Name: Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj analizę ekspresji i składania kompleksów mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach Schizosaccharomyces pombe. Metoda SDS-PAGE i BN-PAGE pozwala badać rolę genu shy1 w funkcji mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Ying Huang i dr Ying Luo za ich wsparcie. Praca ta była wspierana przez granty (32270048 dla J. S. i 31900403 dla G. F.) z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin.

1. Przygotowanie sferoplastów S. pombe 
<ol>
	<li>Hoduj 1 l komórek S. pombe w podłożu z ekstraktem drożdżowym z suplementami (YES) (Tabela 1) dla określonego szczepu (WT lub Δshy1) od OD600 = 0,05 do OD600 = 1,0, 
	UWAGA: Nie hoduj komórek S. pombe z OD600 więcej niż 2,0, ponieważ są one trudne do strawienia przez enzymy lityczne w celu utworzenia sferoplastów. Zarówno szczepy typu dzikiego (WT), jak i zmutowane geny mogą być uprawiane równolegle, aby uzyskać porównywalne wyniki.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zawiesić granulowane komórki w 500 ml ddH2O, a komórki w granulkach przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 1x.</li>
	<li>Zmierz mokrą masę osadu komórkowego (około 2 g dla 1,000 OD600 komórek). Zawieś komórki w 8 ml 1x buforu S (Tabela 2; 4 ml buforu S / g komórek). Dodać ditiotreitol (DTT) do 10 mM i fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) do 1 mM na świeżo.</li>
	<li>Dodaj enzymy lityczne do zawiesiny komórkowej, aby strawić ścianę komórkową S. pombe. Obracać w wytrząsarce w temperaturze 30 °C przez czas zależny od zastosowanego enzymu litycznego. 
	UWAGA: Prawidłowe trawienie ściany komórkowej jest kluczowym krokiem do wyizolowania wysokiej jakości mitochondriów.
	<ol>
		<li>W przypadku enzymu lizującego dodać 100 mg proszku na g mokrej masy komórek i inkubować przez około 2 godziny. W przypadku litikazy dodać 10 mg proszku na g mokrej masy i inkubować przez około 1 godzinę. W przypadku Zymolyase-20T/100T dodać 5 mg/1 mg proszku na g mokrej masy i inkubować przez około 1 godzinę. W przypadku Lallzyme MMX dodać 1 g proszku na g mokrej masy i inkubować przez około 0,5 godziny. W przypadku enzymu Vinotaste dodaj 1 g proszku na g mokrej masy i inkubuj przez około 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj powstawanie sferoplastów za pomocą mikroskopii (obiektyw 40x). Weź 20 μl zawiesiny komórkowej w buforze S i dodaj do 1 ml ddH2O, sprawdź, czy większość komórek jest uszkodzona (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). 
	UWAGA: Normalne komórki S. pombe mają kształt pręcików (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Ponad 80% sferoplastów w buforze S, po efektywnym trawieniu, powinno stać się okrągłe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Feroplasty osadów przez wirowanie przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Zawiesić sferoplasty w 8 ml lodowatego buforu 1x S i przemyć 2x. Delikatnie zawiesić sferoplasty za pomocą pipet z odciętymi końcówkami.</li>
</ol>
2. Mechaniczna homogenizacja sferoplastów S. pombe 
<ol>
	<li>Zawiesić sferoplasty w 8 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego 1x (Tabela 3; 4 ml buforu homogenizacyjnego / g komórek) z 1x inhibitorami proteazy. Przenieś komórki do wstępnie schłodzonego homogenizatora szklanego (młynek do tkanek z tłuczkiem i probówką).</li>
	<li>Homogenizuj komórki mechanicznie, wykonując około 15 ruchów w górę iw dół za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka. Aby zapobiec degradacji białek mitochondrialnych, należy unikać pęcherzyków powietrza podczas udarów i zawsze inkubować bufor homogenizacyjny i homogenizator na lodzie. 
	UWAGA: Istnieją dwa rodzaje tłuczków ze szczelnym i luźnym dopasowaniem do probówki. Jeśli używany jest luźny tłuczek, może być potrzebnych do 25 uderzeń. Liczba uderzeń powinna być zoptymalizowana, ponieważ zbyt wiele uderzeń może uszkodzić błony mitochondrialne, a zbyt mało uderzeń zmniejsza wydajność mitochondriów.</li>
	<li>Sprawdź uszkodzoną błonę komórkową w sferoplastach za pomocą mikroskopu (obiektyw 40x). 
	UWAGA: Większość sferoplastów traci kształt refrakcyjny i staje się komórkami duchowymi w buforze homogenizacyjnym. Mitochondria są nadal nienaruszone.</li>
</ol>
3. Izolacja mitochondriów S. pombe przez wirowanie
<ol>
	<li>Przenieść homogenizowaną zawiesinę do probówek wirówkowych i osadów w postaci nieuszkodzonych komórek i zanieczyszczeń przez odwirowanie przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować otrzymany supernatant przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i uzyskać jądra osadu. Powtarzaj ten krok 1x, aż nie będzie tworzenia się osadów.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych probówek wirówkowych i mitochondriów osadów oraz innych zanieczyszczonych organelli przez odwirowanie przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) (Tabela 4). Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu przepłukania mitochondriów.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu 1x SEM i podzielić mitochondria na przyszłe eksperymenty. 
	UWAGA: Ten pastylka zawiera surowe mitochondria. Można go przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszych eksperymentów SDS-PAGE i BN-PAGE. Surowe mitochondria można również oczyścić przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy do innych celów eksperymentalnych.</li>
</ol>
4. SDS-PAGE i immunoblotting białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego
<ol>
	<li>Zmierz całkowite stężenie białka w podwielokrotności mitochondriów za pomocą zestawu do kwantyfikacji białka BCA, rozcieńczając zawiesinę mitochondriów około 25-krotnie.</li>
	<li>Dodać bufor ładujący SDS-PAGE do 40 μl całkowitych białek mitochondrialnych. Denaturacja białek poprzez inkubację przez wskazany czas w odpowiedniej temperaturze.
	<ol>
		<li>Aby wykryć S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 i Atp6, denaturuj białka mitochondrialne w temperaturze 45 °C przez 3 minuty. Aby wykryć S. pombe Cox2 i Hsp60, należy denaturować białka mitochondrialne w temperaturze 90 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj około 20 μg (około 4 μL) białek mitochondrialnych do 12% żelu SDS-PAGE. Wykonaj immunoblotting mitochondrialnych białek łańcucha oddechowego za pomocą odpowiednich przeciwciał, jak opisano w kroku 615. 
	UWAGA: Białka S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 i Atp6 są kodowane przez mtDNA, co jest trudne do edycji, jak znakowanie wspólnym epitopem nawet w S. pombe. W związku z tym do wykrycia tych białek wymagane są specyficzne przeciwciała. Aby zweryfikować czystość i integralność izolowanych mitochondriów, te białka łańcucha oddechowego mogą być jednocześnie testowane w supernatancie, który powinien zawierać białka cytoplazmatyczne i jądrowe. I odwrotnie, reprezentatywne białka cytoplazmatyczne i jądrowe, takie jak aktyna i histon H3, można przetestować w próbce mitochondriów.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki mitochondrialnej dla BN-PAGE
<ol>
	<li>Osad mitochondrialny z poprzednich podwielokrotności w kroku 3.5 przez wirowanie przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Do analizy BN-PAGE należy użyć 2 mg białek mitochondrialnych (około 400 μl podwielokrotności mitochondriów).</li>
	<li>Zawiesić mitochondria w 200 μl 3x buforu żelowego BN-PAGE (1,5 M kwasu 6-aminokaprolowego; 150 mM Bis-Tris, pH 7,0, skorygowane HCl). Dodać 2 μL 100x PMSF i 1 μL 1 M MgCl2. Odwirować zawiesinę przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad mitochondriów w 160 μl 5% (w/v) digitoniny (DG) lub 64 μl 5% (w/v) n-dodecylo-β-D-maltopyranozydu (DDM). Inkubować na lodzie przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut.
	<ol>
		<li>W pierwszych próbach na S. pombe dodaj 4 mg detergentu DG na mg białek mitochondrialnych w celu rozpuszczenia błon mitochondrialnych w celu utrzymania superkompleksów łańcuchów oddechowych. Dodaj 1,6 mg detergentu DDM na mg białek mitochondrialnych, aby oddzielić poszczególne kompleksy mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Dostosuj stężenie leczenia DG i DDM, zwiększając lub zmniejszając 2-krotnie, zgodnie z początkowymi wynikami różnych kompleksów białkowych w BN-PAGE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować zawiesinę przez 5 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant i zmierzyć stężenie rozpuszczonego białka za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego BCA.</li>
	<li>Dodać 80 μl (1/2 objętości detergentu) 3x buforu do próbek BN-PAGE (tabela 5) do około 160 μl supernatantu poddanego działaniu DG lub dodać 32 μl (1/2 objętości detergentu) 3x buforu do próbki BN-PAGE do około 64 μl supernatantu poddanego działaniu DDM. 
	UWAGA: W przeciwieństwie do SDS-PAGE, próbki białka BN-PAGE nie mogą być denaturowane przez gotowanie.</li>
</ol>
6. BN-PAGE i immunoblotting mitochondrialnych łańcuchów oddechowych
<ol>
	<li>Złóż prefabrykowany natywny żel Bis-Tris (gradient 3%-12%). Alternatywnie, przygotuj ręcznie robiony natywny żel Bis-Tris (gradient 3%-12%), mieszając 3% i 12% żel BN-PAGE (Tabela 6) w mikserze gradientowym.</li>
	<li>Załaduj próbki białek poddane działaniu DG lub DDM oraz marker białka o wysokiej masie cząsteczkowej dla natywnego PAGE.
	<ol>
		<li>Do analizy BN-PAGE mitochondrialnych kompleksów mitochondrialnych potrzebnych jest łącznie 100 μg rozpuszczonych białek mitochondrialnych. Załadować około 12 μl próbki białka poddanej działaniu DG lub 5 μl próbki białka poddanej działaniu DDM do żelu BN-PAGE. Dostosuj objętość wsadu, aby upewnić się, że intensywność kontroli obciążenia, takiego jak białko macierzy mitochondrialnej Mcp60 (Hsp60), jest równa dla wszystkich próbek po końcowej ekspozycji15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom żel przy stałym napięciu/prądzie 80 V/6 mA przez około 30 minut za pomocą bufora katodowego z 0,02% (w/v) Coomassie G-250. Następnie wymień niebieski bufor katodowy na bufor katodowy bez Coomassie G-250 i kontynuuj pracę ze stałym prądem 10 mA przez około 3 godziny, aż front niebieskiego barwnika Coomassie G-250 dotrze do dna żelu.
	<ol>
		<li>Aby zapobiec degradacji lub rozpadowi mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, żel ze wstępnie schłodzonymi należy uruchomić w temperaturze 4 °C. W przypadku żelu prefabrykowanego należy użyć prefabrykowanego bufora bieżącego. Do ręcznie robionego żelu użyj 1x bufora anodowego BN-PAGE (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, regulowany HCl) i 1x bufor katodowy BN-PAGE (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, regulowany HCl; 50 mM Tricine).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetnij pas żelu załadowany markerem białkowym. Wybarwić marker buforem Coomassie R-250 przez 15 min. Odplamiaj, aż znacznik będzie widoczny. 
	UWAGA: Marker białkowy o wysokiej masie cząsteczkowej dla natywnej PAGE nie jest wstępnie barwiony. Będzie to widoczne po zabarwieniu Coomassie R-250.</li>
	<li>Zanurz drugą część żelu w 1x buforze transferowym BN-PAGE (Tabela 7) w celu zrównoważenia 30 min. Przepłucz tę samą wielkość membrany PVDF 0,45 μm 100% metanolem i zanurz ją w buforze transferowym BN-PAGE w celu zrównoważenia na 10 minut. Przenieś białka w żelu na membranę 0,45 μm PVDF pod stałym prądem 300 mA przez 2 godziny 
UWAGA: Membrana nitrocelulozowa (NC) nie jest zalecana, ponieważ membrana NC bardzo ściśle wiąże barwnik Coomassie G-250.</li>
	<li>Przepłucz membranę PVDF 100% metanolem, aby wypłukać niebieski barwnik Coomassie G-250. Inkubować membranę PVDF w 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, dostosowany HCl; 150 mM NaCl) buforze blokującym zawierającym 5% (w/v) odtłuszczonego mleka przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Inkubować błonę PVDF ze wskazanymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kompleksom mitochondrialnych łańcuchów oddechowych S. pombe przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Stężenie przeciwciała Cob1 do wykrywania kompleksu III wynosi 1: 1,000. Stężenie przeciwciała Cox1 do wykrywania kompleksu IV wynosi 1: 2,000. Stężenie przeciwciała Atp6 do wykrywania kompleksu V wynosi 1: 200.</li>
	<li>Przemyć membranę PVDF 1x buforem TBST (Tabela 8). Inkubować błonę PVDF z przeciwciałem drugorzędowym w stężeniu 1: 10 000 przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przemyć membranę PVDF za pomocą 1x bufora TBST. Odświetl i zeskanuj membranę PVDF. Dopasuj naświetlony obraz żelu BN-PAGE do obrazu natywnego markera białkowego, aby oszacować masę cząsteczkową mitochondrialnych kompleksów i superkompleksów łańcucha oddechowego.</li>
</ol>

<ol><li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+mitochondria+to+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Getting mitochondria to center stage.</a> Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disease.</a> Lancet. 368 (9529), 70-82 (2006).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondria%3A+an+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondria: an overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Res. 18 (5), (2018).</li>
<li>Kühl, I., Dujeancourt, L., Gaisne, M., Herbert, C. J., Bonnefoy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome+wide+study+in+fission+yeast+reveals+nine+PPR+proteins+that+regulate+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">A genome wide study in fission yeast reveals nine PPR proteins that regulate mitochondrial gene expression.</a> Nucl Acid Res. 39 (18), 8029-8041 (2011).</li>
<li>Uehara, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+nutritional+phenotypes+of+fission+yeast+mutants+defective+in+genes+encoding+essential+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple nutritional phenotypes of fission yeast mutants defective in genes encoding essential mitochondrial proteins.</a> Open Biol. 11 (4), 200369(2021).</li>
<li>Mori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+fission+yeast%2C+65+non-essential+mitochondrial+proteins+related+to+respiration+and+stress+become+essential+in+low-glucose+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Rl+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">In fission yeast, 65 non-essential mitochondrial proteins related to respiration and stress become essential in low-glucose conditions.</a> Rl Soc Open Sci. 10 (10), 230404(2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Rich, P. R., Maréchal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain.</a> Essays Biochem. 47, 1-23 (2010).</li>
<li>Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%3A+Structures%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 76, 179-190 (2018).</li>
<li>Guan, S., Zhao, L., Peng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes%3A+From+Structure+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes: From Structure to Function.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 13880(2022).</li>
<li>Luttik, M. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+NDE1+and+NDE2+Genes+Encode+Separate+Mitochondrial+NADH+Dehydrogenases+Catalyzing+the+Oxidation+of+Cytosolic+NADH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 Genes Encode Separate Mitochondrial NADH Dehydrogenases Catalyzing the Oxidation of Cytosolic NADH.</a> J Biol Chem. 273 (38), 24529-24534 (1998).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+AMID+Homologue+Ndi1p+Displays+Respiration-restricted+Apoptotic+Activity+and+Is+Involved+in+Chronological+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respiration-restricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging.</a> Mol Biol Cell. 17 (4), 1802-1811 (2006).</li>
<li>Malecki, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+genes+required+for+respiratory+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Rese%22%5BJournal%5D)">Identifying genes required for respiratory growth of fission yeast.</a> Wellcome Open Rese. 1, 12(2016).</li>
<li>Luo, Y., Xu, Y., Ahmad, F., Feng, G., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Shy1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homolog+of+human+SURF1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of Shy1, the Schizosaccharomyces pombe homolog of human SURF1.</a> Sci Rep. 14 (1), 21678(2024).</li>
<li>Wang, Y., Feng, G., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Schizosaccharomyces+pombe+DEAD-box+protein+Mss116+is+required+for+mitoribosome+assembly+and+mitochondrial+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The Schizosaccharomyces pombe DEAD-box protein Mss116 is required for mitoribosome assembly and mitochondrial translation.</a> Mitochondrion. 76, 101881(2024).</li>
<li>Izawa, T., Unger, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Meth Mol Biol. 1567, 33-42 (2017).</li>
<li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mitochondria+from+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Mitochondria from Yeast Cells.</a> J Vis Exp. (30), e1417(2009).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Meth Enzymol. 260 (C), 190-202 (1995).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Meth Cell Biol. (65), 231-244 (2001).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Lemaire, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+respiratory+chain+complexes+from+Saccharomyces+cerevisiae+wild-type+and+mutant+mitochondria+activity+measurement+and+subunit+composition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis.</a> Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).</li>
<li>Konovalova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Complexes+in+Cultured+Human+Cells+using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+and+Immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting.</a> J Vis Exp. (144), e59269(2019).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+Analysis+of+Multiprotein+Complexes+from+Cellular+Lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Flor-Parra, I., Zhurinsky, J., Bernal, M., Gallardo, P., Daga, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lallzyme+MMX-based+rapid+method+for+fission+yeast+protoplast+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A Lallzyme MMX-based rapid method for fission yeast protoplast preparation.</a> Yeast. 31 (2), 61-66 (2014).</li>
<li>Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Between+the+oxa1+and+rmp1+Genes+Modulates+Respiratory+Complex+Assembly+and+Life+Span+in+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina.</a> Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy konfliktu interesów.

W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji mitochondriów S. pombe i wykonywania SDS-PAGE i BN-PAGE w celu analizy ekspresji i składania kompleksów mitochondrialnych białek łańcucha oddechowego.
Koimmunoprecypitacja (co-IP) jest powszechnie stosowana do wykrywania składania kompleksów białkowych; jednak dla co-IP wyzwaniem jest wykrycie składania białek błony mitochondrialnej. Zamiast tego BN-PAGE ma kilka zalet: (i) niektóre przeciwciała nie mogą rozpoznać epitopów ukry...

Mitochondria odgrywają ważną rolę w różnorodnych procesach biologicznych, takich jak oddychanie komórkowe w celu uzyskania energii, metabolizm odżywczy i śmierć komórki1. Nieprawidłowe działanie mitochondriów jest związane z chorobami mózgu, mięśni i rozwoju2,3. Dlatego badania nad mitochondriami są niezbędne do poprawy starzenia się i zdrowia człowieka.
Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) od dawna wykorzystywane do badania funkcji genów w mitochondriach4, ponieważ mutanty drożdży z wadliwym oddychaniem mogą nadal wytwarzać energię potrzebną do przetrwania poprzez fermentację. Jest jednak drobno dodatni i może się namnażać bez mitochondrialnego DNA (mtDNA). W związku z tym mutanty genów z defektami ekspresji genów mitochondrialnych często tracą swoje mtDNA, co komplikuje dalsze badania. Natomiast drożdże rozszczepialne Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), które są ewolucyjnie odległe od S. cerevisiae, są drożdżami drobno ujemnymi, które wymagają mtDNA do przeżycia. Co więcej, organizacja mtDNA i mitochondrialnego mRNA S. pombe jest podobna do tych u wyższych eukariontów5. Wiele (96) niezbędnych genów u S. pombe, w porównaniu do tylko sześciu niezbędnych genów u S. cerevisiae, jest wymaganych do ekspresji genów mitochondrialnych6. W związku z tym S. pombe staje się atrakcyjnym modelem do badania nowych funkcji genów w mitochondriach. Jednak liczba publikacji badających mitochondria u S. cerevisiae jest około 100-krotnie większa niż u S. pombe, a zgłoszone metody i protokoły badające mitochondria u S. pombe są również rzadkie7.
Mitochondrialny łańcuch oddechowy jest kluczowy dla produkcji energii komórkowej i służy jako rdzeń mitochondriów8. Składa się z kompleksów łańcuchów oddechowych I-V, takich jak oksydoreduktaza NADH-ubichinon (kompleks I), dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II), oksydoreduktaza ubichinon-cytochrom c lub kompleks cytochromu bc1 (kompleks III), oksydaza cytochromu c (kompleks IV) i syntaza ATP (kompleks V), wraz z dwoma pośrednimi substratami przenoszącymi elektron, ubichinonem (CoQ) i cytochromem c (Cyt c)9. Oddziałują one również na siebie i tworzą superkompleksy wyższego rzędu, których mechanizmy składania pozostają w dużej mierze niejasne10,11. Jednak S. pombe nie ma kompleksu I, który może być zastąpiony przez zewnętrzne dehydrogenazy NADH Nde1 i wewnętrzne Ndi112,13,14. Genom mitochondrialny S. pombe koduje podjednostkę kompleksu III (Cob1), trzy podjednostki kompleksu IV (Cox1, Cox2, Cox3) i trzy podjednostki kompleksu V (Atp6, Atp8, Atp9)15,16. Niedawno informowaliśmy, że na ekspresję i składanie kompleksów tych białek wpływa delecja helikazy RNA Mss116 (Δmss116)16 i czynnika składania Shy1 (Δshy1)15 w S. pombe, odpowiednio. Aby ułatwić odkrycie nowych funkcji większej liczby genów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym przy użyciu tych metod, tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół analizy poziomów ekspresji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) oraz analizy niebieskiej natywnej strony (BN-PAGE) kompleksów składających białka mitochondrialnego łańcucha oddechowego w S. pombe.
Uzasadnienie izolacji mitochondriów od S. pombe opiera się na metodach ustalonych w S. cerevisiae17. Feroplasty są najpierw przygotowywane przez trawienie ścian komórkowych drożdży. Są one homogenizowane mechanicznie, a mitochondria są frakcjonowane przez wirowanie różnicowe18. Następnie mitochondrialne białka łańcucha oddechowego są rozpuszczane i immunobiologizowane zgodnie z SDS-PAGE i BN-PAGE. Technika BN-PAGE została pierwotnie opracowana do rozdzielania mitochondrialnych białek błonowych, takich jak kompleksy łańcuchów oddechowych19,20,21. Białka błonowe z zachowanymi nienaruszonymi kompleksami są rozpuszczane przez łagodne niejonowe detergenty i ładowane anionowym barwnikiem Coomassie G-250. W ten sposób kompleksy białkowe są rozdzielane według ich masy w gradientowym natywnym gel22. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych u S. cerevisiae23 i komórkach ssaków24,25; jednak nie został szeroko zastosowany do mitochondriów S. pombe.
Zbiorczo, tutaj prezentujemy metodę, w której mitochondria są izolowane z komórek S. pombe, a białka mitochondrialnego łańcucha oddechowego są poddawane SDS-PAGE i BN-PAGE, a następnie immunoblottingowi. Eksperymentalny schemat blokowy przedstawiono na rysunku 1. Dzięki wysokiej jakości mitochondriom i przeciwciałom, metoda opisana w S. pombe może być również stosowana do innych organizmów w celu identyfikacji większej liczby genów pełniących funkcje w ekspresji i/lub składaniu kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych.

<table><tbody><tr><td>Kwas 6-aminokaprolokowy</td><td>Sangon</td><td>A430196</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis (37,5:1) 40%&nbsp;</td><td>Biolab</td><td>GS1374</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sangon</td><td>A100486</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Atp6</td><td>Bioworld</td><td>we własnym</td><td>zakresie IB: 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Cob1</td><td>Bioworld</td><td>we własnym</td> zakresie <td>IB: 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Cox1</td><td>Bioworld</td><td>we własnym</td><td>zakresie IB: 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Cox2</td><td>Bioworld</td><td>we własnym</td><td>zakresie IB: 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Cox3</td><td>Bioworld</td><td>we własnym zakresie</td><td>IB: 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Hsp60</td><td>Bioworld</td><td>we własnym</td><td>zakresie IB: 1:3000</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>LEAGENE</td><td>PT0001</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>YEASEN</td><td>60105ES25</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>SERVA</td><td>17524.01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Sangon</td><td>A100472</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sangon A100691</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Solarbio</td><td>E8030</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik gradientowy</td><td>Proso naukowe</td><td>MGM-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Solarbio</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>Marker białkowy o wysokiej masie cząsteczkowej do natywna STRONA</td><td>Real Times</td><td>RTD6142</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Alexa Fluor Plus 800 (przeciwciało wtórne przeciwko królikowi)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32735</td><td>IB: 1:10000</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 0,45 &mu; m Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPFL00005</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Młynek do tkanek Thermo</td><td>Fisher</td><td>K8853000015</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sangon</td><td>A610441</td><td></td></tr><tr><td>Lallzyme MMX</td><td>Lallemand</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Enzym lizujący</td><td>Sigma</td><td>L3768</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L4025</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sangon</td><td>A601336</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sangon</td><td>A421333</td><td></td></tr><tr><td>Native Bis-Tris Gels (prefabrykat)</td><td>Solarbio</td><td>PG41510-N</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sangon</td><td>A610425</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowany żel do biegania bufor do Native-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>PG00020-N</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy do ekstraktów drożdżowych</td><td>Beyotime</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sangon</td><td>A610498&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Vinotaste</td><td>Novozymes</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza</td><td>MP Biomedicals</td><td>320921</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych schizosaccharomyces pombe

Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Mitochondrialny łańcuch oddechowy jest kluczowy dla metabolizmu energii komórkowej, służąc jako rdzeń fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialny łańcuch oddechowy składa się z pięciu kompleksów enzymatycznych i ich oddziałujących na siebie superkompleksów. Analiza ekspresji i składania kompleksów tych białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji mitochondriów. Można to zbadać, łącząc metody biochemiczne i genetyczne w doskonałych drożdżach rozszczepienia organizmu modelowego Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), które zapewniają system kompensacyjny dla pączkujących drożdży do badań biologii mitochondriów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji mitochondriów S. pombe oraz analizę poziomów ekspresji i składania kompleksów mitochondrialnych białek oddechowych za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE) i niebieskiej natywnej PAGE (BN-PAGE). Krótko mówiąc, mitochondria z mutantów typu dzikiego i genów są oczyszczane, a następnie ich kompleksy są rozpuszczane i poddawane SDS-PAGE/BN-PAGE i immunoblottingowi. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie nowej funkcji genu w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym.

Wcześniej wykorzystaliśmy ten protokół do zbadania wpływu delecji genu shy1, homologu ludzkiego genu SURF1 u S. pombe, na ekspresję białek łańcucha oddechowego kodowanych przez mtDNA oraz na składanie kompleksów łańcucha oddechowego mitochondriów. Stwierdziliśmy, że poziomy stanu stacjonarnego białek Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 oraz Atp6 były znacznie obniżone w szczepie Δshy1 (Rycina 3), co wskazuje, że Shy1 jest niezbędny do ekspresji białek łańcucha oddecho...

Drożdże rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe stają się atrakcyjnym modelem do badania mitochondriów. W tym miejscu opisujemy protokół analizy obfitości i składania mitochondrialnych kompleksów oddechowych w S. pombe. Umożliwia to scharakteryzowanie nowych funkcji konserwatywnych genów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym.

Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe

The mitochondrial respiratory chain is crucial for cellular energy metabolism, serving as the core of oxidative phosphorylation. The mitochondrial ...

Zakres naszych badań dotyczy translacji białek mitochondrialnych i staramy się wyjaśnić mechanizmy, które wpływają na translację i składanie kompleksu mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Nasze badania wykazały, że shy1 odgrywa rolę w utrzymaniu regularnej funkcji mitochondriów, uczestnicząc w tworzeniu złożonych czterech naparów. Nasze laboratorium będzie badać mechanizm infuzji M=metotreksatu.[Narrator] Na początek zmierz mokrą masę osadu komórkowego Schizosaccharomyces pombe. Ponownie zawieś komórki w ośmiu mililitrach buforu S. Dodaj ditiotreitol do końcowego stężenia 10 milimoli i fluorek fenylometylosulfonylu do jednego milimola, upewniając się, że oba odczynniki są świeżo przygotowane. Dodaj enzymy lityczne do zawiesiny komórkowej, aby strawić ścianę komórkową Schizosaccharomyces pombe. Obracaj probówkę na wytrząsarce w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez czas zalecany dla określonego enzymu litycznego. Użyj mikroskopu, aby obserwować powstawanie sferoplastów. Następnie odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 1 000 G, w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby uzyskać granulki sferoplastów. Ponownie zawiesić osad w ośmiu mililitrach lodowatego buforu S. Po dwóch płukaniach ponownie zawiesić sferoplasty w ośmiu mililitrach lodowatego buforu homogenizacyjnego zawierającego inhibitory proteazy. Przenieść mieszaninę do wstępnie schłodzonego homogenizatora ze szkła puchowego zawierającego tłuczek i probówkę. Homogenizuj komórki mechanicznie, wykonując około 15 ruchów w górę iw dół za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka. Następnie zbadaj sferoplasty pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy membrana nie pękła. Teraz przenieś homogenizowaną zawiesinę do probówek wirówkowych. Wirować przez pięć minut w temperaturze 1,000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby osadzać nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia. Odwirować otrzymany supernatant przez pięć minut w temperaturze 3 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zawiesić jądra. Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek wirówkowych. Wirować przy 12 000 G przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zagnieździć mitochondria i inne organelle, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego buforu mopów sorbitolu EDTA po dekantacji supernatantu. Następnie ponownie odwirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby umyć mitochondria. Ponownie zawiesić ostatnią osadkę w jednym mililitrze lodowatego bufora do mopów EDTA z sorbitolem. Następnie podziel oczyszczone mitochondria na probówki do przyszłych eksperymentów. Na stronie SDS bufor ładujący do 40 mikrolitrów całkowitego białka mitochondrialnego. Denaturować białka poprzez inkubację mieszaniny przez wskazany czas w odpowiedniej temperaturze. Załaduj około 20 mikrogramów lub cztery mikrolitry białek mitochondrialnych do 12% żelu stronicowego SDS przed osuszeniem immunologicznym. Aby przygotować próbkę do strony BN, najpierw mitochondria osadów z poprzednich porcji przez odwirowanie. Ponownie zawiesić mitochondria w 200 mikrolitrach trzystronicowego żelowego buforu XBN. Następnie odpipetować dwa mikrolitry 100 X fluorku fenylometylosulfonylu i jeden mikrolitr jednego molowego chlorku magnezu. Ponownie odwirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad mitochondriów w 160 mikrolitrach 5% wagowo digitorum. Inkubować na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co 10 minut. Odwirowywać zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 20 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodać 80 mikrolitrów trzystronicowego bufora próbki XBN do próbki poddanej działaniu digitorum. Lub 32 mikrolitry do próbki poddanej działaniu DDM. Teraz złóż prefabrykowane natywne żele Bis-Tris o nachyleniu od 3 do 12%. Załaduj poddane działaniu substancji próbki białek wraz z markerami białkowymi o wysokiej masie cząsteczkowej do natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Uruchom żel przy stałym napięciu 80 woltów i prądzie sześciu miliamperów przez 30 minut za pomocą bufora katodowego zawierającego 0,02% Kumasi G250. Zastąp bufor buforem katodowym bez Kumasi i kontynuuj pracę z prędkością 10 miliamperów przez trzy godziny, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu. Przeciąć pas żelu zawierający marker białkowy. Zabarwić marker buforem Kumasi R250 przez 15 minut. Następnie odbarwiaj, aż pasma staną się widoczne. Zanurz pozostałą część żelu w buforze transferu strony BN na 30 minut, aby uzyskać równowagę. Przepłukać membranę kleksową PVDF o grubości 0,45 mikrometra metanolem i zrównoważyć w buforze transferowym przez 10 minut. Przenieś białka z żelu na membranę PVDF za pomocą stałego prądu 300 miliamperów przez dwie godziny. Przepłucz membranę PVDF metanolem, aby usunąć barwnik Kumasi. Następnie inkubować błonę w buforze blokującym TBS zawierającym 5% mleka odtłuszczonego przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Inkubować błonę PVDF z określonymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kompleksom mitochondrialnych łańcuchów oddechowych Schizosaccharomyces pombe. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przemyć membranę za pomocą buforu TBST. Następnie inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym w rozcieńczeniu od 1 do 10 000 przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po umyciu membrany buforem TBST należy odsłonić i zeskanować membranę PVDF, aby zobrazować wyniki immuno blot. Delecja genu shy1 doprowadziła do znacznego obniżenia poziomu białek łańcucha oddechowego kodowanych przez mitochondrialne DNA w stanie stacjonarnym, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 i Atp6. Analiza niebieskiej natywnej strony wykazała, że obfitość rozpuszczonych superkompleksów łańcucha oddechowego 3242 i 324 DG była zmniejszona w komórkach Delta shy1. Podczas gdy poziomy superkompleksów 32.= i 55N pozostały nienaruszone. Poziom rozpuszczonego kompleksu diametralnego 3 DDM pozostał niezmieniony w szczepie Delta shy1.

analysis-expression-complexes-assembly-mitochondrial-respiratory

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Ta praca wyjaśnia, jak przekształcić mitochondria drożdży za pomocą metody biolistycznej. Pokazujemy również, jak selekcjonować i oczyszczać transformanty oraz jak wprowadzić pożądaną mutację w docelowej pozycji w genomie mitochondrialnym.

Transformacja mitochondrialna w drożdżach piekarskich w celu zbadania translacji i składania kompleksów oddechowych

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Poznaj analizę ekspresji i składania kompleksów mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach Schizosaccharomyces pombe. Metoda SDS-PAGE i BN-PAGE pozwala badać rolę genu shy1 w funkcji mitochondriów.

Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe (Wideo) | JoVE Journal

Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe

Przeglądaj więcej filmów