Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia analizę kompleksów w takcie mitochondrialnego systemu fosforylacji oksydacyjnej. Jest to wygodna i niedroga technika, którą można wykorzystać do nakładania na siebie całych kompleksów mitochondrialnego systemu fosforylacji oksydacyjnej. Aby przygotować lizaty mitochondrialne, najpierw użyj lodowatego roztworu PBS, aby delikatnie umyć komórki.

Zeskrob komórki i opluj je w czterech stopniach Celsjusza w temperaturze 800 G przez 10 minut. Następnie dwukrotnie przemyć osad komórkowy lodowatym PBS i odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 800 G przez 10 minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 100x inhibitora proteazy do 20 mililitrów PBS.

Ponownie zawiesić komórki w mieszaninie inhibitorów proteazy PBS do końcowego stężenia białka wynoszącego pięć miligramów na mililitr. Aby przygotować 3,3 milimolową digitoninę w PBS z inhibitorem proteazy, rozpuść cztery miligramy digitoniny w jednym mililitrze PBS w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aż nie będzie widoczny osad. Natychmiast schłodzić na lodzie i dodać 10 mikrolitrów 100x inhibitora proteazy do jednego mililitra roztworu digitoniny.

Następnie dodaj mieszaninę inhibitora proteazy digitoniny do komórek o końcowym stężeniu 1,65 milimola. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj mieszaninę inhibitorów proteazy PBS do komórek do końcowej objętości 1,5 mililitra.

Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 10 000 G przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze mitochondrialnym. Przygotuj jeden mililitr świeżego 10% lorealu zamontowanego w roztworze inhibitora PBS.

Dodać 10% loreal montazowany do mitochondriów w końcowym stężeniu 1%Inkubować na lodzie przez co najmniej 15 minut. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 20 000 G przez 20 minut. Zebrać supernatant do nowej probówki i dodać bufor do próbki.

Aby przygotować żel gradientowy na niebieską stronę natywną, najpierw umieść ekspres do gradientu na płytce mieszającej i podłącz go elastyczną rurką do pompy perystaltycznej. Przymocować zestaw infuzyjny z igłą do rurki. Umieść mieszadło magnetyczne w proksymalnej komorze ekspresu gradientu i myj rurki wodą destylowaną z maksymalną prędkością pompy przez 10 minut.

Następnie opróżnij rurkę i ekspres do gradientów. Użyj pipety, aby usunąć resztki wody destylowanej w kanale między komorami drukarki gradientów. Zamknij kanał i rurkę za pomocą zaworu.

Zamontuj dwie szklane płytki w uchwycie i umieść je na stojaku. Korzystając z otworu w dolnej części uchwytu na żel, umieść igłę podłączoną do rurki między szklanymi płytkami. Aby zrobić żel o wymiarach 8,3 na 7,3 centymetra, najpierw przygotuj 6% i 15% roztwory żelu i trzymaj je na lodzie.

Wymieszaj je delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie załaduj proksymalny koniec komory rurkowej mieszalnika żelu gradientowego 2,6 mililitra 6% żelu, a dystalny koniec 2,1 mililitra 15% żelu. Następnie włącz mieszadło magnetyczne i otwórz rurkę oraz kanał między komorami gradientu.

Natychmiast włącz pompę perystaltyczną na pięć mililitrów na minutę. Napełnij szklane płytki i wyjmij igłę, gdy w rurki nie ma żelu. Delikatnie pokryj żel wodą destylowaną i utrzymuj żel w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.

Rurkę należy natychmiast umyć, napełniając komory gradientowe wodą destylowaną i używając pompy perystaltycznej z maksymalną prędkością. Dodaj sześć mililitrów wody destylowanej do trzech mililitrów 3x buforu żelowego, aby uzyskać 1x bufor żelowy. Za pomocą bibuły filtracyjnej delikatnie usuń wodę destylowaną z powierzchni żelu.

Umyj powierzchnię żelu 1x buforem żelowym i delikatnie usuń bufor bibułą filtracyjną. Przygotuj 4% żel do układania w stos zgodnie z rękopisem. Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.

Następnie umieść grzebień między szklanymi płytkami i wlej żel do układania pod grzebieniem. Całkowicie zanurz grzebień. Pozwól żelowi do układania polimeryzować przez co najmniej 30 minut.

Następnie wyjmij grzebień i za pomocą pipety umyj studzienki 1x buforem żelowym. Aby wykonać elektroforezę z niebieskim natywnym żelem, najpierw dodaj bufor z niebieską katodą do kasety żelowej. Za pomocą pipety umyj i napełnij studzienki niebieskim buforem katodowym.

Następnie załaduj od pięciu do 30 mikrogramów próbek białka do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik buforem anodowym. Najpierw uruchom żel przy stałym napięciu 40 woltów przez 15 minut.

Następnie zwiększ napięcie do 80 woltów. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu. Zastąp bufor niebieskiej katody buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż czoło barwnika spłynie z żelu.

Pobrać szklane płytki i przenieść białka do membrany PVDF za pomocą półsuchego osuszania. Używaj stałego napięcia 25 woltów i prądu ograniczonego do jednego ampera przez 30 minut. Tworzenie kompleksów łańcucha oddechowego w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego zostało zahamowane po leczeniu chloramfenikolem w porównaniu z komórkami kontrolnymi bez leczenia.

W przeciwieństwie do tego, kompleksy kodowane przez geny jądrowe były regulowane w górę. Degradację kompleksów fosforylacji oksydacyjnej zaobserwowano po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania. Jakość żelu może mieć wpływ na wykrywanie kompleksów fosforylacji oksydacyjnej.

Ponadto usunięcie membrany obniżyło stosunek sygnału do szumu. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o przeprowadzeniu prostego przygotowania i elektroforezy żelowej w niskich temperaturach, aby zachować w pełni działające kompleksy OXPHOS. Po niebieskiej stronie natywnej, druga strona SDS może być zastosowana do badania podjednostek białkowych kompleksów łańcuchów oddechowych.

Niebieska strona natywna pozwala naukowcom badać składanie kompleksów, a nawet superkompleksów systemu fosforylacji oksydacyjnej.