Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

Kluczowym pytaniem, na które chcemy odpowiedzieć za pomocą tej metody, jest to, w jaki sposób możemy wykorzystać próbki RNA z materiału zakupionego na lokalnych targach spożywczych do klonowania genów istotnych z biotechnologicznego punktu widzenia? W tym przypadku używamy ostryg pacyficznych jako studium przypadku, aby zademonstrować to podejście i potencjalne dalsze zastosowanie. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obejść konwencjonalne sekwencjonowanie genomu lub cDNA próbek ostryg.

Zamiast tego sekwencje podjednostki I oksydazy cytochromu c i dehydrogenazy NADH porównano z publicznie dostępnymi sekwencjami referencyjnymi z ostrygi pacyficznej, aby wybrać najbliżej spokrewnioną próbkę. CDNA przygotowane z tego próbki może być bezpośrednio wykorzystane do klonowania genów istotnych z biotechnologicznego punktu widzenia, które mogą być wybrane na podstawie publicznie dostępnych informacji o sekwencji. Procedurę zademonstrują Yongmei Lyu i Yuquan Li, dwaj doktoranci z Centrum Badawczego Bioinżynierii Glikomiksów i Glikanów na Uniwersytecie Rolniczym w Nankinie.

Aby przygotować próbkę tkanki ostrygi, użyj wysterylizowanego skalpela, aby wyciąć około 100 miligramów jednorodnej tkanki miękkiej z przybliżonego środka geometrycznego każdej próbki ostrygi. Przenieść próbkę do moździerza wypełnionego 50 mililitrami ciekłego azotu. Zmiel zamrożoną tkankę ostrygi na drobny proszek.

Odważyć 75 miligramów zamrożonej tkanki każdej próbki do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i wymieszać z jednym mililitrem odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu guanidyny. Najważniejszym etapem tej procedury jest etap ekstrakcji RNA. Aby zminimalizować degradację RNA, konieczne jest skrócenie czasu między pobraniem tkanki ostrygi a ekstrakcją RNA.

Odwirować próbkę w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i dokładnie wymieszaj w mikserze wirowym przez 10 do 15 sekund, aż mieszanina zmieni kolor na mlecznobiały. Następnie wirować przez 15 minut, tak jak poprzednio.

Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie przenieś górną warstwę wodną, nie naruszając interfazy, do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodać 500 mikrolitrów alkoholu izopropylowego do probówki wirówkowej i delikatnie odwrócić, aby wymieszać próbki. Następnie pozostaw próbki na lodzie na 20 minut.

Wirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez osiem minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze 75% etanolu i odwirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć cały sklarowany osad i powtórzyć mycie w etanolu.

Suszyć granulki przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść wysuszoną osadkę RNA w 25 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC i trzymaj probówkę na lodzie. Próbki RNA należy zużyć w ciągu 24 godzin.

Aby wygenerować bibliotekę cDNA, najpierw przygotuj mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki RNA w 300-mikrolitrowej probówce do PCR, dodając roztwory zgodnie z manuskryptem. Dodaj jeden mikrolitr wyekstrahowanej próbki RNA do probówki. Inkubować mieszaninę w termocyklerze PCR przez 60 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie zwiększać temperaturę do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Utworzoną bibliotekę cDNA przechowuj przez okres do 12 miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Najpierw dodaj jeden mikrolitr wygenerowanej biblioteki cDNA do probówek zawierających mieszaniny PCR, przygotowane zgodnie z manuskryptem. Umieść probówki PCR w termocyklerze PCR i wykonaj amplifikację PCR z początkowym etapem denaturacji i 35 cyklami reakcji PCR składającymi się z etapu wyżarzania, etapu wydłużania i etapu denaturacji zgodnie z manuskryptem.

Po cyklach wykonaj jeden końcowy etap wydłużania przez pięć minut. Użyj pięciu mikrolitrów produktu PCR, aby zweryfikować jakość za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Obserwuj amplifikowany gen COX1 lub ND jako pojedyncze prążek odpowiednio w 759 lub 748 parach zasad.

Aby oczyścić pozostałą część produktu PCR, do każdej próbki dodaj 100 mikrolitrów buforu wiążącego DNA zawierającego wysokie stężenia soli chaotropowych. Krótko zmieszaj, aby wymieszać zawartość. Umieść kolumnę oczyszczającą w dwumililitrowej probówce wirówkowej.

Odpipetować mieszaninę reakcyjną do kolumny. Umieścić probówkę z zamontowaną kolumną w wirówce na 14 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu filtratu z dwumililitrowej probówki wirówkowej, przemyć dwukrotnie 700 i 400 mikrolitrami roztworu myjącego W2 przez odwirowanie z stężeniem 14 000 g.

Następnie podgrzej jeden mililitr wody dejonizowanej do 65 stopni Celsjusza w metalowym grzejniku. Przenieś kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i odpipetuj 25 mikrolitrów podgrzanej wody dejonizowanej do środka białej membrany kolumny. Pozwól membranie moczyć się przez minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie odwirować probówkę z kolumną o ciśnieniu 14 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić kolumnę i przechowywać oczyszczony produkt PCR przez okres do 12 miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Opcjonalnie startery odwrotne COX1 lub ND mogą być również używane do sekwencjonowania dwukierunkowego.

Do sekwencjonowania Sangera należy użyć odpowiedniego startera COX1 lub ND do przodu. Po pobraniu wyników sekwencjonowania porównaj sekwencje z sekwencją genomu referencyjnego szczepu ostryg pacyficznych za pomocą narzędzia online NCBI Nucleotide BLAST. Użyj odpowiednich starterów do przodu i do tyłu genów MgUGD i MgUXS, aby amplifikować i oczyszczać za pomocą PCR, tak jak to miało miejsce wcześniej.

Po inkubacji oczyszczonych produktów PCR z buforem wytrawiającym, przygotuj wstępnie strawiony wektor pET-30a, rozpuszczając 500 nanogramów pET-30a w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj wodę dejonizowaną, aby uzupełnić do 16 mikrolitrów. Następnie dodaj do probówki dwa mikrolitry 10-krotnie skoncentrowanego buforu wytrawiającego i po jednym mikrolitrze każdej z 20 jednostek endonukleaz restrykcyjnych Nde1 i Xho1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie dodaj jeden mikrolitr jednostkę fosfatazy alkalicznej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkową godzinę. Następnie umieść probówkę w nagrzanym metalowym grzejniku blokowym w temperaturze 75 stopni Celsjusza na 10 minut, aby dezaktywować fosfatazę alkaliczną. Po wyhodowaniu komórek E. coli BL21 zawierających geny MgUGD i MgUXS, przenieś kulturę do 400-mililitrowej pożywki LB w dwulitrowej kolbie do wytrząsania i umieść ją na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po trzech godzinach sprawdź gęstość optyczną na fotometrze o długości fali 600 nanometrów i upewnij się, że osiąga absorpcję około 0,5. Następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki do 20 stopni Celsjusza. Dodaj 400 mikrolitrów jednomolowego IPTG, aby indukować ekspresję rekombinowanych białek przez trzy godziny.

Po pobraniu komórek należy rozbić komórki za pomocą sonikacji przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, a następnie zebrać supernatant w nowej probówce do testu aktywności. Po oznaczeniu aktywności wygasić reakcje, dodając 20 mikrolitrów metanolu i 40 mikrolitrów chloroformu do mieszanin MgUXS i MgUGD.

Mieszaniny próbek należy zawirować i odwirować pod ciśnieniem 14 000 g przez sześć minut i cztery stopnie Celsjusza. Zebrać górną warstwę wodną każdej probówki w nowych probówkach do spektrometrii mas MALDI-TOF. W tym eksperymencie porównano zgodność sekwencji genów COX1 i ND wysoce rozbieżnego okazu z referencyjnym szczepem ostryg pacyficznych.

Czerwone strzałki pokazują różnice nukleotydowe między sekwencją referencyjną a sekwencją uzyskanych próbek cDNA. Sekwencje genów COX1 i ND blisko spokrewnionego okazu ostrygi wykazują niewielką rozbieżność z referencyjnym szczepem ostryg pacyficznych. Spektrometria mas MALDI-TOF pokazuje udane zastosowanie biblioteki cDNA do klonowania genów MgUGD i MgUXS o znaczeniu przemysłowym.

Obraz żelu identyfikuje również kwas UDP-glukuronowy i UDP-ksylozę powstające w wyniku enzymatycznego działania kolejno eksprymowanych i oczyszczanych MgUGD i MgUXS. Metoda ta nie wymaga idealnego dopasowania między sekwencją referencyjną a uzyskanymi sekwencjami markerowymi i powinna dać badaczowi pewność pracy z ostrygami bez odniesień. Zasadniczo metoda ta może być stosowana do każdej próbki biologicznej nieposiadającej odniesień, dla której sekwencje blisko spokrewnionego gatunku referencyjnego są publicznie dostępne.

Metoda ta umożliwia badaczom niebędącym ekspertami łatwy dostęp do materiału genetycznego o potencjalnym znaczeniu biologicznym i toruje drogę większej liczbie naukowców do pracy z łatwo dostępnymi, ale nie w pełni zidentyfikowanymi próbkami biologicznymi.