Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe

Zakres naszych badań dotyczy translacji białek mitochondrialnych i staramy się wyjaśnić mechanizmy, które wpływają na translację i składanie kompleksu mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Nasze badania wykazały, że shy1 odgrywa rolę w utrzymaniu regularnej funkcji mitochondriów, uczestnicząc w tworzeniu złożonych czterech naparów. Nasze laboratorium będzie badać mechanizm infuzji M=metotreksatu.

[Narrator] Na początek zmierz mokrą masę osadu komórkowego Schizosaccharomyces pombe. Ponownie zawieś komórki w ośmiu mililitrach buforu S. Dodaj ditiotreitol do końcowego stężenia 10 milimoli i fluorek fenylometylosulfonylu do jednego milimola, upewniając się, że oba odczynniki są świeżo przygotowane. Dodaj enzymy lityczne do zawiesiny komórkowej, aby strawić ścianę komórkową Schizosaccharomyces pombe. Obracaj probówkę na wytrząsarce w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez czas zalecany dla określonego enzymu litycznego. Użyj mikroskopu, aby obserwować powstawanie sferoplastów. Następnie odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 1 000 G, w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby uzyskać granulki sferoplastów. Ponownie zawiesić osad w ośmiu mililitrach lodowatego buforu S. Po dwóch płukaniach ponownie zawiesić sferoplasty w ośmiu mililitrach lodowatego buforu homogenizacyjnego zawierającego inhibitory proteazy. Przenieść mieszaninę do wstępnie schłodzonego homogenizatora ze szkła puchowego zawierającego tłuczek i probówkę. Homogenizuj komórki mechanicznie, wykonując około 15 ruchów w górę iw dół za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka. Następnie zbadaj sferoplasty pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy membrana nie pękła. Teraz przenieś homogenizowaną zawiesinę do probówek wirówkowych. Wirować przez pięć minut w temperaturze 1,000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby osadzać nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia. Odwirować otrzymany supernatant przez pięć minut w temperaturze 3 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zawiesić jądra. Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek wirówkowych. Wirować przy 12 000 G przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zagnieździć mitochondria i inne organelle, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego buforu mopów sorbitolu EDTA po dekantacji supernatantu. Następnie ponownie odwirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby umyć mitochondria. Ponownie zawiesić ostatnią osadkę w jednym mililitrze lodowatego bufora do mopów EDTA z sorbitolem. Następnie podziel oczyszczone mitochondria na probówki do przyszłych eksperymentów. Na stronie SDS bufor ładujący do 40 mikrolitrów całkowitego białka mitochondrialnego. Denaturować białka poprzez inkubację mieszaniny przez wskazany czas w odpowiedniej temperaturze. Załaduj około 20 mikrogramów lub cztery mikrolitry białek mitochondrialnych do 12% żelu stronicowego SDS przed osuszeniem immunologicznym. Aby przygotować próbkę do strony BN, najpierw mitochondria osadów z poprzednich porcji przez odwirowanie. Ponownie zawiesić mitochondria w 200 mikrolitrach trzystronicowego żelowego buforu XBN. Następnie odpipetować dwa mikrolitry 100 X fluorku fenylometylosulfonylu i jeden mikrolitr jednego molowego chlorku magnezu. Ponownie odwirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad mitochondriów w 160 mikrolitrach 5% wagowo digitorum. Inkubować na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co 10 minut. Odwirowywać zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 20 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodać 80 mikrolitrów trzystronicowego bufora próbki XBN do próbki poddanej działaniu digitorum. Lub 32 mikrolitry do próbki poddanej działaniu DDM. Teraz złóż prefabrykowane natywne żele Bis-Tris o nachyleniu od 3 do 12%. Załaduj poddane działaniu substancji próbki białek wraz z markerami białkowymi o wysokiej masie cząsteczkowej do natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Uruchom żel przy stałym napięciu 80 woltów i prądzie sześciu miliamperów przez 30 minut za pomocą bufora katodowego zawierającego 0,02% Kumasi G250. Zastąp bufor buforem katodowym bez Kumasi i kontynuuj pracę z prędkością 10 miliamperów przez trzy godziny, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu. Przeciąć pas żelu zawierający marker białkowy. Zabarwić marker buforem Kumasi R250 przez 15 minut. Następnie odbarwiaj, aż pasma staną się widoczne. Zanurz pozostałą część żelu w buforze transferu strony BN na 30 minut, aby uzyskać równowagę. Przepłukać membranę kleksową PVDF o grubości 0,45 mikrometra metanolem i zrównoważyć w buforze transferowym przez 10 minut. Przenieś białka z żelu na membranę PVDF za pomocą stałego prądu 300 miliamperów przez dwie godziny. Przepłucz membranę PVDF metanolem, aby usunąć barwnik Kumasi. Następnie inkubować błonę w buforze blokującym TBS zawierającym 5% mleka odtłuszczonego przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Inkubować błonę PVDF z określonymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kompleksom mitochondrialnych łańcuchów oddechowych Schizosaccharomyces pombe. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przemyć membranę za pomocą buforu TBST. Następnie inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym w rozcieńczeniu od 1 do 10 000 przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po umyciu membrany buforem TBST należy odsłonić i zeskanować membranę PVDF, aby zobrazować wyniki immuno blot. Delecja genu shy1 doprowadziła do znacznego obniżenia poziomu białek łańcucha oddechowego kodowanych przez mitochondrialne DNA w stanie stacjonarnym, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 i Atp6. Analiza niebieskiej natywnej strony wykazała, że obfitość rozpuszczonych superkompleksów łańcucha oddechowego 3242 i 324 DG była zmniejszona w komórkach Delta shy1. Podczas gdy poziomy superkompleksów 32.= i 55N pozostały nienaruszone. Poziom rozpuszczonego kompleksu diametralnego 3 DDM pozostał niezmieniony w szczepie Delta shy1.