Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka
12 kwietnia 2019
Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.
Metoda ta zapewnia skuteczną strategię przygotowania funkcjonalnych rusztowań do badań nad nowotworami kości. Decellularyzacja macierzy zewnątrzcelularnej kości wykazała zmienną serokompatybilność dla przeżycia i aktywności komórek kostniakomięsaka. Główną zaletą tej techniki jest to, że hodowla komórek kostniakomięsaka w macierzy kostnej wykazuje wysoce niejednorodną morfologię, podobną do klinicznej histopatologii kostniakomięsaka.
Metoda ta stanowi idealny model do badania rozwoju, progresji wrażliwości na leki nowotworów kości, takich jak kostniakomięsak, mięsak Ewinga i inne nowotwory złośliwe z przerzutami do kości. Na początek zdobądź od czterech do sześciu tygodni myszy BALB / c, po eutanazji myszy za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych, odetnij świeżą kość strzałkową, piszczel i kość udową od tylnej kończyny. Za pomocą pęsety oderwij tkankę nabłonkową, a następnie usuń jak najwięcej tkanki miękkiej.
Opłucz kości nóg sterylnym roztworem 10 mM PBS dwukrotnie, aby usunąć krew z sześciocentymetrowego naczynia. Zanurz kości w naczyniu z 75% etanolem na trzy minuty, a następnie dwukrotnie spłucz PBS. Przechowuj czyste kości w sterylnej 50-mililitrowej probówce wirówkowej ze sterylną probówką PBS w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Zamrożone kości rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zamrozić w temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę. Poddaj kości więcej niż dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania w celu lizy komórek i rozpadu tkanek. Następnie umieść kości w sterylnej 50-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej 0,5 normalnego HCl i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem, aby zapewnić całkowite i równomierne pokrycie kości.
Po odwapnieniu całkowicie zdekantować roztwór kwasu solnego i opłukać kości pod bieżącą wodą przez godzinę. Następnie użyj wody destylowanej, aby umyć kości dwa razy po 15 minut na pranie na wytrząsarce orbitalnej. Całkowicie zdekantować roztwór.
Aby wyekstrahować lipidy w zdemineralizowanych kościach, umieść kości w 50-mililitrowej probówce wirówkowej z mieszaniną metanolu i chloroformu w proporcji 1:1. Owiń probówkę folią aluminiową, aby uniknąć światła, aby zapobiec rozkładowi chloroformu. I umieść rurkę na wytrząsarce orbitalnej na godzinę.
Następnie za pomocą pęsety przenieś kości do innej probówki z metanolem z folią aluminiową na 30 minut. Całkowicie usunąć metanol i przemyć wodą destylowaną dwukrotnie przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej. Zdekantować wodę do mycia końcowego i postępować w sterylnych warunkach.
Opłucz kości w sześciocentymetrowym naczyniu ze sterylnym PBS przez trzy minuty. Dodaj 40 mililitrów sterylnego 0,05% roztworu TE do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i inkubuj kości przez 23 godziny w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odrzucić roztwór TE i przepłukać dwukrotnie sterylnym PBS uzupełnionym 90 g/ml ampicyliny i 90 g/ml kanamycyny przez 15 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej.
Po całkowitym zdekantowaniu końcowego prania ponownie uzupełnij 40 mililitrami sterylnego PBS z antybiotykami. Dokładnie myć przez 24 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem, aby uzyskać skuteczną sterylizację porowatych przestrzeni. Następnie przenieś kości do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej sterylnym PBS z antybiotykami.
Przygotowaną macierz zewnątrzkomórkową kości można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa miesiące. Zanurz BEM w 75% etanolu w naczyniu i delikatnie potrząsaj naczyniem ręcznie przez 30 sekund. Następnie płucz PBS przez 30 sekund, dwukrotnie.
Przenieść BEM na czystą płytkę do hodowli komórkowej z sześciodołkiem. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Inkubować BEM przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Uzyskać ludzkie linie komórkowe OS w 100 mikrolitrach wstępnie podgrzanego PBS zawierającego wskaźnikową czerwień fenolową. Użyj pipety, aby zawiesić komórki OS o przybliżonym stężeniu 1 razy 10 do 5. Po całkowitym nasączeniu BEM w pożywce, z bliższych lub dystalnych nasad, przebić igłę do jamy rdzeniowej BEM i wstrzyknąć komórki OS do BEM.
Inkubować model OS-BEM przez co najmniej dwie godziny w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby upewnić się, że wstrzyknięte komórki ściśle przylegają do BEM. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora. Dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej na płytkę i przechowywać ją w inkubatorze przez noc, aby całkowicie pokryć powierzchnię kultury BEM.
Delikatnie przenieś model OS-BEM do nowego dołka z sześciodołkową płytką za pomocą sterylnej pęsety i ponownie nałóż jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej. Hoduj model przez 14 dni w inkubatorze. Podczas 14-dniowej inkubacji należy obserwować kolor podłoża.
Jeśli pożywka zmieni kolor na pomarańczowy lub nawet żółty, natychmiast odśwież pożywkę, odrzucając połowę starego podłoża i dodając nowe podłoże, aby utrzymać zdrowe środowisko dla komórek systemu operacyjnego. Monitoruj stan komórek pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Gdy komórki OS rozszerzą się na płytkę, delikatnie przenieś model OS-BEM do innego nowego dołka za pomocą sterylnej pęsety.
Po 14-dniowej hodowli delikatnie przepłukać model OS-BEM za pomocą PBS, aby usunąć pożywkę. Następnie przenieś do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 10% buforowaną formalinę w celu utrwalenia w celu identyfikacji histologicznej. Po demineralizacji i decelularyzacji BEM wydaje się być półprzezroczysty o większej sprężystości i wytrzymałości w porównaniu z rodzimą kością myszy.
Wyraźnie można zaobserwować niewielką pozostałość mięśniową w przestrzeni jamy szpikowej. Obrazowanie w jasnym polu natywnej kości i zdecelularizowanego BEM pokazuje dokładne usunięcie jąder komórkowych. Naturalna porowata struktura w ułożeniu sieci kolagenowej jest dobrze zachowana w bezkomórkowym BEM.
Dodatkowo, barwienie immunohistochemiczne Kolagenu I i Kolagenu IV pokazuje, że główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej są zachowane w piszczelowej myszy po decelularyzacji. Podczas 14-dniowej hodowli zarówno okostna, jak i śródstopie są infiltrowane przez ekspansję komórek OS. Komórki OS na zdecelularyzowanym BEM wykazują wysoce heterogeniczną morfologię podobną do cech cytopatologicznych odcinka OS.
Analiza immunohistochemiczna po hodowli w modelu BEM przez 14 dni wykazuje duże zalety w hodowlach długoterminowych. Ponadto komórki OS i hodowla BEM wykazują wysoką ekspresję glikoproteiny macierzy kostnej, która jest specyficzna dla macierzy kostnej. Ten trójwymiarowy model in vitro został wykorzystany do zademonstrowania fenotypowej heterogeniczności i mechanizmu regulacyjnego dedyferencjacji kostniakomięsaka z sukcesem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
Model macierzy pozakomórkowej kości (BEM) dla osteosarcoma (OS) jest ustanawiany jako odpowiednie rusztowisko do naśladowania wzrostu pierwotnego guza in vitro. Ten model pomaga w badaniu histologicznej i cytogenetycznej heterogeniczności OS.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Badania nad nowotworami kości
- Osteosarcoma
- Histopatologia
Tło
- Model BEM jest kluczowy dla zrozumienia osteosarcoma.
- Matrice pozakomórkowa kości bez komórek wykazuje zmienną serokompatybilność.
- Komórki osteosarcoma wykazują heterogeniczną morfologię w tym modelu.
- Ten model odbija kliniczną histopatologię osteosarcoma.
Cel badania
- Badanie rozwoju i progresji nowotworów kości.
- Ocena wrażliwości na leki w osteosarcoma i powiązanych guzach.
- Dostarczanie funkcjonalnego rusztowisku dla badań in vitro.
Stosowane metody
- Przygotowanie decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej kości.
- Hodowla komórek osteosarcoma w macierzy pochodzenia kostnego.
- Wykorzystanie myszy BALB/c do uzyskania próbek kości.
- Techniki chirurgiczne do przygotowania tkanek.
Główne wyniki
- Komórki osteosarcoma hodowane w modelu BEM wykazują heterogeniczną morfologię.
- Model naśladuje kliniczną histopatologię osteosarcoma.
- Zmienna serokompatybilność wspiera przeżywalność i aktywność komórek.
- Dostarcza wglądu w wrażliwość na leki i progresję guza.
Konkluzje
- Model BEM jest skuteczny w badaniu osteosarcoma.
- Oferuje realistyczne środowisko dla badań in vitro.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie biologii nowotworów kości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
