Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa
27 sierpnia 2019
Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.
Lyssawirus jest patogenem z grupy chorób zwierzęcych. Aby ocenić obecność wirusa Lyssavirus w populacjach nietoperzy tajwańskich, zainicjowaliśmy program nadzoru. W latach 2016-2018 udało się zidentyfikować cztery wirusy Lyssa.
Protokół ten jest wprowadzeniem krok po kroku do nadzoru nad wirusem Lyssavirus na Tajwanie. Mamy nadzieję, że będzie on przydatny dla badaczy, którzy są zainteresowani nadzorem nad wirusem Lyssa w postaci wibrodawców. Ważne jest, aby podłączyć prawidłowy symbol beczki taktycznej.
Martwy lub umierający nietoperz jest bardziej odpowiedni niż żywy nietoperz do nadzoru nad Lyssavirus. W zależności od przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w kraju, w którym znajduje się laboratorium; Wykonaj następujące procedury w odpowiednim laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego. I upewnij się, że badacze są obecnie wykwalifikowani i noszą odpowiednie środki ochrony osobistej.
Po zebraniu słabych lub chorych nietoperzy lub tusz poproś ekologa nietoperzy o zidentyfikowanie gatunku nietoperzy na podstawie cech morfologicznych okazu. Przedkłada się laboratorium arkusz informacyjny, w tym miejsce pozyskiwania, gatunki, objawy kliniczne i inne istotne dane z każdą próbką nietoperza. Przed rozpoczęciem nekroskopii należy zbadać wszystkie otwory zewnętrzne i sfotografować zewnętrzne cechy nietoperzy, zwłaszcza głowę, uszy i skrzydła w celu rozróżnienia gatunków.
Aby pobrać próbkę wymazu z jamy ustnej, umieść nietoperza w pozycji leżącej brzusznej na sterylnej desce rozbiorowej i przymocuj głowę pęsetą. Użyj skalpela, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej okolicy łydki; i pociągnij skórę na boczne strony, aby wykonać nacięcie w czaszce wzdłuż linii środkowej okolicy łydki. Otwórz czaszkę pęsetą, aby odsłonić tkankę mózgową i użyj pęsety, aby delikatnie oddzielić tkankę mózgową od połączonej tkanki nerwowej.
Przetnij przekrój poprzeczny mózgu, w tym pień mózgu i móżdżek, i delikatnie dotknij przeciętej powierzchni tkanki mózgowej szklanymi szkiełkami, aby uzyskać wyciski rozmazu. Dociśnij szkiełko do tkanki soczewki, aby usunąć nadmiar tkanki i utrwalić szkiełka wyciskowe w acetonie o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie umieść mały kawałek świeżej tkanki mózgowej w formalinie do badania histopatologicznego.
I umieść resztę tkanki w emi-em 10 w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych. Następnie naciąć skórę od kolektora do odbytu wzdłuż linii środkowej ciała i za pomocą pęsety podnieść i oddzielić skórę oraz podkreślić tkanki mięśniowe; aby umożliwić pobranie gruczołów ślinowych, znajdujących się w pobliżu kości żuchwy. Lekko unosząc mostek pęsetą, użyj skalpela, aby przeciąć mostek i ścianę brzucha wzdłuż linii środkowej i przeciąć obojczyki.
Użyj igieł, aby przymocować lewą i prawą klatkę piersiową do deski rozwarstwiającej, aby otworzyć klatkę piersiową. I zapisuj grube legiony i stopień zmian pośmiertnych. Następnie użyj pęsety i skalpela, aby usunąć tkanki trzewne, zgodnie z potrzebami planowanej dalszej analizy.
Aby wykonać bezpośredni test fluorescencyjny przeciwciał pod koniec utrwalenia, należy wysuszyć szkiełka wymazowe i wybrać do analizy co najmniej dwa fluorescencyjne sprzężone przeciwciała przeciwko wściekliźnie. Przefiltrować jedno przeciwciało na każde szkiełko przez sitko o wielkości 0,45 mikrometra. I inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.
Pod koniec inkubacji odcedzić nadmiar koniugatu i umyć szkiełka PBS. Następnie użyj niewielkiej objętości 10% glicerolu, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i zobrazować szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Gdy test na przeciwciała fluorescencyjne lub analiza RT-PCR wykaże wynik pozytywny, homogenizuj próbkę mózgu w 10% zawiesinie w emi-en 10 i osadź tkanki przez odwirowanie.
Zaszczepić 200 mikrolitrów super-nat-en trzykrotnie 10 do 6 mysich komórek neuroblastoma i jeden mililitr emi-en 10 przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla. I przenieś zawiesinę jednorodnych komórek mózgu do kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej sześć mililitrów świeżego emi-en 10. Po jednym mililitrze zawiesiny komórek jednorodnych mózgu do czterodołkowego szkiełka szkiełkowego pokrytego teflonem o średnicy sześciu milimetrów i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla na trzy do czterech dni.
Po utrwaleniu 100% acetonem wybarwić szkiełka tymi samymi dwoma sprzężonymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, które są używane do testu przeciwciał fluorescencyjnych. I wizualizuj szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić liczbę inkluzji intracida-plas-mic. Po trypsynizacji i podhodowli zaszczepionej kultury komórkowej zgodnie ze standardowymi protokołami, należy zwrócić zimną hodowlę do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne trzy do czterech dni z ponownym liczeniem liczby zakażonych komórek, jak właśnie wykazano, aż do osiągnięcia 100% zakaźności.
Od stycznia 2014 r. do maja 2017 r. do celów nadzoru zebrano 332 tusze nietoperzy z 13 gatunków. W tej reprezentatywnej analizie dwóch pozytywnych przypadków nietoperzy, wycisk mózgu okazał się ujemny przy użyciu testu przeciwciał fluorescencyjnych z jednym z komercyjnych, sprzężonych przeciwciał przeciw wściekliźnie, podczas gdy RT-PCR wykorzystujący każdy z dwóch różnych zestawów starterów dał wyniki pozytywne. Poddanie uzyskanej sekwencji ampli-con zapytaniu blast w bazie danych Gen bank ujawniło, że sekwencja była podobna do Lyssawirusów z tożsamościami mniejszymi niż 79%, co potwierdza tożsamość wykrytych Lyssaviruses.
Dwa Lyssawirusy zostały następnie z powodzeniem wyizolowane z dwóch mózgów, co potwierdzono testem przeciwciał fluorescencyjnych i sekwencjonowaniem. Kluczowym krokiem do określenia dodatniego wyniku testu na obecność wirusa Lyssa jest test na przeciwciała fluorescencyjne i analiza RT-CPR. Zdecydowanie zaleca się stosowanie dwóch lub więcej przeciwciał przeciwko wściekliźnie w zestawach starterów.
Oprócz Lyssavirus za pomocą zamkniętych metod diagnostycznych można monitorować inne patogeny nietoperzy w zoo-nie-kach. Dane te mogą być następnie wykorzystane do informowania społeczeństwa o unikaniu kontaktu z nietoperzami. Im więcej będziemy w stanie badać nietoperzy Lyssavirus, tym lepiej będziemy w stanie zrozumieć jego ewolucję i wpływ na zdrowie publiczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia standardową procedurę laboratoryjną dotyczącą diagnostyki antygenów lyssavirusa u nietoperzy na Tajwanie. Został on opracowany, aby pomóc badaczom w efektywnym prowadzeniu nadzoru nad wirusami z rodzaju Lyssavirus.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Choroby odzwierzęce
- Nadzór nad dziką fauną
Wstęp
- Lyssavirus jest patogenem odzwierzęcym.
- Programy nadzoru są niezbędne do monitorowania populacji nietoperzy.
- W latach 2016–2018 u tajwańskich nietoperzy zidentyfikowano cztery rodzaje Lyssaviruses.
- Celem niniejszego protokołu jest standaryzacja procedur testowych.
Cel badania
- Ocena obecności Lyssavirus w populacjach nietoperzy na Tajwanie.
- Zapewnienie badaczom szczegółowej instrukcji krok po kroku.
- Zwiększenie zrozumienia mechanizmów transmisji chorób odzwierzęcych.
Zastosowane metody
- Zbieranie próbek od nietoperzy.
- Testy diagnostyczne w kierunku antygenów lyssavirusa.
- Analiza i interpretacja danych.
- Wdrażanie protokołów nadzoru.
Główne wyniki
- Identyfikacja czterech różnych lyssavirusów.
- Skuteczna realizacja programu nadzoru.
- Zwiększenie świadomości na temat obecności lyssavirusów u nietoperzy.
- Opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla testów.
Wnioski
- Protokół stanowi cenny zasób dla badaczy.
- Zwiększa możliwości nadzoru nad lyssavirusami na Tajwanie.
- Przyczynia się do zrozumienia dynamiki chorób odzwierzęcych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół nadzoru wspiera wczesne wykrywanie zoonotycznych lyssavirusów w rezerwuarach dzikich zwierząt, umożliwiając proaktywną ocenę ryzyka dla zdrowia publicznego oraz gotowości weterynaryjnej. Poprzez standaryzację metod detekcji antygenów i kwasów nukleinowych, zapewnia on powtarzalne ramy monitorowania ekologii wirusów w populacjach nietoperzy. Podejście to przyczynia się do mechanistycznego ograniczania ryzyka w przedklinicznej walidacji celów poprzez wyjaśnienie obecności patogenów w systemach istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji wirus-gospodarz w naturalnych rezerwuarach w celu wyboru celów dla opracowania leków przeciwwirusowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację przetwarzania tkanek oraz walidację dwiema metodami (FAT i RT-PCR), co pozwala ograniczyć odsetek wyników fałszywie ujemnych podczas przesiewowego wykrywania patogenów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ułatwia standaryzację analizy poprzez zastosowanie podwójnych koniugatów przeciwciał oraz zwalidowanych zestawów starterów do amplifikacji nukleoproteiny lyssavirusa.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalne procesy nadzoru poprzez zdefiniowanie jasnych protokołów sekcji, pobierania próbek i bezpieczeństwa biologicznego przy obchodzeniu się z okazami dzikich zwierząt.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Generuje dane sekwencyjne do analizy filogenetycznej, wspierając śledzenie ewolucyjne wariantów lyssavirusów istotnych dla ryzyka transmisji międzygatunkowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużny monitoring rozpowszechnienia wirusa, dostarczając informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w priorytetyzacji programów opracowywania leków przeciwwirusowych w zależności od poziomu zagrożenia ekologicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy biologii odkrywczej, dostarczając zwalidowanych próbek biologicznych do późniejszych analiz wirusologicznych i charakterystyki antygenów. Wspiera ona przygotowanie do screeningu poprzez ustandaryzowane przygotowanie tkanki mózgowej, odpowiedniej do immunofluorescencji i detekcji molekularnej. Protokół generuje wyniki ilościowe i jakościowe (sygnał fluorescencyjny, wielkość amplikonu, dane sekwencyjne), które umożliwiają analizę porównawczą w zależności od czasu, lokalizacji geograficznej oraz gatunku gospodarza.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących krążenia lyssavirusów w populacjach nietoperzy poprzez systematyczne gromadzenie próbek i potwierdzenie diagnostyczne.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalność analizy poprzez wymaganie podwójnego testowania przeciwciał oraz weryfikację za pomocą dwóch zestawów starterów podczas detekcji kwasów nukleinowych.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, w tym odsetek pozytywnych wyników FAT, skuteczność amplifikacji RT-PCR oraz procentową zgodność sekwencji na potrzeby porównań z bazami danych.
- Badania translacyjne: Łączy nadzór terenowy z istotnością przedkliniczną poprzez identyfikację szczepów lyssavirusów o potencjale zoonotycznym w celu ich dalszej charakterystyki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy przenośny model nadzoru, który można zastosować w innych regionach podatnych na lyssavirusy lub w programach monitorowania dzikich zwierząt pod kątem zoonoz.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną modeli ryzyka zoonotycznego dzięki empirycznym danym dotyczącym wykrywania lyssavirusów w rezerwuarach dzikich zwierząt.
- Wartość operacyjna: Promuje standaryzację międzylaboratoryjną poprzez zdefiniowane poziomy bezpieczeństwa biologicznego, wymagania dotyczące Środków Ochrony Indywidualnej (PPE) oraz procedury postępowania z próbkami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje portfelowe, zapewniając wczesne ostrzeganie o pojawianiu się wirusów na stykach o wysokim ryzyku między nietoperzami, ludźmi i zwierzętami domowymi.
- Wpływ na portfel: Umożliwia dostosowaną do ryzyka alokację zasobów na rzecz kandydatów na leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania przeciwko lyssavirusom, w oparciu o różnorodność szczepów uzyskaną z nadzoru epidemiologicznego.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji zwłok nietoperzy, identyfikacji gatunków oraz praktyk laboratoryjnych na poziomie biosafety level 2 lub 3.
- Metoda zależy od dostępności sprzętu do mikroskopii fluorescencyjnej, aparatury do RT-PCR oraz zachowania łańcucha chłodniczego podczas konserwacji kwasów nukleinowych (emi-em 10).
- Konieczna jest koordynacja działań pomiędzy grupami ochrony dzikiej przyrody, organami weterynaryjnymi a laboratoriami diagnostycznymi w celu terminowego dostarczenia próbek.
- Podczas dostosowywania protokołów należy uwzględnić regionalne różnice w składzie gatunkowym nietoperzy oraz rozpowszechnieniu szczepów lyssavirusa.
- Wyniki są ograniczone przez jakość materiału, ponieważ degradacja pośmiertna może wpływać na integralność antygenów i wydajność RNA w dalszych badaniach.
