Name: Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj standardową procedurę nadzoru wirusów Lyssa u nietoperzy na Tajwanie. Protokół obejmuje pobieranie próbek, testy diagnostyczne i analizę danych. Metoda pozwala identyfikować patogeny zoonotyczne i wspiera badania epidemiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai i Ya-Lan Li za pomoc podczas tego badania. Badanie to było wspierane przez grant nr 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) z Biura Inspekcji i Kwarantanny Zdrowia Zwierząt i Roślin, Rady Rolnictwa, Executive Yuan, Tajwan.

1. Środki ostrożności podczas obchodzenia się z lyssawirusami
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszyscy pracownicy laboratoriów zajmujący się próbkami nietoperzy otrzymują profilaktykę przedekspozycyjną przeciwko wściekliźnie17. Monitoruj wcześniej poziom przeciwciał przeciwko wściekliźnie u pracowników i badaj je ponownie co 6 miesięcy17. Kolejne szczepienie przeciwko wściekliźnie jest wymagane u osób, u których poziom przeciwciał jest niższy niż 0,5 IU/ml17.</li>
	<li>W zależności od przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego w kraju, w którym znajduje się laboratorium, upewnij się, że następujące procedury są wykonywane w odpowiednich laboratoriach poziomu bezpieczeństwa biologicznego (np. Laboratoria BSL-2 na Tajwanie i laboratoria BSL-3 w Australii) oraz że pracownicy są obecnie wykwalifikowani i noszą odpowiednie środki ochrony osobistej18. 
	UWAGA: Szczepienie przeciwko wściekliźnie zapewnia niewielką lub żadną ochronę przed lyssawirusami należącymi do filogrup II i III18. Pracownicy muszą być poinformowani, że u nietoperzy zidentyfikowano kilka odzwierzęcych czynników chorobotwórczych19 i powinni obchodzić się z próbkami w warunkach laboratoryjnych o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Użyj znalezionych słabych lub chorych nietoperzy lub tusz. 
	UWAGA: Słabe lub chore nietoperze są dostarczane do Towarzystwa Ochrony Nietoperzy w Tajpej w celu opieki weterynaryjnej lub badań, podczas gdy tusze są przekazywane bezpośrednio do Instytutu Badawczego Zdrowia Zwierząt. Żadne zdrowe nietoperze nie zostały poddane eutanazji w ramach tego programu nadzoru.</li>
	<li>Poproś ekologa nietoperzy o zidentyfikowanie gatunków nietoperzy na podstawie cech morfologicznych20.</li>
	<li>Wykonaj barkodowanie DNA gatunku nietoperza w przypadku zdiagnozowania dodatniego wyniku lizsywirusa, korzystając z wcześniej opublikowanych procedur21.</li>
	<li>Należy przedłożyć kartę informacyjną dotyczącą każdej tuszy nietoperza (miejsce pozyskania, gatunek, objawy kliniczne itp.).</li>
</ol>
3. Sekcja zwłok nietoperzy
<ol>
	<li>Przygotuj materiały.
	<ol>
		<li>Przygotuj czystą deskę do sekcji i umieść sterylny wkład chłonny do sekcji zwłok.</li>
		<li>Przygotuj probówki do pobierania narządów nietoperzy.</li>
		<li>Przygotuj jednorazowe pęsety i skalpele do sekcji zwłok. Zmieniaj narzędzia między sekcjami zwłok każdego nietoperza. Przygotuj waciki zwilżone 70% etanolem do czyszczenia pęsety i skalpela podczas pobierania próbek.</li>
		<li>Przygotuj dwa szkiełka mikroskopowe do FAT. Pobrać świeże próbki i umieścić je w roztworze formaliny do badania histopatologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj wszystkie zewnętrzne otwory przed sekcją zwłok. Sfotografuj zewnętrzne cechy nietoperza, zwłaszcza głowę, uszy i skrzydła, aby zróżnicować gatunki.</li>
	<li>Pobrać próbkę wymazu z jamy ustnej. Umieść nietoperza w pozycji leżącej brzusznej na desce i przymocuj głowę nietoperza pęsetą. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej kalwarii skalpelem i pociągnij skórę na boczne strony. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej kalwarii skalpelem i otwórz ją pęsetą, aby odsłonić tkankę mózgową.</li>
	<li>Usuń tkankę mózgową z czaszki i umieść ją na sterylnym depresorze języka, a następnie wykonaj wyciski z tkanki mózgowej (patrz krok 4.2). Zbierz mały kawałek świeżej tkanki mózgowej i utrwal go w formalinie do badania histopatologicznego. Zatrzymaj pozostałą tkankę mózgową w probówce do ekstrakcji kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Wyczyść pęsetę i skalpel wacikami zwilżonymi 70% etanolem, aby usunąć zatrzymane tkanki między pobraniem próbki.</li>
	<li>Umieść nietoperza na desce w pozycji grzbietowej i przymocuj go do deski za pomocą igieł po obu stronach pachy i pięty ogona.</li>
	<li>Naciąć skórę wzdłuż linii środkowej ciała od żuchwy do odbytu. Podnieś i oddziel skórę i leżące pod nią tkanki mięśniowe za pomocą pęsety. Zbierz gruczoły ślinowe, które znajdują się w pobliżu kości żuchwy.</li>
	<li>Lekko unieś mostek pęsetą i przetnij mostek i ścianę brzucha wzdłuż linii środkowej skalpelem. Przetnij obojczyki skalpelem. Przymocuj lewą i prawą klatkę piersiową do deski za pomocą igieł, aby otworzyć klatkę piersiową.</li>
	<li>Zapisać poważne zmiany chorobowe i stopień zmian pośmiertnych.</li>
	<li>Usunąć tkanki trzewne (tj. serce, płuca, wątrobę, nerki, jelita) z tuszy za pomocą pęsety i skalpela. Zbierz próbki trzewne zgodnie z potrzebami do przyszłych badań. 
	UWAGA: Zaleca się pobranie zduplikowanych próbek. Jeden z nich powinien zostać pobrany do diagnostyki molekularnej, a drugi powinien zostać zamrożony w temperaturze -80 °C z pożywką transportową lub bez pożywki do hodowli wirusów22.</li>
</ol>
4. Test przeciwciał fluorescencyjnych (FAT)
<ol>
	<li>Wykonaj wyciski tkanki mózgowej pod kątem FAT. Wykonaj FAT zgodnie z wcześniejszym opisem18,23 z następującymi modyfikacjami.</li>
	<li>Delikatnie oddziel tkankę mózgową od połączonej tkanki nerwowej za pomocą pęsety i przenieś tkankę mózgową do sterylnego depresora języka. Przetnij przekrój poprzeczny mózgu, w tym pień mózgu i móżdżek18,23. Wykonaj wycisk tkanki mózgowej, lekko dotykając przeciętej powierzchni tkanki mózgowej i naciśnij szkiełko na tkance soczewki, aby usunąć nadmiar tkanki.</li>
	<li>Utrwalić szkiełka acetonem w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Wysuszyć badane szkiełka oraz kontrole dodatnie i ujemne przed barwieniem koniugatem.</li>
	<li>Zaleca się stosowanie każdego z dwóch dostępnych na rynku sprzężonych z FITC przeciwciał przeciw wściekliźnie do barwienia antygenu wirusa lyssa23. Określić stężenie robocze koniugatu handlowego przed pierwszym barwieniem. Rozcieńczone koniugaty przepuścić przez filtr strzykawkowy 0,45 μM na szkiełka podstawowe i inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez 30 minut w mokrej komorze.</li>
	<li>Nadmiar koniugatu odcedzić ze szkiełek i po inkubacji przemyć szkiełka solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Upuść niewielką ilość 10% glicerolu na szkiełka i przykryj szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Dodać odpowiednią objętość MEM-10 (minimum niezbędnej pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą) do tkanki mózgowej (10% w/v).</li>
	<li>Homogenizować tkankę mózgową za pomocą stalowego koralika o średnicy 5 mm w homogenizatorze i wirować przy 825 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Ekstrahować kwas nukleinowy, którego końcowa objętość wynosi 50 μl, w obrębie 200 μl supernatantu, używając dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji całkowitego kwasu nukleinowego z przyrządem.</li>
</ol>
6. RT-PCR i analiza filogenetyczna
UWAGA: Opublikowano kilka zestawów starterów do wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów lub specyficznych lyssawirusów. Opisany tutaj protokół jest przykładem wykorzystywanym przez nasze laboratorium i może nie spełniać wszystkich potrzeb eksperymentalnych. Wybierz odpowiednie podkłady zgodnie z potrzebami laboratorium.
<ol>
	<li>Przygotować jednoetapowy odczynnik RT-PCR w następujący sposób: dodać 5 μL wyekstrahowanego kwasu nukleinowego do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2,5 μL 10x buforu reakcyjnego, 0,5 μL starterów do przodu i do tyłu (po 10 μM każdy), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL inhibitora RNazy (40 U/μL), 0,3 μl odwrotnej transkryptazy (10 U/μL), 0,4 μl polimerazy DNA (5 U/μL) i 11,5 μl wody uzdatnionej DEPC. 
	UWAGA: Zestaw starterów używany w tym protokole to JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') i N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Zmodyfikuj przygotowanie odczynników i warunki cyklu zgodnie z używanymi zestawami starterów.</li>
	<li>Cykl należy wykonać w następujących warunkach: inkubacja w temperaturze 42 °C przez 40 minut; wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 10 minut; 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; i na koniec dalsze przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Użyj innego lub więcej zestawów starterów, aby zwiększyć czułość diagnostyczną.
	<ol>
		<li>Użyj N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') i N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3')25,26, aby przygotować jednoetapowy odczynnik RT-PCR w następujący sposób: dodać 5 μL wyekstrahowanego kwasu nukleinowego do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 5 μL buforu 10x, 5 μL starterów do przodu i do tyłu (po 4 μM każdy), 5 μL 1,25 mM dNTP, 0,5 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 0,2 μl odwrotnej transkryptazy (10 U/μL), 1 μL polimerazy DNA (5 U/μL) i 23,3 μl wody uzdatnionej DEPC.</li>
		<li>Cykl należy przeprowadzić w następujących warunkach: inkubacja w temperaturze 42 °C przez 40 minut; wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 minutę i 20 s oraz 72 °C przez 1 minutę; i na koniec dalsze przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut 
		UWAGA: W zależności od potrzeb laboratoryjnych należy wybrać odpowiednie podkłady do diagnostyki. N113F został pierwotnie zaprojektowany do amplifikacji wirusa wścieklizny, ale może nie działać dobrze w przypadku innych lyssawirusów. Zestaw N113F i N304R działa dobrze na wirusa wścieklizny (wariant borsuka fretki tajwańskiej) i lyssawirusa nietoperzy tajwańskich. Łatwiej będzie uzyskać całe sekwencje nukleoproteinowe przy użyciu zestawu starterów JW12 i N304R, jeśli lyssawirus zostanie amplifikowany przez oba powyższe zestawy starterów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj produkt PCR na 2% elektroforezie w żelu agarozowym i zwizualizuj za pomocą oświetlenia światłem UV.</li>
	<li>Sekwencjonuj produkt PCR za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania.</li>
	<li>Wprowadź lub prześlij sekwencję na stronę internetową narzędzia Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Zaznacz opcję "inne (nr itp.)" i wprowadzić się do organizmu jako Lyssavirus. Wybierz algorytm MegaBlast i uruchom BLAST.</li>
</ol>
7. Izolacja wirusa
UWAGA: Przeprowadź izolację wirusa, gdy 1) FAT lub 2) RT-PCR wskazują na pozytywność.
<ol>
	<li>Homogenizuj próbkę mózgu w 10% (w/v) zawiesinie w MEM-10. Wirować przy 825 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zaszczepić 200 μl supernatantu zawiesiną 3 x 10 komórek6 MNA (nerwiak zarodkowy myszy) w 1 ml MEM-10 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 1% CO2 . Przenieść zawiesinę komórek homogenatu mózgu do kolby o średnicy 25cm2 i dodać 6 ml MEM-10.</li>
	<li>W tym samym czasie hodować 1 ml zawiesiny komórek homogenatu mózgu w 4-dołkowym szkiełku podstawowym pokrytym teflonem o średnicy 6 mm.</li>
	<li>Po 3–4 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C z 1% CO2 należy utrwalić komórki na szkiełku 4-dołkowym 100% acetonem (v/v).</li>
	<li>Wybarwić szkiełka dwoma sprzężonymi z FITC przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, wykonując kroki 4.4–4.7. Komórki są zakażone, gdy badane są inkluzje wewnątrzcytoplazmatyczne. Zapisz procent zainfekowanych komórek.</li>
	<li>Przeprowadzić trypsynizację i subkulturę zaszczepionej kultury komórkowej, gdy szkiełka są zabarwione jako ujemne:
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę i przepłukać kolbę 5 ml PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml trypsyny do kolby i mocno uderzyć w dno kolby.</li>
		<li>Dodać 6 ml MEM-10 i ponownie zawiesić komórki.</li>
		<li>Umieścić zawiesinę komórkową w nowej kolbie tkankowej (6 ml) i na szkiełku podstawowym z 4 dołkami (1 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj kroki 7.4–7.6, aż do osiągnięcia 100% zakaźności.</li>
	<li>Zebrać supernatant po 24 godzinach inkubacji.</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Ta laboratoryjna standardowa procedura operacyjna (SOP) zapewnia seryjny proces testowania próbek nietoperzy na obecność antygenów wirusa lyssa na Tajwanie. Kluczowe kroki obejmują zastosowanie FAT i RT-PCR. Ważny jest również dobór odpowiednich próbek i skuteczna izolacja wirusa. Ponadto podczas monitorowania lyssawirusów nietoperzy przeprowadzono pewne rozwiązywanie problemów. Główną różnicą były zwierzęta docelowe. Początkowo (2008–2009) zwierzętami docelowymi obserwacji pod kątem wirusa lyssa nietoperzy były żywe nie...

Wirusy z rodzaju Lyssavirus są patogenami odzwierzęcymi. Istnieje co najmniej siedem gatunków lyssawirusów związanych z przypadkami u ludzi1. Oprócz 16 gatunków z tego rodzaju1,2,3, tajwański wirus lyssa nietoperzy (TWBLV)4 i Kotalahti bat lyssavirus5 zostały niedawno zidentyfikowane u nietoperzy, ale ich statusy taksonomiczne nie zostały jeszcze określone.
Nietoperze są naturalnymi gospodarzami większości lyssawirusów, z wyjątkiem Mokola lyssavirus i Ikoma lyssavirus, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane w żadnym z bats1,2,3,6. Informacje na temat lyssawirusów u nietoperzy azjatyckich są nadal ograniczone. Zgłoszono dwa niescharakteryzowane lyssawirusy u nietoperzy azjatyckich (jeden w Indiach, a drugi w Tajlandii)7,8. Jeden przypadek wścieklizny u ludzi związany z ugryzieniem nietoperza w Chinach został zgłoszony w 2002 roku, ale diagnozę postawiono tylko na podstawie obserwacji klinicznej9. W Azji Środkowej wirus Aravan lyssavirus został zidentyfikowany u małego nietoperza usznego (Myotis blythi) w Kirgistanie w 1991 roku, a wirus Khujand lyssavirus został zidentyfikowany u nocka wąsatego (Myotis mystacinus) w Tadżykistanie w 2001 roku10. W Azji Południowej lyssawirus nietoperzy Gannoruwa został zidentyfikowany u lisa indyjskiego latającego (Pteropus medius) na Sri Lance w 2015 roku3. W Azji Południowo-Wschodniej kilka badań serologicznych na nietoperzach na Filipinach, w Tajlandii, Bangladeszu, Kambodży i Wietnamie wykazało zmienną seroprewalencję11,12,13,14,15. Chociaż lyssawirus Irkut został zidentyfikowany u nocka grubonosego (Murina leucogaster) w prowincji Jilin w Chinach w 2012 roku16, dokładne gatunki i lokalizacje lyssawirusów w populacjach nietoperzy Azji Wschodniej pozostają nieznane.
Aby ocenić obecność wirusa lyssa w populacjach tajwańskich nietoperzy, zainicjowano program nadzoru wykorzystujący zarówno bezpośredni FAT, jak i RT-PCR. Tajwański lyssawirus nietoperzy został zidentyfikowany w dwóch przypadkach pipistrellus abramus (Pipistrellus abramus)4 w latach 2016–2017. W niniejszym artykule przedstawiono standardową laboratoryjną procedurę operacyjną do nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie za pomocą wirusa lyssa. Schemat blokowy diagnostyki lyssawirusa nietoperzy w naszym laboratorium jest przedstawiony na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>2,5% Trypsyna (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Trypsyna</td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>kolba Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholowy</td><td>odczynnik NIHON SHIYAKU</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza AMV</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Ostrze</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>System chemiluminescencji</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>Rurka zbiorcza</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Probówka zbiorcza</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica pokrywy</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>Analizator DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Przeciw wściekliźnie Monoklonalna globulina</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>Przeciwciała przeciw wściekliźnie sprzężone z FITC: odczynnik B</td></tr><tr><td>Czterodołkowe szkiełko szklane pokryte teflonem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>System do elektroforezy żelowej</td><td>Major Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td> Inkubator <td>trypsyny</td> <td>Gibco</td><td>14175095</td></tr> Mikroskop odwrócony <tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>DIAGNOSTYKA ŚWIATŁA Odczynnik przeciwko wściekliźnie Odczynnik przeciwko wściekliźnie</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>Przeciwciała przeciw wściekliźnie sprzężone z FITC: odczynnik A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw izolacyjny MagNA Pure Compact NA 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM roztwór witaminowy</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Igła</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Synteza starterów</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Usługa sekwencjonowania</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna wkładka chłonna</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Taq</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Depresor języka</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Pęseta</td><td>Tennyson Instrument medyczny rozwijający CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Winian tylozyny</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na tajwanie pod kątem wirusa lyssa

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Wirusy z rodzaju Lyssavirus są patogenami odzwierzęcymi, a co najmniej siedem gatunków lyssawirusów jest związanych z ludzkimi przypadkami. Ponieważ nietoperze są naturalnymi rezerwuarami większości lyssawirusów, od 2008 roku na Tajwanie prowadzony jest program nadzoru nad nietoperzami lyssawirusem, aby zrozumieć ekologię tych wirusów u nietoperzy. W ramach tego programu pozarządowe organizacje zajmujące się ochroną nietoperzy i lokalne centra kontroli chorób zwierzęcych współpracowały w celu zbierania martwych nietoperzy lub nietoperzy umierających z osłabienia lub choroby. Tkanki mózgowe nietoperzy uzyskano w procesie sekcji zwłok i poddano bezpośredniemu testowi fluorescencyjnemu na przeciwciała (FAT) oraz reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu wykrycia antygenów wirusa lizy i kwasów nukleinowych. W przypadku FAT zaleca się co najmniej dwa różne koniugaty rozpoznające wściekliznę. W przypadku RT-PCR stosuje się dwa zestawy starterów (JW12/N165-146, N113F/N304R) w celu amplifikacji częściowej sekwencji genu nukleoproteiny wirusa lyssa. Ten program nadzoru monitoruje lyssawirusy i inne czynniki odzwierzęce u nietoperzy. Tajwański lyssawirus nietoperzy został znaleziony w dwóch przypadkach pipistrellus abramus (Pipistrellus abramus) w latach 2016–2017. Odkrycia te powinny informować społeczeństwo, pracowników służby zdrowia i naukowców o potencjalnych zagrożeniach związanych z kontaktem z nietoperzami i innymi dzikimi zwierzętami.

Od 2014 roku do maja 2017 roku w ramach nadzoru zebrano truchła 332 nietoperzy należących do 13 gatunków. Dwa z nich dały wynik dodatni. W pierwszym przypadku nietoperza odcisk mózgu w teście FAT z użyciem jednego z komercyjnych przeciwciał przeciwko wściekliznie sprzężonych z FITC dał wynik ujemny (Rycina 2), podczas gdy testy RT-PCR z wykorzystaniem każdego z dwóch zestawów starterów (JW12/N165-146, N113F/N304R) przyniosły wyniki dodatnie (Rycina 3). Uzyskano ...

Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Lyssawirus jest patogenem z grupy chorób zwierzęcych. Aby ocenić obecność wirusa Lyssavirus w populacjach nietoperzy tajwańskich, zainicjowaliśmy program nadzoru. W latach 2016-2018 udało się zidentyfikować cztery wirusy Lyssa.Protokół ten jest wprowadzeniem krok po kroku do nadzoru nad wirusem Lyssavirus na Tajwanie. Mamy nadzieję, że będzie on przydatny dla badaczy, którzy są zainteresowani nadzorem nad wirusem Lyssa w postaci wibrodawców. Ważne jest, aby podłączyć prawidłowy symbol beczki taktycznej.Martwy lub umierający nietoperz jest bardziej odpowiedni niż żywy nietoperz do nadzoru nad Lyssavirus. W zależności od przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w kraju, w którym znajduje się laboratorium; Wykonaj następujące procedury w odpowiednim laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego. I upewnij się, że badacze są obecnie wykwalifikowani i noszą odpowiednie środki ochrony osobistej.Po zebraniu słabych lub chorych nietoperzy lub tusz poproś ekologa nietoperzy o zidentyfikowanie gatunku nietoperzy na podstawie cech morfologicznych okazu. Przedkłada się laboratorium arkusz informacyjny, w tym miejsce pozyskiwania, gatunki, objawy kliniczne i inne istotne dane z każdą próbką nietoperza. Przed rozpoczęciem nekroskopii należy zbadać wszystkie otwory zewnętrzne i sfotografować zewnętrzne cechy nietoperzy, zwłaszcza głowę, uszy i skrzydła w celu rozróżnienia gatunków.Aby pobrać próbkę wymazu z jamy ustnej, umieść nietoperza w pozycji leżącej brzusznej na sterylnej desce rozbiorowej i przymocuj głowę pęsetą. Użyj skalpela, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej okolicy łydki; i pociągnij skórę na boczne strony, aby wykonać nacięcie w czaszce wzdłuż linii środkowej okolicy łydki. Otwórz czaszkę pęsetą, aby odsłonić tkankę mózgową i użyj pęsety, aby delikatnie oddzielić tkankę mózgową od połączonej tkanki nerwowej.Przetnij przekrój poprzeczny mózgu, w tym pień mózgu i móżdżek, i delikatnie dotknij przeciętej powierzchni tkanki mózgowej szklanymi szkiełkami, aby uzyskać wyciski rozmazu. Dociśnij szkiełko do tkanki soczewki, aby usunąć nadmiar tkanki i utrwalić szkiełka wyciskowe w acetonie o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie umieść mały kawałek świeżej tkanki mózgowej w formalinie do badania histopatologicznego.I umieść resztę tkanki w emi-em 10 w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych. Następnie naciąć skórę od kolektora do odbytu wzdłuż linii środkowej ciała i za pomocą pęsety podnieść i oddzielić skórę oraz podkreślić tkanki mięśniowe; aby umożliwić pobranie gruczołów ślinowych, znajdujących się w pobliżu kości żuchwy. Lekko unosząc mostek pęsetą, użyj skalpela, aby przeciąć mostek i ścianę brzucha wzdłuż linii środkowej i przeciąć obojczyki.Użyj igieł, aby przymocować lewą i prawą klatkę piersiową do deski rozwarstwiającej, aby otworzyć klatkę piersiową. I zapisuj grube legiony i stopień zmian pośmiertnych. Następnie użyj pęsety i skalpela, aby usunąć tkanki trzewne, zgodnie z potrzebami planowanej dalszej analizy.Aby wykonać bezpośredni test fluorescencyjny przeciwciał pod koniec utrwalenia, należy wysuszyć szkiełka wymazowe i wybrać do analizy co najmniej dwa fluorescencyjne sprzężone przeciwciała przeciwko wściekliźnie. Przefiltrować jedno przeciwciało na każde szkiełko przez sitko o wielkości 0,45 mikrometra. I inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.Pod koniec inkubacji odcedzić nadmiar koniugatu i umyć szkiełka PBS. Następnie użyj niewielkiej objętości 10% glicerolu, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i zobrazować szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Gdy test na przeciwciała fluorescencyjne lub analiza RT-PCR wykaże wynik pozytywny, homogenizuj próbkę mózgu w 10% zawiesinie w emi-en 10 i osadź tkanki przez odwirowanie.Zaszczepić 200 mikrolitrów super-nat-en trzykrotnie 10 do 6 mysich komórek neuroblastoma i jeden mililitr emi-en 10 przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla. I przenieś zawiesinę jednorodnych komórek mózgu do kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej sześć mililitrów świeżego emi-en 10. Po jednym mililitrze zawiesiny komórek jednorodnych mózgu do czterodołkowego szkiełka szkiełkowego pokrytego teflonem o średnicy sześciu milimetrów i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla na trzy do czterech dni.Po utrwaleniu 100% acetonem wybarwić szkiełka tymi samymi dwoma sprzężonymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, które są używane do testu przeciwciał fluorescencyjnych. I wizualizuj szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić liczbę inkluzji intracida-plas-mic. Po trypsynizacji i podhodowli zaszczepionej kultury komórkowej zgodnie ze standardowymi protokołami, należy zwrócić zimną hodowlę do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne trzy do czterech dni z ponownym liczeniem liczby zakażonych komórek, jak właśnie wykazano, aż do osiągnięcia 100% zakaźności.Od stycznia 2014 r. do maja 2017 r. do celów nadzoru zebrano 332 tusze nietoperzy z 13 gatunków. W tej reprezentatywnej analizie dwóch pozytywnych przypadków nietoperzy, wycisk mózgu okazał się ujemny przy użyciu testu przeciwciał fluorescencyjnych z jednym z komercyjnych, sprzężonych przeciwciał przeciw wściekliźnie, podczas gdy RT-PCR wykorzystujący każdy z dwóch różnych zestawów starterów dał wyniki pozytywne. Poddanie uzyskanej sekwencji ampli-con zapytaniu blast w bazie danych Gen bank ujawniło, że sekwencja była podobna do Lyssawirusów z tożsamościami mniejszymi niż 79%, co potwierdza tożsamość wykrytych Lyssaviruses.Dwa Lyssawirusy zostały następnie z powodzeniem wyizolowane z dwóch mózgów, co potwierdzono testem przeciwciał fluorescencyjnych i sekwencjonowaniem. Kluczowym krokiem do określenia dodatniego wyniku testu na obecność wirusa Lyssa jest test na przeciwciała fluorescencyjne i analiza RT-CPR. Zdecydowanie zaleca się stosowanie dwóch lub więcej przeciwciał przeciwko wściekliźnie w zestawach starterów.Oprócz Lyssavirus za pomocą zamkniętych metod diagnostycznych można monitorować inne patogeny nietoperzy w zoo-nie-kach. Dane te mogą być następnie wykorzystane do informowania społeczeństwa o unikaniu kontaktu z nietoperzami. Im więcej będziemy w stanie badać nietoperzy Lyssavirus, tym lepiej będziemy w stanie zrozumieć jego ewolucję i wpływ na zdrowie publiczne.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

To jest protokół optymalnego przygotowania tkanek do analiz genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych nietoperzy złapanych na wolności. Obejmuje protokoły chwytania i preparacji nietoperzy, konserwacji tkanek i hodowli komórek tkanek nietoperzy.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Wymagana jest szczególna ostrożność przy użyciu "czystych technik" do prawidłowego pobierania i przetwarzania próbek wody do badań metali śladowych w środowisku wodnym. Przedstawiono protokół pobierania próbek, przetwarzania i procedur analitycznych w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyników z monitoringu środowiskowego o wysokiej czułości dla szczegółowych badań metali śladowych.

Czyste pobieranie próbek i analiza wód rzecznych i ujść rzek do badań metali śladowych

Plankton i zawieszone cząstki odgrywają główną rolę w cyklach biogeochemicznych w oceanie. W tym przypadku zapewniamy ultraczystą, bezstresową metodę zbierania różnych rozmiarów cząstek i planktonu na morzu, która jest w stanie poradzić sobie z dużymi ilościami wody morskiej.

Ultra-czyste, wielowarstwowe urządzenie do zbierania frakcjonowanego planktonu morskiego i zawieszonych cząstek

Przedstawiamy protokół syntezy cukrów C5 (ksylozy i arabinozy) z odnawialnej niejadalnej biomasy lignocelulozowej (tj. juty) z obecnością kwaśnych cieczy jonowych Brønsted (BAILs) jako katalizatora w wodzie. Katalizator BAILs wykazywał lepsze parametry katalityczne niż konwencjonalne katalizatory z kwasów mineralnych (H2,SO4 i HCl).

Nowatorska metoda analizy pentozanu obecnego w biomasie juty i jej konwersji na monomery cukrowe przy użyciu kwaśnej cieczy jonowej

Poznaj standardową procedurę nadzoru wirusów Lyssa u nietoperzy na Tajwanie. Protokół obejmuje pobieranie próbek, testy diagnostyczne i analizę danych. Metoda pozwala identyfikować patogeny zoonotyczne i wspiera badania epidemiologiczne.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Przeglądaj więcej filmów