Name: Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Poznaj metodę generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z ostryg pacyficznych z lokalnych rynków spożywczych. Technika ta umożliwia klonowanie genów biotechnologicznych bez konwencjonalnego sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L., granty o numerze 31470435 dla G.Y.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

UWAGA: Przegląd schematu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Zdobądź próbki ostryg. Ostrygi należy przechowywać na lodzie w okresie po zbiorach, podczas transportu oraz przed użyciem laboratoryjnym i przetwarzaniem w ciągu 4-7 dni po zakupie. 
	UWAGA: Na potrzeby tego protokołu ostrygi zakupiono na Zhong Cai Wholesale Market w Nankinie (pochodzącym z Ningde, Fujian, Chiny i Lianyungang, Jiangsu, Chiny), Haijie Aquatic Product Company w Qingdao (pochodzącym z Qingdao, Shandong, Chiny), Jucheng Aquatic Product Company w Yantai (pochodzącym z Yantai, Shandong, Chiny) i Jinxiu Aquatic Product Company w Qingdao (pochodzącym z Qingdao, Shandong, Chiny)).</li>
</ol>
2. Izolacja RNA przez ekstrakcję tiocyjanianem guanidyny i fenolem
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki tkanki ostrygi
	<ol>
		<li>Wyciąć około 100 mg jednorodnej tkanki miękkiej z przybliżonego środka geometrycznego każdej próbki ostrygi za pomocą wysterylizowanego skalpela i przenieść próbki do ciekłego azotu.</li>
		<li>Pozostałą część ostryg należy poddać eutanazji poprzez zamrożenie w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę i wyrzucić jako odpady biologiczne.</li>
		<li>Zmielić zamrożoną tkankę ostrygi na drobny proszek w moździerzu (200 ml) wypełnionym 50 ml ciekłego azotu.</li>
		<li>Odważyć 75 mg zamrożonej tkanki z każdej próbki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 1 ml odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu guanidyny. Odwirować próbkę w temperaturze 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 200 μl chloroformu i dokładnie wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s, aż mieszanina zmieni kolor na mlecznobiały.</li>
	<li>Odwirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut i ostrożnie przenieść górną warstwę wodną za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając interfazy, do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl alkoholu izopropylowego i delikatnie wymieszać próbki przez odwrócenie, a następnie pozostawić próbki na 20 minut na lodzie. Wirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić każdy z granulek w 1 ml 75% EtOH i odwirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć cały supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5 raz. Suszyć granulki przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Nie suszyć dłużej; w przeciwnym razie rozpuszczenie osadu RNA w następnym kroku może być trudne.</li>
	<li>Rozpuść wysuszony granulat RNA w 25 μl wody uzdatnionej DEPC (dietylopirowęglanem) i trzymaj probówkę na lodzie. Próbki RNA należy zużyć w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
3. Generowanie biblioteki cDNA przez odwrotną transkrypcję
<ol>
	<li>Dla każdej próbki RNA przygotować mieszaninę reakcyjną przy użyciu komercyjnego systemu odwrotnej transkrypcji przy użyciu pipety o pojemności 10 μl: Dodać 4 μL roztworu MgCl2, 2 μL 10x buforu reakcyjnego, 2 μL roztworu dNTP, 0,5 μL inhibitora RNazy, 0,7 μL odwrotnej transkryptazy AMV, 0,5 μL startera Oligo(dT) 15, 1 μl wyekstrahowanej próbki RNA i 9,3 μlH2Odo probówki PCR o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w termocyklerze PCR przez 60 minut w temperaturze 42 °C, a następnie zwiększać temperaturę do 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wygenerowaną bibliotekę cDNA należy przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Amplifikacja i oczyszczanie genów mitochondrialnych
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę do PCR za pomocą pipety o pojemności 10 μl. Dodać 0,25 μl (1,25 U) polimerazy DNA o wysokiej wierności, 2 μl roztworu dNTP (2,5 mM każdego dNTP), 0,5 μl startera COX1 lub ND forward (100 μM), 0,5 μl odpowiedniego startera odwrotnego COX1 lub ND (100 μM), 1 μl biblioteki cDNA, 5 μl 5x roztworu buforowego i 16 μl destylowanegoH2Odo 300 μ L Probówka do PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR, stosując następujące parametry: Po wstępnym etapie denaturacji w temperaturze 95 °C (czas trwania 5 min), 35 cyklach reakcji PCR składających się z etapu wyżarzania w temperaturze 55 °C (30 s), etapu wydłużania w temperaturze 72 °C (2 min) i etapu denaturacji w temperaturze 95 °C (30 s), należy wykonać jeden końcowy etap wydłużania przez 5 minut w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Użyć 5 μl produktu PCR, aby zweryfikować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym jakość otrzymanego produktu PCR. Obserwuj amplifikowany gen COX1 lub ND jako pojedyncze prążek odpowiednio w 759 lub 748 parach zasad.</li>
	<li>Oczyść pozostałą część produktu PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu "PCR-A" (bufor wiążący DNA, który zawiera wysokie stężenia soli chaotropowych<klasa sup="xref">11) do próbki. Krótko zmieszaj, aby wymieszać zawartość.</li>
		<li>Umieścić kolumnę oczyszczającą w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Odpipetować mieszaninę reakcyjną opisaną w ppkt 4.4.1. do kolumny. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyrzucić filtrat z probówki wirówkowej. Umieścić kolumnę z powrotem w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml, dodać 700 μl roztworu "W2" do kolumny i odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej ("W2" jest roztworem płuczącym zawierającym wysokie stężenie etanolu w celu usunięcia pozostałości soli chaotropowych z kolumny oczyszczającej).</li>
		<li>Odrzucić filtrat i umieścić kolumnę z powrotem w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Dodać 400 μl roztworu "W2" do kolumny i odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Podgrzej 1 ml wody dejonizowanej do temperatury 65 °C w metalowym podgrzewaczu. Przenieść kolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 25 μl gorącej, wstępnie podgrzanej wody dejonizowanej o temperaturze 65 °C do środka białej membrany kolumny. Pozwól membranie moczyć się przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie i porównywanie genów mitochondrialnych
<ol>
	<li>Wyślij oczyszczone próbki PCR z kroku 4.5 do sekwencjonowania Sangera przy użyciu odpowiednich starterów COX1 lub ND forward jako starterów sekwencjonowania. Opcjonalnie startery odwrotne COX1 lub ND mogą być również używane do sekwencjonowania dwukierunkowego.</li>
	<li>Po pobraniu wyników sekwencjonowania porównaj sekwencje z sekwencją genomu referencyjnego szczepu ostryg pacyficznych (identyfikator taksonomii NCBI: 29159) za pomocą narzędzia online NCBI Nucleotide BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
6. Zastosowanie biblioteki cDNA do klonowania genów MgUGD i MgUXS
<ol>
	<li>Amplifikować i oczyszczać geny MgUGD i MgUXS przy użyciu odpowiednich starterów do przodu i do tyłu MgUGD i MgUXS metodą PCR, wykonując kroki 4.1-4.4.</li>
	<li>Przenieść 2 μl buforu wytrawiającego (10x zagęszczonego) i 6 μl wody dejonizowanej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl oczyszczonych produktów MgUGD lub MgUXS PCR razem z endonukleazami restrykcyjnymi Nde I i Xho I (po 1 μl, 20 j.). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Przygotuj wstępnie strawiony wektor pET-30a: Przenieś 500 ng wektora pET-30a do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i uzupełnij objętość do 16 μl za pomocą wody dejonizowanej. Dodać 2 μl buforu wytrawiającego (10x zagęszczonego) razem z endonukleazami restrykcyjnymi Nde I i Xho I (po 1 μL, 20 U).
	<ol>
		<li>Po inkubacji mieszaniny w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, dodać 1 μl fosfatazy alkalicznej (1 j.) i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkową godzinę. Dezaktywować fosfatazę alkaliczną przez ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 10 minut w podgrzewaczu z metalowego bloku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 4 μl strawionych produktów DNA MgUGD lub MgUXS do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl strawionego wektora pET-30a. Dodać 1 μl buforu ligacyjnego (10x), 1 μl ligazy T4 (3 j.) i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 22 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Przekształć elektrokompetentne komórki E. coli Mach1 przez elektroporację przy użyciu produktów ligacji. Rozprowadzić przekształcone komórki na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Sprawdź kolonie pod kątem pożądanej insercji przez sekwencjonowanie Sangera przy użyciu specyficznego dla plazmidu promotora T7 i starterów terminatora. Przygotuj plazmidy ze zwalidowanych klonów bakteryjnych.</li>
</ol>
7. Testy ekspresji i aktywności MgUGD i MgUXS
<ol>
	<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) z plazmidami zawierającymi geny MgUGD i MgUXS i rozprowadź transformowane komórki na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg / ml kanamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Hoduj pojedynczą kolonię w podłożu 5 ml LB z 50 μg/ml kanamycyny przez noc. Przenieść kulturę do pożywki LB o pojemności 400 ml i ciągle wstrząsać z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm (OD600) osiągnie absorpcję około 0,5.
	<ol>
		<li>Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 °C i dodać 400 μl izopropylu β-D-tiogalaktopiranozydu (stężenie 1 M). Indukować ekspresję rekombinowanych białek przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić granulki w 10 ml buforu do lizy (100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 1% Triton X-100, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), pH 8,0).</li>
	<li>Rozbijać komórki za pomocą sonikacji przez 20 minut (40 cykli włączania/wyłączania o amplitudzie 20 μm przez 15 s w temperaturze 4 °C). Wirować przy 14 000 x g w temperaturze 4°C przez 20 minut i zebrać supernatant do testu aktywności.</li>
	<li>Przeprowadzić test aktywności MgUGD przez inkubację 2 μl lizatu komórkowego z 2 μl UDP-glukozy (10 mM), 4 μl NAD+ (10 mM), 4 μl MgCl2 (10 mM), 2 μl buforu Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) i 6 μl dejonizowanegoH2Ow nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Przeprowadzić test aktywności MgUXS przez inkubację 2 μl lizatu komórkowego z 2 μl kwasu UDP-glukuronowego (10 mM), 2 μl buforu Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) i 14 μl dejonizowanegoH2Ow nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Stłumić reakcje w krokach 7.5 i 7.6, dodając do każdej mieszaniny 20 μl metanolu i 40 μl chloroformu. Po wirowaniu mieszanin próbek należy odwirować przy 14 000 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i zebrać górną warstwę wodną każdej probówki.</li>
	<li>Analizować produkty reakcji za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w trybie jonizacji ujemnej w zakresie m/z od 500-700. Zmieszać 1 μl mieszaniny próbek z 1 μl matrycy próbki kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (1% m/v w 50% wodnym roztworze acetonitrylu). Obserwuj oczekiwane wartości m/z na poziomie 579 i 535 odpowiednio dla kwasu glukuronowego UDP i UDP-ksylozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+a+DNA+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+identification+of+dried+shellfish+%28oyster%2C+clam+and+mussel%29+products+sold+on+the+Chinese+market%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay%2C+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li>
<li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica%2C+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid%2C+reflects+their+reproductive+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li>
<li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+%28Haemosporidia%29+from+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li>
<li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li>
<li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+systematics+of+armadillos+%28Xenarthra%2C+Dasypodidae%29%3A+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li>
<li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li>
<li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
<li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-glucose+4-epimerase+and+%CE%B2-1%2C4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600(2018).</li>
<li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół pozwala na identyfikację genetyczną niereferencyjnych okazów ostryg o podobnym fenotypie pochodzących z regionalnych targów owoców morza poprzez porównanie genów COX1 i ND z publicznie dostępną bazą danych genomu DNA ostryg. Znaczenie tej metody polega na jej prostocie, ponieważ do oceny wirtualnej biblioteki cDNA potrzebna jest tylko jedna reakcja PCR. Dwa konserwatywne mitochondrialne geny COX1 i ND amplifikowano z biblioteki cDNA, która została wygenerowana przez odwrotną transkrypcję ekstraktów...

Pozyskanie żywego materiału biologicznego może być wyzwaniem ze względu na długie terminy dostaw, przedsiębiorcze uzasadnienie lub przepisy celne specyficzne dla danego kraju. Alternatywnie, wymagany materiał biologiczny może być również pobrany z fenotypowo identycznych próbek. Próbki te mogą się jednak znacznie różnić na poziomie genotypu, w związku z czym porównania z przechowywanymi cyfrowo genomami referencyjnymi tego samego gatunku są często trudne lub nawet daremne ze względu na niezgodność nowo pozyskanego materiału z istniejącymi metodami amplifikacji DNA. Sekwencjonowanie wysoce konserwatywnych genów poszczególnych próbek jest szeroko stosowanym i potężnym narzędziem do identyfikacji gatunków1, takich jak konserwatywne geny mitochondrialne, które są często używane jako geny referencyjne do oceny jakości bibliotek cDNA2,3,4,5,6. Podstawowym uzasadnieniem przedstawionej metody jest to, że wysoka zachowalność sekwencji genów mitochondrialnych w pojedynczych anonimowych próbkach ostryg w porównaniu z odpowiadającymi im sekwencjami genomu referencyjnego wskazuje, że inne geny mogą również wykazywać niski poziom rozbieżności, biorąc pod uwagę ogólnie szybsze tempo ewolucji mitochondrialnego DNA w stosunku do DNA jądrowego7, co pozwala na amplifikację i izolację szerokiego zakresu genów istotnych z naukowego i przemysłowego punktu widzenia poprzez proste wykorzystanie publicznie dostępnych danych sekwencjonowania jako punktu odniesienia.
Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest przedstawienie zoptymalizowanego przepływu pracy do generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA ostryg, która może być użyta jako matryca DNA do klonowania genów ostryg. W sekwencjonowaniu wirtualnym sekwencjonowanie genomu de novo jest obchodzone; zamiast tego znana, przechowywana cyfrowo sekwencja referencyjna jest wykorzystywana bezpośrednio do wykorzystania lub zaprojektowania starterów do produkcji cDNA, które ostatecznie będą stanowić bibliotekę (lub zostaną dodane do wcześniej istniejącej). Celem jest stworzenie konwergentnej biblioteki cDNA, co oznacza, że podobieństwa między wygenerowanymi sekwencjami cDNA a sekwencją referencyjną można uszeregować od niskiej do wysokiej rozbieżności. Kluczową zaletą stosowania podjednostki 1 oksydazy cytochromu C (COX1) i dehydrogenazy NADH (ND) jako genów referencyjnych jest to, że nawet wysoce rozłączne geograficznie próbki ostryg mogą być profilowane ze względu na wysoką konserwację tych genów mitochondrialnych. Po sprawdzeniu podejścia za pomocą tych dobrze znanych markerów, demonstrujemy jego zastosowanie do dwóch kandydatów na enzymy, które biorą udział w biosyntezie nukleotydów cukrowych i mogą mieć znaczenie przemysłowe8,9,10. Potencjał biotechnologiczny ostryg pacyficznych jest wciąż niezbadany. Dlatego uważamy, że ta zbieżna metoda przygotowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA będzie również odpowiednia dla niewyspecjalizowanych badaczy, którzy chcą wygenerować cDNA z tego odpowiedniego materiału biologicznego.

<table><tbody><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory:</td></tr><tr><td>kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>490-79-9</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr>: <tr><td>acetonitryl</td><td>Merck</td><td>75-05-8</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory:</td></tr><tr><td>Agaroza dla biologia molekularna</td><td>Biowest Chemicals</td><td>111860</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Lingfeng, Szanghaj</td><td>67-66-3</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>DEPC woda Thermo</td><td>Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Jinhuada, Kanton</td><td>64-17-5</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory:</td></tr><tr><td>odczynnik tiocyjanianowo-fenolowy Guanidinium</td><td>Odczynnik Invitrogen</td><td>15596018</td><td>TRIzol</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Energy Chemical</td><td>288-32-4</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Nanjing Odczynnik chemiczny</td><td>67-63-0</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;- D-tiogalaktopiranozyd</td><td>Solarbio</td><td>367-93-1</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Solarbio</td><td>25389-94-0</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>10855021</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Jinhuada, Kanton</td><td>67-56-1</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrate</td><td>Xilong Huagong</td><td>7791-18-6</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xilong Huagong</td><td>7647-14-5</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Due Biotech</td><td>53-84-9</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Fluorek fenylo-metylosulfonylu</td><td>Macklin</td><td>329-98-6</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>UDP-glucose</td><td>Wuhu Nuowei Chemicals</td><td>28053-08-9</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Kwas glukuronowy UDP</td><td>SIGMA</td><td>63700-19-6</td><td>*Możliwe</td></tr> <tr><td>alternatywne dystrybutoryNarzędzia/Przyrządy:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>spektrometr masowy MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Grzejnik z metalowym blokiem</td><td>Long Yang Scientific Instruments</td><td>Wytrząsarka termiczna HB20</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>Termocykler PCR</td><td>Hema</td><td>9600</td><td>*Możliwe</td></tr> <tr><td>alternatywne dystrybutory< silny> enzym i zestawy: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 razy; Bufor do podwiązywania</td><td>Thermo Scientific</td><td>B69</td><td>*Alternatywne dystrybutory możliwe</td></tr><tr><td>5 i razy; Bufor PrimeSTAR</td><td>Takara</td><td>9158A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>ThermoFisher FastAP</td><td>EF0654</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory:</td></tr><tr><td>COX forward primer</td><td>Genscript</td><td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td><td></td></tr><tr><td>COX reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTTGACCAAAAAACATAAGACATG</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>*Alternatywny możliwe dystrybutory</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD forward primer</td><td>Genscript</td><td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGACTCTGTGAGGGGGTGGAG</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS forward primer</td><td>Genscript</td><td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAACACC</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td><td></td></tr><tr><td>ND forward primer</td><td>Genscript</td><td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td><td></td></tr><tr><td>ND reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cleanup Kit</td><td>AxyGen</td><td>AP-PCR-250</td><td>*Możliwe alternatywne dystrybutory</td></tr><tr><td>pET-30a(+) vector</td><td>Merck Millipore</td><td>69909</td><td></td></tr></tbody></table>

zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cdna z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Dostęp do materiału biologicznego gatunków referencyjnych, które były wcześniej wykorzystywane w kluczowych eksperymentach, takich jak rozwój nowych linii komórkowych lub projekty sekwencjonowania genomu, są często trudne do zapewnienia dla dalszych badań lub stron trzecich ze względu na konsumpcyjny charakter próbek. Chociaż obecnie są szeroko rozpowszechnione na wybrzeżach Pacyfiku w Azji, Australii i Ameryce Północnej, poszczególne okazy ostryg pacyficznych są genetycznie dość zróżnicowane i dlatego nie nadają się bezpośrednio jako materiał wyjściowy dla bibliotek genów. W tym artykule demonstrujemy wykorzystanie niereferencyjnych próbek ostryg pacyficznych uzyskanych z regionalnych rynków owoców morza do generowania bibliotek cDNA. Biblioteki te zostały następnie porównane z publicznie dostępnym genomem ostryg, a najbliższa powiązana biblioteka została wybrana przy użyciu mitochondrialnych genów referencyjnych podjednostki I oksydazy cytochromu C (COX1) i dehydrogenazy NADH (ND). Przydatność wygenerowanej biblioteki cDNA wykazano również poprzez klonowanie i ekspresję dwóch genów kodujących enzymy dehydrogenazę kwasu glukuronowego UDP (UGD) i syntazę UDP-ksylozy (UXS), które są odpowiedzialne za biosyntezę UDP-ksylozy z UDP-glukozy.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd opisanego sposobu przygotowania konwergentnej biblioteki cDNA pochodzącej od osobników ostrygi pacyficznej. Rysunek 2 przedstawia sekwencje genów COX1 i ND od odlegle spokrewnionego okazu ostrygi o wysokim stopniu dywergencji w stosunku do sekwencji genów COX1 i ND materiału referencyjnego. Rysunek 3 przedstawia sekwencje genów COX1 i ND od blisko spokrewnionego okazu ostrygi o niskim stop...

Opisujemy strategię, jak używać próbek RNA z niepotwierdzonych próbek ostryg pacyficznych i oceniamy materiał genetyczny przez porównanie z publicznie dostępnymi danymi genomu w celu wygenerowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA.

Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Kluczowym pytaniem, na które chcemy odpowiedzieć za pomocą tej metody, jest to, w jaki sposób możemy wykorzystać próbki RNA z materiału zakupionego na lokalnych targach spożywczych do klonowania genów istotnych z biotechnologicznego punktu widzenia? W tym przypadku używamy ostryg pacyficznych jako studium przypadku, aby zademonstrować to podejście i potencjalne dalsze zastosowanie. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obejść konwencjonalne sekwencjonowanie genomu lub cDNA próbek ostryg.Zamiast tego sekwencje podjednostki I oksydazy cytochromu c i dehydrogenazy NADH porównano z publicznie dostępnymi sekwencjami referencyjnymi z ostrygi pacyficznej, aby wybrać najbliżej spokrewnioną próbkę. CDNA przygotowane z tego próbki może być bezpośrednio wykorzystane do klonowania genów istotnych z biotechnologicznego punktu widzenia, które mogą być wybrane na podstawie publicznie dostępnych informacji o sekwencji. Procedurę zademonstrują Yongmei Lyu i Yuquan Li, dwaj doktoranci z Centrum Badawczego Bioinżynierii Glikomiksów i Glikanów na Uniwersytecie Rolniczym w Nankinie.Aby przygotować próbkę tkanki ostrygi, użyj wysterylizowanego skalpela, aby wyciąć około 100 miligramów jednorodnej tkanki miękkiej z przybliżonego środka geometrycznego każdej próbki ostrygi. Przenieść próbkę do moździerza wypełnionego 50 mililitrami ciekłego azotu. Zmiel zamrożoną tkankę ostrygi na drobny proszek.Odważyć 75 miligramów zamrożonej tkanki każdej próbki do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i wymieszać z jednym mililitrem odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu guanidyny. Najważniejszym etapem tej procedury jest etap ekstrakcji RNA. Aby zminimalizować degradację RNA, konieczne jest skrócenie czasu między pobraniem tkanki ostrygi a ekstrakcją RNA.Odwirować próbkę w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i dokładnie wymieszaj w mikserze wirowym przez 10 do 15 sekund, aż mieszanina zmieni kolor na mlecznobiały. Następnie wirować przez 15 minut, tak jak poprzednio.Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie przenieś górną warstwę wodną, nie naruszając interfazy, do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodać 500 mikrolitrów alkoholu izopropylowego do probówki wirówkowej i delikatnie odwrócić, aby wymieszać próbki. Następnie pozostaw próbki na lodzie na 20 minut.Wirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez osiem minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze 75% etanolu i odwirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć cały sklarowany osad i powtórzyć mycie w etanolu.Suszyć granulki przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść wysuszoną osadkę RNA w 25 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC i trzymaj probówkę na lodzie. Próbki RNA należy zużyć w ciągu 24 godzin.Aby wygenerować bibliotekę cDNA, najpierw przygotuj mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki RNA w 300-mikrolitrowej probówce do PCR, dodając roztwory zgodnie z manuskryptem. Dodaj jeden mikrolitr wyekstrahowanej próbki RNA do probówki. Inkubować mieszaninę w termocyklerze PCR przez 60 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie zwiększać temperaturę do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Utworzoną bibliotekę cDNA przechowuj przez okres do 12 miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Najpierw dodaj jeden mikrolitr wygenerowanej biblioteki cDNA do probówek zawierających mieszaniny PCR, przygotowane zgodnie z manuskryptem. Umieść probówki PCR w termocyklerze PCR i wykonaj amplifikację PCR z początkowym etapem denaturacji i 35 cyklami reakcji PCR składającymi się z etapu wyżarzania, etapu wydłużania i etapu denaturacji zgodnie z manuskryptem.Po cyklach wykonaj jeden końcowy etap wydłużania przez pięć minut. Użyj pięciu mikrolitrów produktu PCR, aby zweryfikować jakość za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Obserwuj amplifikowany gen COX1 lub ND jako pojedyncze prążek odpowiednio w 759 lub 748 parach zasad.Aby oczyścić pozostałą część produktu PCR, do każdej próbki dodaj 100 mikrolitrów buforu wiążącego DNA zawierającego wysokie stężenia soli chaotropowych. Krótko zmieszaj, aby wymieszać zawartość. Umieść kolumnę oczyszczającą w dwumililitrowej probówce wirówkowej.Odpipetować mieszaninę reakcyjną do kolumny. Umieścić probówkę z zamontowaną kolumną w wirówce na 14 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu filtratu z dwumililitrowej probówki wirówkowej, przemyć dwukrotnie 700 i 400 mikrolitrami roztworu myjącego W2 przez odwirowanie z stężeniem 14 000 g.Następnie podgrzej jeden mililitr wody dejonizowanej do 65 stopni Celsjusza w metalowym grzejniku. Przenieś kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i odpipetuj 25 mikrolitrów podgrzanej wody dejonizowanej do środka białej membrany kolumny. Pozwól membranie moczyć się przez minutę w temperaturze pokojowej.Następnie odwirować probówkę z kolumną o ciśnieniu 14 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić kolumnę i przechowywać oczyszczony produkt PCR przez okres do 12 miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Opcjonalnie startery odwrotne COX1 lub ND mogą być również używane do sekwencjonowania dwukierunkowego.Do sekwencjonowania Sangera należy użyć odpowiedniego startera COX1 lub ND do przodu. Po pobraniu wyników sekwencjonowania porównaj sekwencje z sekwencją genomu referencyjnego szczepu ostryg pacyficznych za pomocą narzędzia online NCBI Nucleotide BLAST. Użyj odpowiednich starterów do przodu i do tyłu genów MgUGD i MgUXS, aby amplifikować i oczyszczać za pomocą PCR, tak jak to miało miejsce wcześniej.Po inkubacji oczyszczonych produktów PCR z buforem wytrawiającym, przygotuj wstępnie strawiony wektor pET-30a, rozpuszczając 500 nanogramów pET-30a w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj wodę dejonizowaną, aby uzupełnić do 16 mikrolitrów. Następnie dodaj do probówki dwa mikrolitry 10-krotnie skoncentrowanego buforu wytrawiającego i po jednym mikrolitrze każdej z 20 jednostek endonukleaz restrykcyjnych Nde1 i Xho1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Następnie dodaj jeden mikrolitr jednostkę fosfatazy alkalicznej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkową godzinę. Następnie umieść probówkę w nagrzanym metalowym grzejniku blokowym w temperaturze 75 stopni Celsjusza na 10 minut, aby dezaktywować fosfatazę alkaliczną. Po wyhodowaniu komórek E. coli BL21 zawierających geny MgUGD i MgUXS, przenieś kulturę do 400-mililitrowej pożywki LB w dwulitrowej kolbie do wytrząsania i umieść ją na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po trzech godzinach sprawdź gęstość optyczną na fotometrze o długości fali 600 nanometrów i upewnij się, że osiąga absorpcję około 0,5. Następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki do 20 stopni Celsjusza. Dodaj 400 mikrolitrów jednomolowego IPTG, aby indukować ekspresję rekombinowanych białek przez trzy godziny.Po pobraniu komórek należy rozbić komórki za pomocą sonikacji przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 14 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, a następnie zebrać supernatant w nowej probówce do testu aktywności. Po oznaczeniu aktywności wygasić reakcje, dodając 20 mikrolitrów metanolu i 40 mikrolitrów chloroformu do mieszanin MgUXS i MgUGD.Mieszaniny próbek należy zawirować i odwirować pod ciśnieniem 14 000 g przez sześć minut i cztery stopnie Celsjusza. Zebrać górną warstwę wodną każdej probówki w nowych probówkach do spektrometrii mas MALDI-TOF. W tym eksperymencie porównano zgodność sekwencji genów COX1 i ND wysoce rozbieżnego okazu z referencyjnym szczepem ostryg pacyficznych.Czerwone strzałki pokazują różnice nukleotydowe między sekwencją referencyjną a sekwencją uzyskanych próbek cDNA. Sekwencje genów COX1 i ND blisko spokrewnionego okazu ostrygi wykazują niewielką rozbieżność z referencyjnym szczepem ostryg pacyficznych. Spektrometria mas MALDI-TOF pokazuje udane zastosowanie biblioteki cDNA do klonowania genów MgUGD i MgUXS o znaczeniu przemysłowym.Obraz żelu identyfikuje również kwas UDP-glukuronowy i UDP-ksylozę powstające w wyniku enzymatycznego działania kolejno eksprymowanych i oczyszczanych MgUGD i MgUXS. Metoda ta nie wymaga idealnego dopasowania między sekwencją referencyjną a uzyskanymi sekwencjami markerowymi i powinna dać badaczowi pewność pracy z ostrygami bez odniesień. Zasadniczo metoda ta może być stosowana do każdej próbki biologicznej nieposiadającej odniesień, dla której sekwencje blisko spokrewnionego gatunku referencyjnego są publicznie dostępne.Metoda ta umożliwia badaczom niebędącym ekspertami łatwy dostęp do materiału genetycznego o potencjalnym znaczeniu biologicznym i toruje drogę większej liczbie naukowców do pracy z łatwo dostępnymi, ale nie w pełni zidentyfikowanymi próbkami biologicznymi.

a-converging-strategy-for-generation-virtually-sequenced-cdna-library

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Poznaj metodę generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z ostryg pacyficznych z lokalnych rynków spożywczych. Technika ta umożliwia klonowanie genów biotechnologicznych bez konwencjonalnego sekwencjonowania.

Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

Przeglądaj więcej filmów