Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Lyssawirus jest patogenem z grupy chorób zwierzęcych. Aby ocenić obecność wirusa Lyssavirus w populacjach nietoperzy tajwańskich, zainicjowaliśmy program nadzoru. W latach 2016-2018 udało się zidentyfikować cztery wirusy Lyssa.

Protokół ten jest wprowadzeniem krok po kroku do nadzoru nad wirusem Lyssavirus na Tajwanie. Mamy nadzieję, że będzie on przydatny dla badaczy, którzy są zainteresowani nadzorem nad wirusem Lyssa w postaci wibrodawców. Ważne jest, aby podłączyć prawidłowy symbol beczki taktycznej.

Martwy lub umierający nietoperz jest bardziej odpowiedni niż żywy nietoperz do nadzoru nad Lyssavirus. W zależności od przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w kraju, w którym znajduje się laboratorium; Wykonaj następujące procedury w odpowiednim laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego. I upewnij się, że badacze są obecnie wykwalifikowani i noszą odpowiednie środki ochrony osobistej.

Po zebraniu słabych lub chorych nietoperzy lub tusz poproś ekologa nietoperzy o zidentyfikowanie gatunku nietoperzy na podstawie cech morfologicznych okazu. Przedkłada się laboratorium arkusz informacyjny, w tym miejsce pozyskiwania, gatunki, objawy kliniczne i inne istotne dane z każdą próbką nietoperza. Przed rozpoczęciem nekroskopii należy zbadać wszystkie otwory zewnętrzne i sfotografować zewnętrzne cechy nietoperzy, zwłaszcza głowę, uszy i skrzydła w celu rozróżnienia gatunków.

Aby pobrać próbkę wymazu z jamy ustnej, umieść nietoperza w pozycji leżącej brzusznej na sterylnej desce rozbiorowej i przymocuj głowę pęsetą. Użyj skalpela, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej okolicy łydki; i pociągnij skórę na boczne strony, aby wykonać nacięcie w czaszce wzdłuż linii środkowej okolicy łydki. Otwórz czaszkę pęsetą, aby odsłonić tkankę mózgową i użyj pęsety, aby delikatnie oddzielić tkankę mózgową od połączonej tkanki nerwowej.

Przetnij przekrój poprzeczny mózgu, w tym pień mózgu i móżdżek, i delikatnie dotknij przeciętej powierzchni tkanki mózgowej szklanymi szkiełkami, aby uzyskać wyciski rozmazu. Dociśnij szkiełko do tkanki soczewki, aby usunąć nadmiar tkanki i utrwalić szkiełka wyciskowe w acetonie o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie umieść mały kawałek świeżej tkanki mózgowej w formalinie do badania histopatologicznego.

I umieść resztę tkanki w emi-em 10 w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych. Następnie naciąć skórę od kolektora do odbytu wzdłuż linii środkowej ciała i za pomocą pęsety podnieść i oddzielić skórę oraz podkreślić tkanki mięśniowe; aby umożliwić pobranie gruczołów ślinowych, znajdujących się w pobliżu kości żuchwy. Lekko unosząc mostek pęsetą, użyj skalpela, aby przeciąć mostek i ścianę brzucha wzdłuż linii środkowej i przeciąć obojczyki.

Użyj igieł, aby przymocować lewą i prawą klatkę piersiową do deski rozwarstwiającej, aby otworzyć klatkę piersiową. I zapisuj grube legiony i stopień zmian pośmiertnych. Następnie użyj pęsety i skalpela, aby usunąć tkanki trzewne, zgodnie z potrzebami planowanej dalszej analizy.

Aby wykonać bezpośredni test fluorescencyjny przeciwciał pod koniec utrwalenia, należy wysuszyć szkiełka wymazowe i wybrać do analizy co najmniej dwa fluorescencyjne sprzężone przeciwciała przeciwko wściekliźnie. Przefiltrować jedno przeciwciało na każde szkiełko przez sitko o wielkości 0,45 mikrometra. I inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.

Pod koniec inkubacji odcedzić nadmiar koniugatu i umyć szkiełka PBS. Następnie użyj niewielkiej objętości 10% glicerolu, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i zobrazować szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Gdy test na przeciwciała fluorescencyjne lub analiza RT-PCR wykaże wynik pozytywny, homogenizuj próbkę mózgu w 10% zawiesinie w emi-en 10 i osadź tkanki przez odwirowanie.

Zaszczepić 200 mikrolitrów super-nat-en trzykrotnie 10 do 6 mysich komórek neuroblastoma i jeden mililitr emi-en 10 przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla. I przenieś zawiesinę jednorodnych komórek mózgu do kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej sześć mililitrów świeżego emi-en 10. Po jednym mililitrze zawiesiny komórek jednorodnych mózgu do czterodołkowego szkiełka szkiełkowego pokrytego teflonem o średnicy sześciu milimetrów i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla na trzy do czterech dni.

Po utrwaleniu 100% acetonem wybarwić szkiełka tymi samymi dwoma sprzężonymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, które są używane do testu przeciwciał fluorescencyjnych. I wizualizuj szkiełka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić liczbę inkluzji intracida-plas-mic. Po trypsynizacji i podhodowli zaszczepionej kultury komórkowej zgodnie ze standardowymi protokołami, należy zwrócić zimną hodowlę do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne trzy do czterech dni z ponownym liczeniem liczby zakażonych komórek, jak właśnie wykazano, aż do osiągnięcia 100% zakaźności.

Od stycznia 2014 r. do maja 2017 r. do celów nadzoru zebrano 332 tusze nietoperzy z 13 gatunków. W tej reprezentatywnej analizie dwóch pozytywnych przypadków nietoperzy, wycisk mózgu okazał się ujemny przy użyciu testu przeciwciał fluorescencyjnych z jednym z komercyjnych, sprzężonych przeciwciał przeciw wściekliźnie, podczas gdy RT-PCR wykorzystujący każdy z dwóch różnych zestawów starterów dał wyniki pozytywne. Poddanie uzyskanej sekwencji ampli-con zapytaniu blast w bazie danych Gen bank ujawniło, że sekwencja była podobna do Lyssawirusów z tożsamościami mniejszymi niż 79%, co potwierdza tożsamość wykrytych Lyssaviruses.

Dwa Lyssawirusy zostały następnie z powodzeniem wyizolowane z dwóch mózgów, co potwierdzono testem przeciwciał fluorescencyjnych i sekwencjonowaniem. Kluczowym krokiem do określenia dodatniego wyniku testu na obecność wirusa Lyssa jest test na przeciwciała fluorescencyjne i analiza RT-CPR. Zdecydowanie zaleca się stosowanie dwóch lub więcej przeciwciał przeciwko wściekliźnie w zestawach starterów.

Oprócz Lyssavirus za pomocą zamkniętych metod diagnostycznych można monitorować inne patogeny nietoperzy w zoo-nie-kach. Dane te mogą być następnie wykorzystane do informowania społeczeństwa o unikaniu kontaktu z nietoperzami. Im więcej będziemy w stanie badać nietoperzy Lyssavirus, tym lepiej będziemy w stanie zrozumieć jego ewolucję i wpływ na zdrowie publiczne.