Name: Ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I. Protokół umożliwia badanie zachowania komórek w warunkach zbliżonych do środowiska biologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Dr. K. Sekiguchi (Instytut Badań nad Białkami, Uniwersytet w Osace), Dr. M. Yamada (Instytut Badań nad Białkami, Uniwersytet w Osace), Dr. T. Ikejima (Chińsko-Japoński Instytut Badawczy Nauk Medycznych i Farmaceutycznych, Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University) i T. Hayashi (Chińsko-Japoński Instytut Badawczy Nauk Medycznych i Farmaceutycznych, Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University) za pomocną pomocną Komentarze.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli keratynocytów
UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny i 10 ml dodatku K-1 do 500 ml pożywki K110 typu II (K110) za pomocą pipety.</li>
</ol>
2. Przygotowanie formy fibrylowej kolagenu typu I
UWAGA: Wykonuj procedury do kroku 2.6 w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Trzymaj 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS (-)), wodę dejonizowaną, kolagen, 96-dołkową płytkę hodowlaną i pustą probówkę 2 ml na lodzie. 
	UWAGA: Nie używaj tej samej płytki do przygotowania form fibrylowych i niewłóknistych.</li>
	<li>Dodaj 1,12 ml wody dejonizowanej do pustej probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Dodać 200 μl 10x PBS (-) do dejonizowanej wody w probówce o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Delikatnie potrząśnij rurką kilka razy.</li>
	<li>Dodaj 0,66 ml kolagenu do probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Delikatnie i szybko potrząśnij rurką kilka razy. 
	UWAGA: W miarę możliwości należy unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Przygotuj roztwór kolagenu bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Wlać 100 μl roztworu kolagenu z kroku 2.3 do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij płytką hodowlaną ruchami od lewej do prawej. 
	UWAGA: Pokryj całą powierzchnię studzienek roztworem kolagenu. Jeśli roztwór nie pokrywa całej powierzchni, rozprowadź roztwór za pomocą końcówki pipety. W miarę możliwości unikaj tworzenia się pęcherzyków w roztworze.</li>
	<li>Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze z użyciem CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Sprawdzić żelowanie kolagenu i przenieść płytkę hodowlaną na czystą ławkę. 
	UWAGA: Potwierdź żelowanie, przechylając płytkę hodowlaną.</li>
	<li>Delikatnie wylać 150 μl K110 na żele za pomocą pipety wzdłuż ścianki studzienki, umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przenieść płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Przed hodowlą komórkową delikatnie wyrzuć K110 za pomocą pipety. 
	UWAGA: Aby chronić żele, końcówka pipety powinna dotykać ścianki studzienki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie niewłóknistej formy kolagenu typu I
UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Dodaj 4 μl kolagenu do 1,2 ml 1 mM kwasu solnego (HCl) w probówce o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety. 
	UWAGA: Kolagen należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Przechowuj kolagen i HCl w chłodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Wlej 100 μl kolagenu do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą pipety. Delikatnie potrząśnij płytką hodowlaną ruchami od lewej do prawej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 h. 
	UWAGA: Upewnij się, że cała powierzchnia studzienek jest pokryta roztworem.</li>
	<li>Po inkubacji wyrzucić roztwór kolagenu i dwukrotnie przemyć studzienki PBS (-) za pomocą pipety.</li>
	<li>Wlać 150 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej/PBS (-) (1% BSA) do dołka na 96-dołkowej płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przed hodowlą komórkową wyrzucić 1% BSA. 
	UWAGA: Upewnij się, że cała powierzchnia studzienek jest pokryta roztworem.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek FEPE1L-8
UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Utrzymać komórki FEPE1L-8 w K110 w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do częściowego zrębu.</li>
	<li>Przygotować K110, trypsynę i inhibitor trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć pożywkę z naczynia hodowlanego, dodać 3 ml 0,05% trypsyny za pomocą pipety, umieścić naczynie w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po inkubacji sprawdzić oderwanie komórek od powierzchni szalki hodowlanej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu. 
	UWAGA: Morfologia odłączonych komórek staje się okrągła. Jeśli komórki się rozprzestrzenią, inkubować przez dodatkowy okres 5 minut.</li>
	<li>Dodać 3 ml inhibitora trypsyny i zebrać oderwane komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Odwirować komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml K110 za pomocą pipety. Policz komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu i przygotuj stężenie komórek przy 5,0 x 104 komórek/ml przez odpowiednie rozcieńczenie K110.</li>
	<li>Delikatnie wysiewać 0,1 ml K110 z komórkami w każdym dołku płytki hodowlanej za pomocą pipety wzdłuż ścianki studzienki. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze z użyciem CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez wskazany czas (2 godziny, 1 dzień, 3 dni). 
	UWAGA: Aby chronić żele, końcówka pipety powinna dotykać ścianki studzienki.</li>
</ol>
5. Oszacowanie liczby żywotnych komórek
<ol>
	<li>Inkubować K110 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zmieszać 130 μl soli tetrazolowej, 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H tetrazolium, sól monosodową (WST-8) i 1,3 ml K110 w probówce o pojemności 2 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę i delikatnie wyrzuć K110 za pomocą pipety. Delikatnie zmyj nieprzylegające komórki za pomocą K110 za pomocą pipety</li>
	<li>Dodać 110 μl K110 zmieszanego z WST-8 do każdej studzienki za pomocą pipety, umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę, zbierz 100 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i przenieś ją do studzienki z inną 96-dołkową płytką hodowlaną. Zmierz absorbancję przy długości fali 450 nm (OD450) za pomocą czytnika mikropłytek i oszacuj liczbę żywotnych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinman%2C+HK+%22Extracellular+Matrix%3A+A+Practical+Approach%2C+1st+ed%22">Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed</a>. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).</li>
<li>Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamato%2C+M+%22Extracellular+Matrix-Cell+Interaction%22">Extracellular Matrix-Cell Interaction</a>. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).</li>
<li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation%3A+Acid-soluble%2C+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li>
<li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5%2F10%2F11+deposition+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li>
<li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+proliferation%2C+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li>
<li>Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulation+of+integrin%E2%80%90mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li>
<li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+basement+membrane%3A+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Resesrch+International%22%5BJournal%5D)">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784(2013).</li>
<li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells%2C+HaCaT+and+FEPE1L-8%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li>
<li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6%2FE7+open+reading+frames%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li>
<li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li>
<li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li>
<li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li>
<li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922(2014).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li>
<li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li>
<li>Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , 2489375 (11F019-EP) (2015).</li>
<li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-%CE%BAB-mediated+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niektóre składniki ECM, w tym kolagen typu I, tworzą trójwymiarowe struktury in vivo1. Hodowla na takim trójwymiarowym, żelowym podłożu zapewnia więcej warunków fizjologicznych in vitro niż na dwuwymiarowej, plastycznej powierzchni 1,2,3,4. Opisano liczne protokoły dotyczące metody hodowli żelowej, takie jak stosowanie kolagenu typuI 1,2,3,4,6,7,11, kolagenu typu IV14,15 i Matrigel16. Kolagen typu I jest dobrze zdefiniowanym i szeroko stosowanym materiałem ze względu na jego obfitość i łatwość obsługi. Cechy oczyszczonego kolagenu typu I zależą od gatunku zwierzęcia, wieku i metod oczyszczania 5,17. Kolagen typu I można oczyszczać za pomocą kwasu octowego i/lub proteaz, takich jak pepsyna, papaina i proktaza 5,17. Kolagen rozpuszczalny w kwasach utrzymuje amino-telopeptydy, a kolagen rozpuszczalny w proteazie to rozszczepione amino-telopeptydy 5,17. Zarezerwowana długość amino-telopeptydów zależy od rodzaju proteaz, a obecność telopeptydów wpływa na morfologię włókienek i wytrzymałość żelu 5,17. Lepkość rozpuszczalnych w kwasach włókien kolagenowych jest większa niż kolagenów traktowanych proteazą17. W tym badaniu użyliśmy rozpuszczalnego w kwasach kolagenu bydlęcego typu I. Kolagen rozpuszczalny w pepsynach może być również stosowany w tym protokole hodowli żelu; Jednak siła żelu jest słabsza17. Te różnice w materiałach mogą powodować różnice w zachowaniu komórek, ale obecnie nie są one dobrze poznane.
Protokół hodowli żelowej opisany w tym badaniu jest bardzo prosty. Zgłoszono wiele modyfikacji tej metody. Jedną z możliwych modyfikacji hodowli keratynocytów jest naśladowanie błony podstawnej. Żele kolagenowe typu IV mogą być lepsze do utrzymania struktury substratu przypominającej błonę podstawną in vitro15,18. Jednak do przygotowania żeli kolagenowych typu IV wymagany jest długi okres inkubacji 14,15,18. Zamiast tego mieszanie kolagenu typu IV z żelami kolagenowymi typu I może wytworzyć nowe substraty hodowlane (żele hybrydowe kolagenu typu I/typu IV)19. Te hybrydowe żele są łatwe w obsłudze, wymagają krótkiego czasu żelowania i dają więcej warunków przypominających błonę podstawną dla keratynocytów. W hybrydowych żelach kolagenowych typu I/typu IV keratynocyty przeżywają, tworzą kolonie i indukują końcowe różnicowanie19. Ta hybrydowa metoda ma wszechstronne zastosowanie.
Hodowla na żelu z użyciem kolagenu typu I wpływa na komórki rakowe. W postaci fibrylowej kolagenu typu I aktywacja Akt i wzrost komórek Caco-2 (linia komórkowa raka jelita grubego) są hamowane7. Ponadto wzrost ludzkich komórek czerniaka (M24met) w postaci włókienki zostaje zatrzymany w punkcie kontrolnym G1/S20. Ponadto obserwuje się znaczny wzrost poziomu reaktywnych form tlenu w mysich preadipocytach 3T3-L1 hodowanych na formie fibrylowej. Ponadto proliferacja i migracja komórek są stymulowane w przeciwnych kierunkach przez niewłókniste i fibrylowe formy kolagenu typu I21.

Śródmiąższowe tkanki łączne tworzą trójwymiarową siatkę białkową o niejednorodnym składzie, składającą się głównie z włókien kolagenu typu I1. Fibryle kolagenowe odgrywają kluczową rolę jako rusztowanie dla komórek1,2,3 i wchodzą w interakcje z innymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)3. In vitro różne formy kolagenu typu I mogą być stosowane jako substraty do hodowli komórkowych w zależności od metody obchodzenia się z nim1,2,3,4. W środowisku kwaśnym kolagen typu I zachowuje formę niewłóknistą5. Powlekanie powierzchni szalek hodowlanych formą niewłóknistą sprzyja adhezji i proliferacji komórek6,7. Przy fizjologicznym pH i temperaturze cząsteczki kolagenu typu I łączą się ponownie w fibryle, które tworzą żele o trójwymiarowej strukturze1,2,3,4,5,6,7,8. Istnieje kilka istotnych różnic między fibrylowymi i niewłóknistymi formami kolagenu typu I, w tym sztywność matrycy i skuteczność rekonstrukcji składników ECM przez komórki podczas hodowli1. Sztywność matrycy jest jednym z najlepiej badanych czynników regulacyjnych hodowli komórkowych1, 9. Jednak złożone interakcje między substratami a komórkami pozostają do wyjaśnienia. Do badania złożonych interakcji między komórkami a czynnikami środowiskowymi przydatny jest prosty system. Porównanie zachowania komórkowego dwóch różnych form kolagenu może pomóc uprościć działanie czynników środowiskowych. W zależności od celu ich stosowania, wybiórczo można stosować różne formy kolagenu typu I. Zwykle keratynocyty stykają się z błoną podstawną, ale nie z kolagenem typu I. Jednak podczas gojenia się ran keratynocyty przemieszczają się do tkanki łącznej skóry, namnażają się i goją ranę10.
Ostatnio wykazaliśmy, że stężenie zewnątrzkomórkowego wapnia jest ważne dla proliferacji komórek linii keratynocytów, wykorzystując system hodowli na formie fibrylowej kolagenu typu I, naśladując tkankę łączną skóry11. Gdy linia komórkowa keratynocytów FEPE1L-8 została wyhodowana na fibrylowej formie kolagenu typu I, kształt komórek był okrągły, a ich proliferacja została zatrzymana przy zewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia 30 μM11. Gdy stężenie wapnia wzrosło do 1,8 mM, wzrost komórek został odzyskany11. Komórki rosły pod oboma stężeniami wapnia (30 μM i 1,8 mM), gdy były hodowane na formie niewłóknistej 11, podczas gdy były bardziej wrażliwe na egzogenne stężenie wapnia podczas hodowli na formie fibrylowej. FEPE1L-8 został wygenerowany w wyniku transfekcji z genami transformującymi E6 i E7 wirusa brodawczaka brodawczaka typu 16 z ludzkiego raka szyjki macicy, nienowotworowego, hamującego nieograniczoną proliferację z ograniczonym potencjałem różnicowania, jak normalne keratynocyty12,13. Komórki FEPE1L-8 mogą być utrzymywane przy użyciu niektórych rodzajów pożywki specyficznej dla keratynocytów, w tym K110 typu II z dodatkiem suplementu K-1 (K110) 6. W tym miejscu opisujemy protokół hodowli ludzkiej linii komórkowej keratynocytów na niewłóknistych i fibrylowych formach kolagenu typu I.

<table><tbody><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1 % BSA&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td>Rozpuścić 1 g proszku BSA w 100 ml PBS (-) i przefiltrować&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>347-07621</td><td>Sól tetrazolowa, 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H&nbsp; tetrazoli, sól monosodowa (WST-8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagen typu I (kolagen rozpuszczalny w kwasach)</td><td>Nippi Inc.</td><td>ASC-1-100-20</td><td>z bydła (każdy inny dostępny gatunek, stężenie wynosi 3,0 mg / ml</td></tr><tr><td>jednorazowa membranowa jednostka filtrująca octan celulozy DISMIC</td><td>ADVANTEC Co., LTD.</td><td>25CS020AS</td><td>0,2 &mikro; M Wielkość porów</td></tr><tr><td>ludzka komórka liniowa keratynocytu&nbsp; FEPE1L-8</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Darowizna Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>K-1</td><td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td><td>28204</td><td>dodatek uzupełniający zawierający 500 mg BSA, 500 mg ekstraktów z przysadki mózgowej bydła, 2,5 mg insuliny, 0,05 i mikro; g h-EGF i 5 mg heparyny</td></tr><tr><td>K110 Type-II medium</td><td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td><td>28204</td><td>Pożywka do hodowli podstawowych keratynocytów&nbsp;</td></tr><tr><td>Pożywka K110 typu II z K-1 i penicyliną-streptomycyną (K110)</td><td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td><td>28204</td><td>Dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny i 10 ml dodatku (K-1) do 500 ml podstawowej pożywki hodowlanej keratynocytów K110 typu II&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS (-)&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>Rozpuść 1 saszetkę proszku PBS (-) w 1000 ml wody dejonizowanej i przefiltrować&nbsp;</td></tr><tr><td>10x PBS (-)</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>Rozpuść 1 saszetkę proszku PBS (-) w 100 ml wody dejonizowanej i przefiltruj&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>1670049</td><td>10000 jednostek/ml penisyliny G i 10 000 μm; g/ml siarczanu streptmycyny w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem BioPerformance CertiCertified, pH 7,4</td> Opakowanie <td></td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368-10</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % trypsyna&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td>Rozpuścić 0,25 g trypsyny i&nbsp; 0,186 g EDTA.2Na w 500 ml PBS (-)&nbsp; i przefiltrować&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z soi</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td><td>202-20123</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>202-20123</td><td>Rozpuścić 50 mg inhibitora trypsyny i 500 mg BSA w 500 ml PBS (-) i przefiltrować&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu i

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Kolagen typu I, przydatny jako substrat do hodowli komórkowych, występuje w dwóch formach: dwuwymiarowej, niewłóknistej i trójwymiarowej, fibrylowej. Obie formy mogą być przygotowane z tego samego kolagenu typu I. Ogólnie rzecz biorąc, forma niewłóknista sprzyja adhezji i proliferacji komórek. Forma fibrylowa (żele) zapewnia więcej warunków fizjologicznych w wielu typach komórek; Dlatego hodowla żelowa jest przydatna do badania fizjologicznych zachowań komórek, takich jak skuteczność leków.
Badacze mogą wybrać odpowiednią formę zgodnie z celem jej użycia. Na przykład w przypadku keratynocytów jako model gojenia się ran zastosowano posiew na żelu. FEPE1L-8, linia komórkowa keratynocytów hodowana na niewłóknistej formie kolagenu typu I, sprzyja adhezji komórek. Warto zauważyć, że proliferacja keratynocytów jest wolniejsza w postaci fibrylowej niż w postaci niewłóknistej. Protokoły przygotowania kolagenu typu I do hodowli komórkowych są proste i mają szerokie zastosowanie w zależności od potrzeb eksperymentalnych.

Schematyczne przedstawienie modyfikacji powierzchni naczyń hodowlanych przy użyciu kolagenu typu I ukazano na Rycini 1. Morfologia komórek zaobserwowana na formach niefibrylarnych i fibrylarnych przedstawiona jest odpowiednio na lewym i prawym panelu Ryciny 2. Komórki FEPE1L-8 hodowano przez 2 h (panele górne) i 3 dni (panele dolne). W początkowych 2 h hodowli komórki przylgnęły i rozprzestrzeniły się na obu formach kolagenu (Rycina 2, panele górne). Trzy dni po wysianiu komórki na formie niefibrylarnej nadal się rozprzestrzeniały, a ich liczba wzrosła (Rycina 2, dolny lewy panel). W przeciwieństwie do nich, komórki na formie fibrylarnej wykazały ograniczone rozprzestrzenianie się (Rycina 2, dolny prawy panel). Komórki FEPE1L-8 nadal proliferowały na niefibrylarnej formie kolagenu typu I (Rycina 3, ciągła czarna linia, pełne czarne kropki) oraz na niemodyfikowanych powierzchniach naczyń (Rycina 3, przerywana szara linia, pełne szare kropki). Natomiast komórki nie proliferowały na formie fibrylarnej (Rycina 3, przerywana linia, puste kropki). Rycina 2 oraz Rycina 3 zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Fujisaki i wsp.1.
<img alt="Proces żelowania kolagenu typu I, schemat: pH kwasowe vs neutralne, wpływ temperatury na tworzenie się fibryli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Schematyczne przedstawienia powierzchni naczyń hodowlanych potraktowanych kolagenem typu I. W warunkach kwasowych cząsteczki kolagenu typu I adsorbują się na powierzchni naczynia w formie niewłóknistej (panel lewy). W warunkach neutralnych przy 37 °Ccząsteczki kolagenu typu I są ponownie montowane w fibryle i adsorbowane na powierzchni płytek w formie żelu (panel prawy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Adhezja komórkowa na podłożach z kolagenu typu I, obraz mikroskopowy, analiza w ciągu 2 godzin i 3 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Morfologia komórek FEPE1L-8. Komórki FEPE1L-8 w K110 hodowano z użyciem formy niewłóknistej (10 µg/mL; lewe panele) lub w formie włókien (1 mg/ml; prawe panele) kolagenu typu I przez 2 h (górne panele) lub 3 dni (dolne panele). Białe słupki wskazują 100 µm. Rysunek 2 został zmodyfikowany na podstawie pracy Fujisaki i współpracowników w Rysunek 1E–H11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres OD w funkcji dni przedstawia zachowanie włókien kolagenowych, formy niewłóknistej oraz powierzchni naczynia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Proliferacja komórek FEPE1L-8. Liczbę żywych komórek oszacowano na niewłóknistej formie (czarna linia ciągła, czarne wypełnione kropki) lub formie włóknistej (linia przerywana, puste kropki) kolagenu typu I, a także na niepoddanych obróbce powierzchniach naczyń (szara linia przerywana, szare wypełnione kropki) po 2 godzinach, 1 dniu i 3 dniach. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wartości przedstawiono jako średnie + SD. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Fujisaki i wsp. w Rycina 1J11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania dwóch różnych form substratów hodowlanych wykorzystujących kolagen typu I. W zależności od tego, jak postępuje się z kolagenem, cząsteczki kolagenu albo zachowują dwuwymiarową, niewłóknistą formę, albo ponownie łączą się w trójwymiarową formę fibrylową. Na proliferację komórek kolagenu typu I drastycznie wpływa tworzenie fibryli.

Ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Ten film pokazuje, jak przygotować dwa różne typy substratów do hodowli komórkowych przy użyciu kolagenu typu I oraz metody hodowli dwuwymiarowej i trójwymiarowej. Metoda hodowli trójwymiarowej jest brana pod uwagę w środowisku biologicznym, a pokazanie, jak łatwo przygotować trójwymiarowy substrat hodowlany, jest przydatne do badań. W wielu typach komórek, pomimo stosowania tego samego kolagenu, zachowanie komórek znacznie różni się między substratami dwuwymiarowymi i trójwymiarowymi.Korzystając z trójwymiarowego substratu hodowlanego, można łatwo zbadać zachowanie komórek, które jest bardziej podobne do zachowań organizmów żywych. Ta metoda jest bardzo prosta i wymaga minimalnego specjalnego odczynnika. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ chociaż chcemy pokazać, że ta metoda jest łatwa do wypróbowania, trójwymiarowy żel jest delikatny, a prawidłowe obchodzenie się z nim jest bardzo ważne.Na początek przygotuj odpowiednią pożywkę hodowlaną. Aby rozpocząć przygotowywanie kolagenu, umieść na lodzie 10x PBS, wodę dejonizowaną, kolagen, 96-dołkową płytkę hodowlaną i pustą dwumililitrową probówkę. Za pomocą pipety dodaj 1,12 mililitra wody dejonizowanej do pustej dwumililitrowej probówki.Dodaj 200 mikrolitrów 10x PBS do wody dejonizowanej i delikatnie potrząśnij probówką kilka razy. Bezpośrednio przed użyciem dodaj 0,66 mililitra kolagenu do dwumililitrowej tubki. Delikatnie i szybko potrząśnij rurką kilka razy.Wlej 100 mikrolitrów tego roztworu kolagenu do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej, upewniając się, że pokryłeś całą powierzchnię studzienek. Delikatnie potrząśnij talerzem, wykonując ruchy od lewej do prawej. Inkubować płytkę hodowlaną w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie przechyl płytkę, aby potwierdzić żelowanie kolagenu i przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Delikatnie wlej 150 mikrolitrów K110 na żele, pipetując wzdłuż ścianki studzienki. Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Bezpośrednio przed hodowlą komórkową użyj pipety, aby delikatnie wyrzucić K110. Najpierw użyj pipety, aby dodać cztery mikrolitry kolagenu do 1,2 mililitra jednego milimolowego kwasu solnego w 1,5-mililitrowej probówce i delikatnie wymieszaj.Wlej 100 mikrolitrów tej mieszaniny kolagenu do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij płytką ruchami od lewej do prawej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie wyrzuć roztwór kolagenu.Za pomocą pipety umyj każdą studzienkę PBS. Dodaj 150 mikrolitrów 1% BSA i PBS do każdej studzienki płytki hodowlanej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Przed hodowlą komórkową należy wyrzucić 1% roztwór BSA.Aby rozpocząć, przygotuj komórki FEPE1L-8 i K110, trypsynę i inhibitor trypsyny, jak opisano w protokole tekstowym. Ostrożnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego i za pomocą pipety dodaj trzy mililitry 0,05% trypsyny. Umieść naczynie z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie użyj mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy komórki nie oderwały się od powierzchni szalki hodowlanej. Dodaj trzy mililitry inhibitora trypsyny i za pomocą pipety zbierz oderwane komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować 200 razy g przez pięć minut.Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach K110. Użyj mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby policzyć komórki i rozcieńczyć komórki K110 do gęstości komórek 50 000 komórek na mililitr. Delikatnie zasiać 0,1 mililitra zawiesiny komórkowej w każdym dołku płytki hodowlanej, pipetując wzdłuż ścianki dołka.Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni okres czasu. Najpierw wymieszaj 130 mikrolitrów soli tetrazolowej i WST-8 z 1,3 mililitra podgrzanego K110 w dwumililitrowej probówce. Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę i za pomocą pipety delikatnie wyrzuć K110 z dołków.Delikatnie zmyj i nieprzylegające komórki za pomocą K110. Następnie dodaj 110 mikrolitrów K110 zmieszanych z WST-8 do każdej studzienki. Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Zbierz 100 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i przenieś ją do studzienek nowej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję przy 450 nanometrach i oszacuj liczbę żywotnych komórek.Morfologia komórek jest obserwowana na formach niewłóknistych i fibrylowych, które są pokazane tutaj. W ciągu pierwszych dwóch godzin hodowli komórki przylegają i rozprzestrzeniają się na obu formach kolagenu. Trzy dni po wysiewie komórki w formie niewłóknistej nadal się rozprzestrzeniają, a liczba komórek wzrasta, podczas gdy komórki w formie fibrylowej wykazują ograniczone rozprzestrzenianie się.Komórki FEPE1L-8 nadal namnażają się na niewłóknistej formie kolagenu typu I oraz na nieleczonych powierzchniach naczyń. W przeciwieństwie do tego, komórki nie namnażają się w postaci fibryli. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że trójwymiarowy żel jest bardzo delikatny.Należy uważać, aby roztwór lub końcówki nie miały bezpośredniego kontaktu z żelami. Metoda ta może być modyfikowana na wiele sposobów. Na przykład, aby wymieszać składniki błony próbki, można zrobić substrat do hodowli komórkowej, który naśladuje błonę podstawną.W wielu przypadkach funkcje macierzy zewnątrzkomórkowej w organizmach żywych są nieznane. Aby hodować komórki w kulturze trójwymiarowej, można zbadać funkcję składnika macierzy zewnątrzkomórkowej, który jest bardziej podobny do żywego organizmu. Stosując techniki trójwymiarowych hodowli żelowych, można skutecznie badać stężenie leków w komórkach.Protokół ten, w zależności od celu, może być wykorzystany do opracowania złożonych trójwymiarowych substratów hodowlanych poprzez mieszanie innych składników EGM lub czynników wzrostu podczas żelowania.

evaluation-keratinocyte-proliferation-on-two-three-dimensional-type-i

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

W tym filmie przeprowadzamy test klonogenny keratynocytów pobranych od dorosłych myszy, aby określić zdolność poszczególnych komórek do proliferacji i tworzenia kolonii. Ta technika zbierania keratynocytów jest przydatna do badania innych dalszych aspektów chemicznej kancerogenezy skóry i promocji guza.

Test tworzenia kolonii keratynocytów: test in vitro oceniający zdolność keratynocytów do wzrostu w kolonie

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Poznaj metodę oceny proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I. Protokół umożliwia badanie zachowania komórek w warunkach zbliżonych do środowiska biologicznego.

Ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I

Przeglądaj więcej filmów