. Protokół ten opisuje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) w zastosowaniu do hodowanych komórek ludzkich. Najpierw mitochondria są ekstrahowane z komórek za pomocą digitoniny, a następnie za pomocą maltozydu laurylowego izolowane są nienaruszone kompleksy OXPHOS z błon mitochondrialnych. Kompleksy OXPHOS są następnie rozpuszczane przez gradientową elektroforezę żelową w obecności ujemnie naładowanego barwnika, błękitu Coomassie, który zapobiega agregacji białek i zapewnia elektroforetyczną ruchliwość kompleksów białkowych w kierunku katody. Wreszcie, kompleksy OXPHOS są wykrywane za pomocą standardowego immunoblottingu. W związku z tym BN-PAGE jest wygodną i niedrogą techniką, która może być stosowana do oceny montażu całych kompleksów OXPHOS, w przeciwieństwie do podstawowej SDS-PAGE pozwalającej na badanie tylko pojedynczych podjednostek kompleksu OXPHOS.

Za pomocą techniki BN-PAGE można badać defekty w montażu kompleksów mitochondrialnego OXPHOS. Rysunek 1A przedstawia montaż kompleksów łańcucha oddechowego w ludzkich komórkach neuroblastoma (SH-SY5Y) traktowanych chloramfenikolem, który specyficznie hamuje translację podjednostek OXPHOS kodowanych przez mtDNA. Chloramfenikol spowodował ubytek kompleksów OXPHOS zawierających podjednostki kodowane mitochondrialnie (kompleks I, III, IV; Rysunek 1A), podczas gdy kompleks II, który jest kodowany wyłącznie przez geny jądrowe, uległ kompensacyjnej nadekspresji. Kompleks V nie był w tym przypadku analizowany metodą immunoblottingu.
Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania niszczą kompleksy OXPHOS. Rysunek 1B obrazuje degradację kompleksów OXPHOS spowodowaną cyklami zamrażania i rozmrażania. Kompleksy oddechowe mitochondriów w próbce 3, która została poddana wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania, wykazują niższą intensywność prążków oraz przesunięcie w porównaniu do tych samych próbek zamrożonych tylko raz. Nieprzycięte zdjęcie western blot z Rysunku 1B przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.
Jakość żelu jest istotna dla uzyskania ostrych i wyraźnych prążków. Rysunek 1C przedstawia immunoblot z żelu, który nie spolimeryzował się prawidłowo. Stripping membrany może również wpływać na detekcję kompleksów OXPHOS. Na Rysunku 1D kompleks I został wykryty przed oraz po strippingu. Stosunek sygnału do szumu jest znacznie niższy po przeprowadzeniu strippingu.
<img alt="Analiza Western blot; porównanie kompleksów I-IV; wynik w formie wykresu słupkowego; eksperymentalna ekspresja białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Immunobloty BN-PAGE z eksperymentów pomyślnych i suboptymalnych. (A) Wyczerpanie kompleksów OXPHOS przez inhibitor translacji mitochondrialnej. Ludzkie komórki neuroblastoma (SH-SY5Y) traktowano chloramfenikolem (CAP) przez 48 godzin. CTRL, komórki kontrolne bez traktowania chloramfenikolem. Dolny panel przedstawia kwantyfikację immunoblotu. Wartość kontroli przyjęto jako 1 (wyznaczona linią przerywaną). Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 3, *P &lt; 0,0001 w porównaniu z kontrolą przy użyciu nieparzystych testów t-Studenta. (B) Rozpad kompleksów OXPHOS spowodowany wielokrotnymi cyklami zamrażania i rozmrażania. Próbki 1-3 przygotowano z ludzkich komórek osteosarcoma (143B) w tych samych warunkach. Próbki nr 1 i 2 zamrożono i rozmrożono tylko raz, natomiast próbka nr 3 poddana była czterem cyklom zamrażania i rozmrażania. (C) Immunobloty BN-PAGE kompleksów OXPHOS wyizolowanych z komórek HEK293. Rozmycie prążków jest spowodowane niską jakością żelu. (D) Wpływ strippingu na detekcję kompleksów OXPHOS. Detekcja Kompleksu I w ludzkich komórkach neuroblastoma (SH-SY5Y) przed i po strippingu tej samej membrany. Kompleksy OXPHOS wykryto przy użyciu przeciwciała przeciwko NDUFA9 (kompleks I), przeciwciała przeciwko SDHA (kompleks II), przeciwciała przeciwko UQCRC2 (kompleks III) oraz przeciwciała przeciwko COX1 (kompleks IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufor lub roztwór</td>
			<td>Skład</td>
			<td>Receptura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">bufor do żelu 3x</td>
			<td>1,5 M kwas aminokapronowy</td>
			<td>3,94 g kwasu aminokapronowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mM Bis-tris</td>
			<td>0,63 g Bis-tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Dodać dH2O2Oto 20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,0</td>
			<td>Dostosować pH do wartości 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Bufor katodowy</td>
			<td>15 mM Bis-tris</td>
			<td>3,14 g Bis-tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM tricyny</td>
			<td>8,96 g tricyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Dodać dH2O2Od 0 do 1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,0</td>
			<td>Dostosować pH do wartości 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Niebieski bufor katodowy</td>
			<td>0,02% błękitu Coomassie G</td>
			<td>0,04 g barwnika Serva blue G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mM Bis-tris</td>
			<td rowspan="4">200 ml buforu katodowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM tricyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Bufor anodowy</td>
			<td>50 mM Bis-tris</td>
			<td>20,93 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Dodać dH2O2Do 2000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,0</td>
			<td>Dostosować pH do wartości 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Bufor mitochondrialny</td>
			<td>1,75 M kwas aminokapronowy</td>
			<td>0,5 ml 3 x buforu do żelu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mM Bis-tris</td>
			<td>0,5 ml 2 M kwasu aminokapronowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM EDTA</td>
			<td>4 µL 500 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td> -</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,0</td>
			<td> -</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Bufor do próbek</td>
			<td>750 mM kwasu aminokapronowego</td>
			<td>0,94 ml 2 M kwasu aminokapronowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% błękit Coomassie G</td>
			<td>0,125 g Serva blue G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Dodać $\text{dH}_2\text{O}$2Około 2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2M kwas aminokapronowy</td>
			<td>2 M kwas aminokapronowy</td>
			<td>2,62 g kwasu aminokapronowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Dodać dH2O2Od 0 do 10 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Bufory i roztwory użyte do BN-PAGE.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Żele Blue native</td>
			<td>Żel rozdzielający 6%</td>
			<td>Żel rozdzielający 15%</td>
			<td>Żel zgromadzający 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do żelu 3x</td>
			<td>3,3 ml </td>
			<td>3,3 ml</td>
			<td>1,64 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% akrylamidu/bis-akrylamidu 37,5:1</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>3,75 mL</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>5,14 ml</td>
			<td>0,93 ml</td>
			<td>2,77 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>0</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% persiarczan amonu*</td>
			<td>60 µL</td>
			<td>10 µL </td>
			<td>60 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>4 µL</td>
			<td>2 µL</td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Zawsze przygotowuj świeży 10% roztwór nadtlenosiarczanu amonu w dH2O2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Składy żeli do BN-PAGE.
Rycina uzupełniająca 1. Nieprzycięty obraz western blot z ryciny 1B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia analizę kompleksów w takcie mitochondrialnego systemu fosforylacji oksydacyjnej. Jest to wygodna i niedroga technika, którą można wykorzystać do nakładania na siebie całych kompleksów mitochondrialnego systemu fosforylacji oksydacyjnej. Aby przygotować lizaty mitochondrialne, najpierw użyj lodowatego roztworu PBS, aby delikatnie umyć komórki.Zeskrob komórki i opluj je w czterech stopniach Celsjusza w temperaturze 800 G przez 10 minut. Następnie dwukrotnie przemyć osad komórkowy lodowatym PBS i odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 800 G przez 10 minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 100x inhibitora proteazy do 20 mililitrów PBS.Ponownie zawiesić komórki w mieszaninie inhibitorów proteazy PBS do końcowego stężenia białka wynoszącego pięć miligramów na mililitr. Aby przygotować 3,3 milimolową digitoninę w PBS z inhibitorem proteazy, rozpuść cztery miligramy digitoniny w jednym mililitrze PBS w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aż nie będzie widoczny osad. Natychmiast schłodzić na lodzie i dodać 10 mikrolitrów 100x inhibitora proteazy do jednego mililitra roztworu digitoniny.Następnie dodaj mieszaninę inhibitora proteazy digitoniny do komórek o końcowym stężeniu 1,65 milimola. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj mieszaninę inhibitorów proteazy PBS do komórek do końcowej objętości 1,5 mililitra.Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 10 000 G przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze mitochondrialnym. Przygotuj jeden mililitr świeżego 10% lorealu zamontowanego w roztworze inhibitora PBS.Dodać 10% loreal montazowany do mitochondriów w końcowym stężeniu 1%Inkubować na lodzie przez co najmniej 15 minut. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 20 000 G przez 20 minut. Zebrać supernatant do nowej probówki i dodać bufor do próbki.Aby przygotować żel gradientowy na niebieską stronę natywną, najpierw umieść ekspres do gradientu na płytce mieszającej i podłącz go elastyczną rurką do pompy perystaltycznej. Przymocować zestaw infuzyjny z igłą do rurki. Umieść mieszadło magnetyczne w proksymalnej komorze ekspresu gradientu i myj rurki wodą destylowaną z maksymalną prędkością pompy przez 10 minut.Następnie opróżnij rurkę i ekspres do gradientów. Użyj pipety, aby usunąć resztki wody destylowanej w kanale między komorami drukarki gradientów. Zamknij kanał i rurkę za pomocą zaworu.Zamontuj dwie szklane płytki w uchwycie i umieść je na stojaku. Korzystając z otworu w dolnej części uchwytu na żel, umieść igłę podłączoną do rurki między szklanymi płytkami. Aby zrobić żel o wymiarach 8,3 na 7,3 centymetra, najpierw przygotuj 6% i 15% roztwory żelu i trzymaj je na lodzie.Wymieszaj je delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie załaduj proksymalny koniec komory rurkowej mieszalnika żelu gradientowego 2,6 mililitra 6% żelu, a dystalny koniec 2,1 mililitra 15% żelu. Następnie włącz mieszadło magnetyczne i otwórz rurkę oraz kanał między komorami gradientu.Natychmiast włącz pompę perystaltyczną na pięć mililitrów na minutę. Napełnij szklane płytki i wyjmij igłę, gdy w rurki nie ma żelu. Delikatnie pokryj żel wodą destylowaną i utrzymuj żel w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.Rurkę należy natychmiast umyć, napełniając komory gradientowe wodą destylowaną i używając pompy perystaltycznej z maksymalną prędkością. Dodaj sześć mililitrów wody destylowanej do trzech mililitrów 3x buforu żelowego, aby uzyskać 1x bufor żelowy. Za pomocą bibuły filtracyjnej delikatnie usuń wodę destylowaną z powierzchni żelu.Umyj powierzchnię żelu 1x buforem żelowym i delikatnie usuń bufor bibułą filtracyjną. Przygotuj 4% żel do układania w stos zgodnie z rękopisem. Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.Następnie umieść grzebień między szklanymi płytkami i wlej żel do układania pod grzebieniem. Całkowicie zanurz grzebień. Pozwól żelowi do układania polimeryzować przez co najmniej 30 minut.Następnie wyjmij grzebień i za pomocą pipety umyj studzienki 1x buforem żelowym. Aby wykonać elektroforezę z niebieskim natywnym żelem, najpierw dodaj bufor z niebieską katodą do kasety żelowej. Za pomocą pipety umyj i napełnij studzienki niebieskim buforem katodowym.Następnie załaduj od pięciu do 30 mikrogramów próbek białka do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik buforem anodowym. Najpierw uruchom żel przy stałym napięciu 40 woltów przez 15 minut.Następnie zwiększ napięcie do 80 woltów. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu. Zastąp bufor niebieskiej katody buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż czoło barwnika spłynie z żelu.Pobrać szklane płytki i przenieść białka do membrany PVDF za pomocą półsuchego osuszania. Używaj stałego napięcia 25 woltów i prądu ograniczonego do jednego ampera przez 30 minut. Tworzenie kompleksów łańcucha oddechowego w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego zostało zahamowane po leczeniu chloramfenikolem w porównaniu z komórkami kontrolnymi bez leczenia.W przeciwieństwie do tego, kompleksy kodowane przez geny jądrowe były regulowane w górę. Degradację kompleksów fosforylacji oksydacyjnej zaobserwowano po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania. Jakość żelu może mieć wpływ na wykrywanie kompleksów fosforylacji oksydacyjnej.Ponadto usunięcie membrany obniżyło stosunek sygnału do szumu. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o przeprowadzeniu prostego przygotowania i elektroforezy żelowej w niskich temperaturach, aby zachować w pełni działające kompleksy OXPHOS. Po niebieskiej stronie natywnej, druga strona SDS może być zastosowana do badania podjednostek białkowych kompleksów łańcuchów oddechowych.Niebieska strona natywna pozwala naukowcom badać składanie kompleksów, a nawet superkompleksów systemu fosforylacji oksydacyjnej.

analysis-mitochondrial-respiratory-chain-complexes-cultured-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Drożdże rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe stają się atrakcyjnym modelem do badania mitochondriów. W tym miejscu opisujemy protokół analizy obfitości i składania mitochondrialnych kompleksów oddechowych w S. pombe. Umożliwia to scharakteryzowanie nowych funkcji konserwatywnych genów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym.

Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Poznaj analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy BN-PAGE. Ta metoda pozwala ocenić złożenie kompleksów fosforylacji oksydacyjnej.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu (Wideo) | JoVE Journal

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Przeglądaj więcej filmów