Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka
April 12th, 2019
Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.
Metoda ta zapewnia skuteczną strategię przygotowania funkcjonalnych rusztowań do badań nad nowotworami kości. Decellularyzacja macierzy zewnątrzcelularnej kości wykazała zmienną serokompatybilność dla przeżycia i aktywności komórek kostniakomięsaka. Główną zaletą tej techniki jest to, że hodowla komórek kostniakomięsaka w macierzy kostnej wykazuje wysoce niejednorodną morfologię, podobną do klinicznej histopatologii kostniakomięsaka.
Metoda ta stanowi idealny model do badania rozwoju, progresji wrażliwości na leki nowotworów kości, takich jak kostniakomięsak, mięsak Ewinga i inne nowotwory złośliwe z przerzutami do kości. Na początek zdobądź od czterech do sześciu tygodni myszy BALB / c, po eutanazji myszy za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych, odetnij świeżą kość strzałkową, piszczel i kość udową od tylnej kończyny. Za pomocą pęsety oderwij tkankę nabłonkową, a następnie usuń jak najwięcej tkanki miękkiej.
Opłucz kości nóg sterylnym roztworem 10 mM PBS dwukrotnie, aby usunąć krew z sześciocentymetrowego naczynia. Zanurz kości w naczyniu z 75% etanolem na trzy minuty, a następnie dwukrotnie spłucz PBS. Przechowuj czyste kości w sterylnej 50-mililitrowej probówce wirówkowej ze sterylną probówką PBS w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Zamrożone kości rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zamrozić w temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę. Poddaj kości więcej niż dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania w celu lizy komórek i rozpadu tkanek. Następnie umieść kości w sterylnej 50-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej 0,5 normalnego HCl i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem, aby zapewnić całkowite i równomierne pokrycie kości.
Po odwapnieniu całkowicie zdekantować roztwór kwasu solnego i opłukać kości pod bieżącą wodą przez godzinę. Następnie użyj wody destylowanej, aby umyć kości dwa razy po 15 minut na pranie na wytrząsarce orbitalnej. Całkowicie zdekantować roztwór.
Aby wyekstrahować lipidy w zdemineralizowanych kościach, umieść kości w 50-mililitrowej probówce wirówkowej z mieszaniną metanolu i chloroformu w proporcji 1:1. Owiń probówkę folią aluminiową, aby uniknąć światła, aby zapobiec rozkładowi chloroformu. I umieść rurkę na wytrząsarce orbitalnej na godzinę.
Następnie za pomocą pęsety przenieś kości do innej probówki z metanolem z folią aluminiową na 30 minut. Całkowicie usunąć metanol i przemyć wodą destylowaną dwukrotnie przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej. Zdekantować wodę do mycia końcowego i postępować w sterylnych warunkach.
Opłucz kości w sześciocentymetrowym naczyniu ze sterylnym PBS przez trzy minuty. Dodaj 40 mililitrów sterylnego 0,05% roztworu TE do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i inkubuj kości przez 23 godziny w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odrzucić roztwór TE i przepłukać dwukrotnie sterylnym PBS uzupełnionym 90 g/ml ampicyliny i 90 g/ml kanamycyny przez 15 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej.
Po całkowitym zdekantowaniu końcowego prania ponownie uzupełnij 40 mililitrami sterylnego PBS z antybiotykami. Dokładnie myć przez 24 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem, aby uzyskać skuteczną sterylizację porowatych przestrzeni. Następnie przenieś kości do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej sterylnym PBS z antybiotykami.
Przygotowaną macierz zewnątrzkomórkową kości można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa miesiące. Zanurz BEM w 75% etanolu w naczyniu i delikatnie potrząsaj naczyniem ręcznie przez 30 sekund. Następnie płucz PBS przez 30 sekund, dwukrotnie.
Przenieść BEM na czystą płytkę do hodowli komórkowej z sześciodołkiem. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Inkubować BEM przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Uzyskać ludzkie linie komórkowe OS w 100 mikrolitrach wstępnie podgrzanego PBS zawierającego wskaźnikową czerwień fenolową. Użyj pipety, aby zawiesić komórki OS o przybliżonym stężeniu 1 razy 10 do 5. Po całkowitym nasączeniu BEM w pożywce, z bliższych lub dystalnych nasad, przebić igłę do jamy rdzeniowej BEM i wstrzyknąć komórki OS do BEM.
Inkubować model OS-BEM przez co najmniej dwie godziny w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby upewnić się, że wstrzyknięte komórki ściśle przylegają do BEM. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora. Dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej na płytkę i przechowywać ją w inkubatorze przez noc, aby całkowicie pokryć powierzchnię kultury BEM.
Delikatnie przenieś model OS-BEM do nowego dołka z sześciodołkową płytką za pomocą sterylnej pęsety i ponownie nałóż jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej. Hoduj model przez 14 dni w inkubatorze. Podczas 14-dniowej inkubacji należy obserwować kolor podłoża.
Jeśli pożywka zmieni kolor na pomarańczowy lub nawet żółty, natychmiast odśwież pożywkę, odrzucając połowę starego podłoża i dodając nowe podłoże, aby utrzymać zdrowe środowisko dla komórek systemu operacyjnego. Monitoruj stan komórek pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Gdy komórki OS rozszerzą się na płytkę, delikatnie przenieś model OS-BEM do innego nowego dołka za pomocą sterylnej pęsety.
Po 14-dniowej hodowli delikatnie przepłukać model OS-BEM za pomocą PBS, aby usunąć pożywkę. Następnie przenieś do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 10% buforowaną formalinę w celu utrwalenia w celu identyfikacji histologicznej. Po demineralizacji i decelularyzacji BEM wydaje się być półprzezroczysty o większej sprężystości i wytrzymałości w porównaniu z rodzimą kością myszy.
Wyraźnie można zaobserwować niewielką pozostałość mięśniową w przestrzeni jamy szpikowej. Obrazowanie w jasnym polu natywnej kości i zdecelularizowanego BEM pokazuje dokładne usunięcie jąder komórkowych. Naturalna porowata struktura w ułożeniu sieci kolagenowej jest dobrze zachowana w bezkomórkowym BEM.
Dodatkowo, barwienie immunohistochemiczne Kolagenu I i Kolagenu IV pokazuje, że główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej są zachowane w piszczelowej myszy po decelularyzacji. Podczas 14-dniowej hodowli zarówno okostna, jak i śródstopie są infiltrowane przez ekspansję komórek OS. Komórki OS na zdecelularyzowanym BEM wykazują wysoce heterogeniczną morfologię podobną do cech cytopatologicznych odcinka OS.
Analiza immunohistochemiczna po hodowli w modelu BEM przez 14 dni wykazuje duże zalety w hodowlach długoterminowych. Ponadto komórki OS i hodowla BEM wykazują wysoką ekspresję glikoproteiny macierzy kostnej, która jest specyficzna dla macierzy kostnej. Ten trójwymiarowy model in vitro został wykorzystany do zademonstrowania fenotypowej heterogeniczności i mechanizmu regulacyjnego dedyferencjacji kostniakomięsaka z sukcesem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
Model macierzy pozakomórkowej kości (BEM) dla osteosarcoma (OS) jest ustanawiany jako odpowiednie rusztowisko do naśladowania wzrostu pierwotnego guza in vitro. Ten model pomaga w badaniu histologicznej i cytogenetycznej heterogeniczności OS.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Badania nad nowotworami kości
- Osteosarcoma
- Histopatologia
Tło
- Model BEM jest kluczowy dla zrozumienia osteosarcoma.
- Matrice pozakomórkowa kości bez komórek wykazuje zmienną serokompatybilność.
- Komórki osteosarcoma wykazują heterogeniczną morfologię w tym modelu.
- Ten model odbija kliniczną histopatologię osteosarcoma.
Cel badania
- Badanie rozwoju i progresji nowotworów kości.
- Ocena wrażliwości na leki w osteosarcoma i powiązanych guzach.
- Dostarczanie funkcjonalnego rusztowisku dla badań in vitro.
Stosowane metody
- Przygotowanie decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej kości.
- Hodowla komórek osteosarcoma w macierzy pochodzenia kostnego.
- Wykorzystanie myszy BALB/c do uzyskania próbek kości.
- Techniki chirurgiczne do przygotowania tkanek.
Główne wyniki
- Komórki osteosarcoma hodowane w modelu BEM wykazują heterogeniczną morfologię.
- Model naśladuje kliniczną histopatologię osteosarcoma.
- Zmienna serokompatybilność wspiera przeżywalność i aktywność komórek.
- Dostarcza wglądu w wrażliwość na leki i progresję guza.
Konkluzje
- Model BEM jest skuteczny w badaniu osteosarcoma.
- Oferuje realistyczne środowisko dla badań in vitro.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie biologii nowotworów kości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
