Ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I

Ten film pokazuje, jak przygotować dwa różne typy substratów do hodowli komórkowych przy użyciu kolagenu typu I oraz metody hodowli dwuwymiarowej i trójwymiarowej. Metoda hodowli trójwymiarowej jest brana pod uwagę w środowisku biologicznym, a pokazanie, jak łatwo przygotować trójwymiarowy substrat hodowlany, jest przydatne do badań. W wielu typach komórek, pomimo stosowania tego samego kolagenu, zachowanie komórek znacznie różni się między substratami dwuwymiarowymi i trójwymiarowymi.

Korzystając z trójwymiarowego substratu hodowlanego, można łatwo zbadać zachowanie komórek, które jest bardziej podobne do zachowań organizmów żywych. Ta metoda jest bardzo prosta i wymaga minimalnego specjalnego odczynnika. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ chociaż chcemy pokazać, że ta metoda jest łatwa do wypróbowania, trójwymiarowy żel jest delikatny, a prawidłowe obchodzenie się z nim jest bardzo ważne.

Na początek przygotuj odpowiednią pożywkę hodowlaną. Aby rozpocząć przygotowywanie kolagenu, umieść na lodzie 10x PBS, wodę dejonizowaną, kolagen, 96-dołkową płytkę hodowlaną i pustą dwumililitrową probówkę. Za pomocą pipety dodaj 1,12 mililitra wody dejonizowanej do pustej dwumililitrowej probówki.

Dodaj 200 mikrolitrów 10x PBS do wody dejonizowanej i delikatnie potrząśnij probówką kilka razy. Bezpośrednio przed użyciem dodaj 0,66 mililitra kolagenu do dwumililitrowej tubki. Delikatnie i szybko potrząśnij rurką kilka razy.

Wlej 100 mikrolitrów tego roztworu kolagenu do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej, upewniając się, że pokryłeś całą powierzchnię studzienek. Delikatnie potrząśnij talerzem, wykonując ruchy od lewej do prawej. Inkubować płytkę hodowlaną w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie przechyl płytkę, aby potwierdzić żelowanie kolagenu i przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Delikatnie wlej 150 mikrolitrów K110 na żele, pipetując wzdłuż ścianki studzienki. Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Bezpośrednio przed hodowlą komórkową użyj pipety, aby delikatnie wyrzucić K110. Najpierw użyj pipety, aby dodać cztery mikrolitry kolagenu do 1,2 mililitra jednego milimolowego kwasu solnego w 1,5-mililitrowej probówce i delikatnie wymieszaj.

Wlej 100 mikrolitrów tej mieszaniny kolagenu do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij płytką ruchami od lewej do prawej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie wyrzuć roztwór kolagenu.

Za pomocą pipety umyj każdą studzienkę PBS. Dodaj 150 mikrolitrów 1% BSA i PBS do każdej studzienki płytki hodowlanej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Przed hodowlą komórkową należy wyrzucić 1% roztwór BSA.

Aby rozpocząć, przygotuj komórki FEPE1L-8 i K110, trypsynę i inhibitor trypsyny, jak opisano w protokole tekstowym. Ostrożnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego i za pomocą pipety dodaj trzy mililitry 0,05% trypsyny. Umieść naczynie z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie użyj mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy komórki nie oderwały się od powierzchni szalki hodowlanej. Dodaj trzy mililitry inhibitora trypsyny i za pomocą pipety zbierz oderwane komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować 200 razy g przez pięć minut.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach K110. Użyj mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby policzyć komórki i rozcieńczyć komórki K110 do gęstości komórek 50 000 komórek na mililitr. Delikatnie zasiać 0,1 mililitra zawiesiny komórkowej w każdym dołku płytki hodowlanej, pipetując wzdłuż ścianki dołka.

Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni okres czasu. Najpierw wymieszaj 130 mikrolitrów soli tetrazolowej i WST-8 z 1,3 mililitra podgrzanego K110 w dwumililitrowej probówce. Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę i za pomocą pipety delikatnie wyrzuć K110 z dołków.

Delikatnie zmyj i nieprzylegające komórki za pomocą K110. Następnie dodaj 110 mikrolitrów K110 zmieszanych z WST-8 do każdej studzienki. Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Zbierz 100 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i przenieś ją do studzienek nowej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję przy 450 nanometrach i oszacuj liczbę żywotnych komórek.

Morfologia komórek jest obserwowana na formach niewłóknistych i fibrylowych, które są pokazane tutaj. W ciągu pierwszych dwóch godzin hodowli komórki przylegają i rozprzestrzeniają się na obu formach kolagenu. Trzy dni po wysiewie komórki w formie niewłóknistej nadal się rozprzestrzeniają, a liczba komórek wzrasta, podczas gdy komórki w formie fibrylowej wykazują ograniczone rozprzestrzenianie się.

Komórki FEPE1L-8 nadal namnażają się na niewłóknistej formie kolagenu typu I oraz na nieleczonych powierzchniach naczyń. W przeciwieństwie do tego, komórki nie namnażają się w postaci fibryli. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że trójwymiarowy żel jest bardzo delikatny.

Należy uważać, aby roztwór lub końcówki nie miały bezpośredniego kontaktu z żelami. Metoda ta może być modyfikowana na wiele sposobów. Na przykład, aby wymieszać składniki błony próbki, można zrobić substrat do hodowli komórkowej, który naśladuje błonę podstawną.

W wielu przypadkach funkcje macierzy zewnątrzkomórkowej w organizmach żywych są nieznane. Aby hodować komórki w kulturze trójwymiarowej, można zbadać funkcję składnika macierzy zewnątrzkomórkowej, który jest bardziej podobny do żywego organizmu. Stosując techniki trójwymiarowych hodowli żelowych, można skutecznie badać stężenie leków w komórkach.

Protokół ten, w zależności od celu, może być wykorzystany do opracowania złożonych trójwymiarowych substratów hodowlanych poprzez mieszanie innych składników EGM lub czynników wzrostu podczas żelowania.