Name: Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metodę Stereo-seq do przestrzennego profilowania transkryptomów z tkanek FFPE w badaniach mikrośrodowiska nowotworowego jajnika. Technika umożliwia identyfikację biomarkerów predykcyjnych i terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były częściowo finansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Fundację Sie oraz Fundusz Endowment Stephanie C. Stelter. Badania te zostały przeprowadzone we współpracy z Facility Flow Cytometry and Cellular Imaging Core, Department of Veterinary Medicine & Surgery oraz Advanced Genomics Technology Core, które są częściowo wspierane przez National Institutes of Health poprzez grant Wsparcia Centrum Onkologii M. D. Andersona P30 CA016672 oraz Specjalistę ds. Badań NCI Jareda Burksa 1 R50 CA243707-01A1.
Chcielibyśmy również podziękować Compete Genomics, a konkretnie Brandonowi Vanderbushowi i Tanzeen Yusuff za szkolenie techniczne i rozwiązywanie problemów, a także Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong i Erin Petrilli. Autor(i) otrzymali zestaw odczynników FFPE OMNI i sekwencjonowania oraz dostęp do programu wczesnego dostępu T7 od Complete Genomics po obniżonej cenie. Dodatkowo, niektóre odczynniki zostały udostępnione bezpłatnie do wykorzystania w tym badaniu.

<ol><li>Ferri-Borgogno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((metabolic%2C+and+subcellular+mapping+of+the+tumor+immune+microenvironment+via+3D+targeted+and+non-targeted+multiplex+multi-omics+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses.</a> Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).</li>
<li>Lähnemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eleven+grand+challenges+in+single-cell+data+science%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Eleven grand challenges in single-cell data science.</a> Genome Biol. 21 (1), 31(2020).</li>
<li>Molla Desta, G., Birhanu, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics%3A+transforming+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research.</a> Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+approaches+and+challenges+in+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+technologies+and+related+computational+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis.</a> Front Genet. 10, 317(2019).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+RNA+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).</li>
<li>Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+bioinformatics+analysis+of+data+from+bulk+and+single-cell+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments.</a> Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).</li>
<li>Ma, Y., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+informed+cell-type+deconvolution+for+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics.</a> Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).</li>
<li>Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+deconvolution+at+single-cell+resolution+using+Redeconve%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve.</a> Nat Commun. 14 (1), 428(2023).</li>
<li>Wei, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+charting+of+single-cell+transcriptomes+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues.</a> Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).</li>
<li>Cheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics%3A+a+comprehensive+review+of+their+technological+advances%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges.</a> J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).</li>
<li>To, A., Yu, Z., Sugimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancement+in+the+spatial+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advancement in the spatial immuno-oncology.</a> Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).</li>
<li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+transcriptomic+atlas+of+mouse+organogenesis+using+DNA+nanoball-patterned+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays.</a> Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).</li>
<li>McKellar, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+the+total+transcriptome+by+in+situ+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation.</a> Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).</li>
<li>Kuemmerle, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+set+selection+for+targeted+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probe set selection for targeted spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+efficient+and+accurate+data+analysis+workflow+for+stereo-seq+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gigabyte%22%5BJournal%5D)">an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics.</a> Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).</li>
<li>Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+method+of+single-cell+spatial+transcriptomics+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing.</a> Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).</li>
<li>Patel, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+performance+of+commercial+RNA+and+DNA+extraction+kits+for+FFPE+tissue+cores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores.</a> PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo-seq+V2%3A+Spatial+mapping+of+total+RNA+on+FFPE+sections+with+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution.</a> Cell. , (2025).</li>
<li>Russell, A. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide-tags+enables+single-nucleus+barcoding+for+multimodal+spatial+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics.</a> Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).</li>
<li>Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+automated+and+reproducible+spatially+resolved+transcriptomics+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale.</a> Heliyon. 8 (6), e09651(2022).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vol.+Rev+A%22">Vol. Rev A</a>. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).</li>
<li>Su, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+multi-omics+sequencing+for+fixed+tissue+via+DBiT-seq%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).</li>
<li>Stickels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+spatial+transcriptomics+at+near-cellular+resolution+with+Slide-seqV2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2.</a> Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).</li>
<li>Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+storage+conditions+on+the+quality+of+nucleic+acids+in+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues.</a> PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).</li>
<li>Yi, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preservation+time+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+on+extractable+DNA+and+RNA+quantity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity.</a> J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).</li>
<li>Eccher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+laboratory+archives%3A+Conservation+quality+of+nucleic+acids+and+proteins+for+NSCLC+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing.</a> J Pers Med. 14 (4), 333(2024).</li>
<li>Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomic+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomic technologies.</a> Cells. 12 (16), 2042(2023).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Janesick, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mapping+of+the+tumor+microenvironment+using+integrated+single-cell%2C+spatial+and+in+situ+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis.</a> Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+sequencing-based+spatial+transcriptomic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods.</a> Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).</li>
<li>Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved%2C+highly+multiplexed+RNA+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.</a> Science. 348 (6233), aaa6090(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), eaat5691(2018).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że prace te nie były finansowane przez Complete Genomics. Jednak Complete Genomics pokrywa koszty publikacji tego artykułu. Nie otrzymali oni kopii wstępnej ani informacji o treści.

Protokół Stereo-seq jest bardzo szczegółowy i obejmuje kilka kluczowych kroków, które wymagają precyzji, wyczucia czasu i czystego środowiska, aby zapewnić sukces, zwłaszcza przy profilowaniu mikrobiomu lub nie-gospodarza, które mogą wymagać szczególnych środków ostrożności.
Wymagane jest użycie wody wolnej od nukleazy we wszystkich etapach, a chip przechwytujący nie może być dotykany niczym innym niż próbką i odczynnikami. Zachowaj szczególną ostrożność przy użyciu zespołu kasetowego, poświęc...

Technologie przestrzennej omiki zrewolucjonizowały badania heterogeniczności komórek tkanek, umożliwiając jednoczesną ilościową identyfikację wielu celów: DNA (genomika), RNA (transkryptomika), metabolitów (metabolomika) lub białek (proteomika)1. Rozdzielczość tych różnych testów często się różni, co daje różne ograniczenia przy pomiarze analitów, zarówno przy większej rzadkości przy pomiarze pojedynczej komórki 2,3, jak i natywnego kontekstuprzestrzennego 4. Natomiast metody masowe, takie jak sekwencjonowanie RNA, zapewniają jedynie średnią ekspresję genów w całych próbkach i zaciemniają heterogeniczność komórkową2, lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq)2,3, które wymaga dysocjacji tkanek do sekwencjonowania pojedynczych komórek, często wymaga filtrowania. Dlatego metody te wykluczają duże komórki i agregaty, podczas gdy metody bioinformatyczne próbują usuwać fragmenty i dublety, które wywołują błędy 5,6,7. Transkryptomika przestrzenna zachowuje architekturę tkanek, dostarczając kluczowych informacji na temat organizacji i interakcji komórkowych. Większość metod sekwencjonowania przestrzennego nieukierunkowanego nie posiada rozdzielczości pojedynczych komórek, co wymaga dekonwolucji obszarów przechwytywania przestrzennego zawierających od 10 do 100 komórek 8,9,10. Jednak w ostatniej dekadzie transkryptomika przestrzenna wyprzedziła potrzeby tych metod, ponieważ nastąpiły postępy w rozdzielczości, większych obszarach rejestracji oraz integracji podejść multiomicznych, zarówno przy użyciu strategii eksperymentalnej, jak i nowych technik 1,11,12.
Sekwencjonowanie omiksów o zwiększonej rozdzielczości przestrzennej (Stereo-seq) zapewnia rozdzielczość w skali nanoskali (500 nm) oraz obszar przechwytu w skali centymetra, a całkowite transkryptomie niezależne od gatunku umożliwia przechwytywanie kodowania, niekodującego i nie-gospodarza RNA13. Ta metoda ma obecnie najwyższą rozdzielczość dla transkryptomiki przestrzennej i oferuje opcje zapewniające największe pola widzenia. Jednak ta metoda ma pewne istotne ograniczenia, w tym wymagania czasowe i robocizne wynoszące około 15 godzin praktycznego czasu, obejmujące 4 dni na ukończenie bibliotek gotowych do sekwencjonowania. Dla porównania, inne technologie transkryptomiki przestrzennej oparte na sekwencjonowaniu, takie jak transkryptomika przestrzenna oparta na sondzie, transkryptomika przestrzenna oparta na tablicy wieloA-capture, Slide-seq oraz deterministyczne kodowanie kreskowe w tkankach dla sekwencjonowania przestrzennej omiki (DBiT-seq), zazwyczaj wymagają od 5 do 8 godzin praktycznego czasu przez 2 do 3 dni (Tabela 1). Dla wielu badaczy te postępy przewyższają wyzwania techniczne i są idealne do tworzenia pełnych atlasów transkryptomicznych przestrzennych do badania postępu choroby na poziomie komórkowym i subkomórkowym, szczególnie jeśli są połączone z innymi technologiami1.
Protokół Stereo-seq ma możliwości wykraczające poza tradycyjną transkryptomikę mRNA, która opiera się na sondach poli-T do wychwytywania polyadenylowanych transkrypcji mRNA. Metody te można modyfikować, dodając poliadenylację do świeżych tkanek14 lub sondy specyficzne dla gatunku dla docelowych zestawów genów15 do analizy ekspresji przestrzennej. Zamiast tego Stereo-seq wykorzystuje losowe sondy nukleotydowe do wyboru różnorodnych RNA niezależnie od gatunku, w tym RNA mikrobiologicznego, grzybowego, wirusowego oraz niepoliadenylowanego RNA, takiego jak enhancer RNA, okrągły RNA oraz długie niekodujące RNA (lncRNA)16. Teoretycznie możliwe jest wychwycenie mniejszych RNA lub elementów reparacyjnych, takich jak małe interferujące RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) oraz transpozony17. Obecnie jednak bioinformatyka i mapowanie tych RNA pozostają wyzwaniem i często są filtrowane podczas początkowego wyrównania, które zazwyczaj stosuje się 30 bp cutoff.
Przedstawiono szczegółowy protokół, z naszymi modyfikacjami dotyczącymi losowego wychwytywania nukleotydów na chipach DNA (DNB) przez producenta, aby zapewnić lepsze zrozumienie i obsługę protokołu Stereo-seq, przedstawionego na Rysunku 1. Protokół ten obejmuje strategie dla biologów molekularnych testujących nowe tkanki FFPE na Stereo-seq z losowym wychwytywaniem nukleotydów, aby uzyskać bardziej spójne, wyższe wyniki z niższej jakości zarchiwizowanych próbek i tkanek tłuszczowych. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem próbek FFPE z większości narządów, niezależnie od gatunku pochodzenia. Jednak protokół ten nie obejmuje obecnych modyfikacji potrzebnych do obsługi trudnych tkanek, takich jak szpik kostny, które wymagają odwapnienia.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL probówek do wirówek zwykłych DNA/RNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>3456</td><td>Do mieszania odczynników (inne pasma są w porządku) i nbsp;</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Stopień molekularny</td></tr><tr><td>15mL stożkowe rurki do wirówek sterylnych z polipropylenem</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>339650</td><td>Używane do aliquots&nbsp;</td></tr><tr><td>20x koncentratu&nbsp; Bufor soli sodu (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td>Używałem do produkcji 5X SSC do bejcowania i 1X SSC do kroków mycia i usuwania pokrywek.</td></tr><tr><td>Instrument bioanalizator 2100</td><td>Agilent</td><td>Dyskontowane</td><td>Instrument: Bioanalizator</td></tr><tr><td>Komora z 3 studniami, wyjmowana</td><td>Ibidi</td><td>80381</td><td>Komora silikonowa do redukcji objętości podczas rehydratacji i wiązania metanolu.</td></tr><tr><td>Źródło UV 405nm</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Do utwardzania żywicy UV</td></tr><tr><td>Stożkowe rurki do wirówek z polipropylenem o pojemności 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>339652</td><td>Używany do alikwotów i deparafinizacji&nbsp;</td></tr><tr><td>70% sterylny alkohol izopropanolowy</td><td>Texwipe&nbsp;</td><td>TX3270</td><td>Do dekontaminacji powierzchni &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Do charakterystyki cDNA i bibliotek przez bioanalizatory</td></tr><tr><td>Zestaw Pico Agilent RNA 6000</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Do charakterystyki RNA przez bioanalizatory</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Aby zakryć preparat podczas barwienia ssDNA.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter SPRIselect</td><td>Beckman Coulter Life Sciences&nbsp;</td><td>B23317/B23318/B23319</td><td>SPRI Beads cDNA i czyszczenie biblioteki</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Stanowisko sprzątające usuwa zanieczyszczenia mikrobiomu</td></tr><tr><td>Uszczelnione wymazy piankowe CONSTIX</td><td>Contec</td><td>19161023</td><td>Dla precyzyjnego czyszczenia żywicy</td></tr><tr><td>Slip pokrywkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR470045-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Pakiety osuszające</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Pakiety osuszające bez RNazy, wolne od kurzu.</td></tr><tr><td>Jednorazowa maseczka na twarz</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>12-888-001</td><td>Ochrona, zanieczyszczenie RNAe i inne sterylność & nbsp;</td></tr><tr><td>Chusteczki do wymazywania DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9060-250EA</td><td>Dekontaminacja przez wycieranie powierzchni (mokre chusteczki)</td></tr><tr><td>Rurki LoBind DNA 1,5mL</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22431021</td><td>Wykorzystywane do zbierania cDNA i postamplifikacji bibliotecznych.</td></tr><tr><td>Rurki DNA LoBind 2mL</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22431048</td><td>Wykorzystywany do zbierania cDNA przed amplifikacją.</td></tr><tr><td>DNBSEQ OneStep DNB Zestaw Do Produkcji Środków</td><td>Genomika kompletna</td><td>940-001891-00</td><td>Odczynniki do przygotowania i amplifikacji DNA nanoball (DNB)</td></tr><tr><td>Zestaw do odczynnika czyszczącego DNBSEQ-T7RS</td><td>Genomika kompletna</td><td>940-001903-00</td><td>Wkład do prania po zakończeniu sekwencjonowania</td></tr><tr><td>DNBSEQ-T7RS zestaw odczynników do ładowania DNB</td><td>Genomika kompletna</td><td>940-001894-00</td><td>Odczynniki i płytka do załadunku DNB do komórki przepływowej</td></tr><tr><td>Komórka sekwencjonowania DNBSEQ-T7RS</td><td>Genomika kompletna</td><td>940-001902-00</td><td>1 komórka liniowa/przepływowa</td></tr><tr><td>DNBSEQ-T7RS zestaw do wizualizacji odczynników stereo-seq</td><td>Genomika kompletna</td><td>940-001893-00</td><td>Wkład i odczynniki do sekwencjonowania.</td></tr><tr><td>System DNBSEQ-T7RS</td><td>Genomika kompletna</td><td></td><td>Ten zestaw wizualizacji stereo-seq wykorzystuje technologię DNBSEQ. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od hybrydyzacji kotwicy DNA, następnie fluorescencyjną sondę przyłącza się do DNA Nanoball (DNB) za pomocą chemii kombinatorycznego sekwencjonowania sondy i kotwicy (cPAS). Wreszcie, system obrazowania o wysokiej rozdzielczości rejestruje sygnał fluorescencjonalny. Po cyfrowym przetworzeniu sygnału optycznego sekwencer generuje wysokiej jakości i dokładne informacje sekwencyjne.</td></tr><tr><td>Sprężone powietrze z odkurzaniem</td><td>Matin</td><td>M-6318</td><td>Ważne jest, aby używać tej marki lub takiej o podobnym paliwie.</td></tr><tr><td>Mikrotomowe łopatki Edge-Rite</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>4280L</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Zamrażarka odporna na wybuchy</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Aby schłodzić metanol przed i w trakcie etapu utrwalania metanolu.</td></tr><tr><td>Pędzle histologiczne</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2104-50ML</td><td>Do rozcieńczania enzymu premuliablizacyjnego w 0,01 N HCl (pH 2). Standardowe stężenie zapasowe w roztworze HCl wynosi 0,1 N. </td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>różne</td><td>Nie ma</td><td>GC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution</td></tr><tr><td>Invitrogen RNaseZap Roztwór Dekontaminacji RNazy</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Stanowisko robocze czyszczące usuwające zanieczyszczenia RNAe</td></tr><tr><td>Kimtech Delicate Task Furs&nbsp;</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Do suszenia stołów, sprzętu, pipet itd.</td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Środki ochrony osobistej (PPE)</td></tr><tr><td>Papier soczewkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>11-997</td><td>Różne rozwiązania do suszenia szkieł bez wycierania</td></tr><tr><td>Chusteczki DNA Purse Lookout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9060</td><td>Stanowisko sprzątające usuwające zanieczyszczenia PCR</td></tr><tr><td>Szafka separacyjna magentic 5uL - 0,2&nbsp;</td><td>Permagen Labware</td><td>MSRLV08</td><td>Do seperzji kulek w rurkach PCR</td></tr><tr><td>Stelaża magjet 12x1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>MR02</td><td>Do sekwacji kulek w probówkach 1,5 mL</td></tr><tr><td>Manualny mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Methonal &ge; 99,9%, odpowiednie do immunofluorescencji, HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Do fiksacji (musi być klasy HPLC)</td></tr><tr><td>Kleszcze mikro-rozcinające</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Woda o jakości molekularnej z wolną nukleazą, bez DPEC</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Rozcieńczenia i wydzielanie paciorków</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Żeby upiec chipsy</td></tr><tr><td>Rurki PCR 0,2 mL z dołączonymi kapslami</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Do zastosowań PCR</td></tr><tr><td>Pokrycia PCR & nbsp;</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Wymiana, jeśli klej na dostarczonej okładce jest słaby</td></tr><tr><td>Maska PCR i okap Stacja robocza</td><td>Mystaire</td><td>MY-PCR24-010</td><td>Dla etapów pre-PCR (RNA do cDNA)</td></tr><tr><td>Miernik pH</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Miernik pH do potwierdzenia pH HCl.</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A005-C</td><td>Opcjonalnie zwiększa przyczepność tkanek do odprysku</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Insuterment; Pomiar ilości DNA</td></tr><tr><td>Zestawy do kwantyfikacji qubitu dsDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Do pomiaru kwantyfikacji cDNA i bibliotek</td></tr><tr><td>Qubit ssDNA Test Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>Q10212</td><td>Barwienie ssDNA (Używany tylko barwnik)</td></tr><tr><td>Blok lodowy wolny od RNAs</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Histologia – Stosowana podczas krojowania próbek w celu nawodnienia bloków przed sekcją</td></tr><tr><td>Roztwór RNazy RNaze RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>AM9782</td><td>Roztwór dekontaminacji powierzchniowej, który niszczy RNA</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy FFPE</td><td>Qiagen</td><td>73504 & 19093</td><td>Do ekstrakcji RNA i Pomiar DV200&nbsp;</td></tr><tr><td>Sculpt Ultra White Resin</td><td>Siraya Tech</td><td>Nie ma</td><td>Odporna na wysoką temperaturę żywica utwardzalna UV</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki kodów kreskowych stereo-seq 16</td><td>STOmics / Kompletna genomika</td><td>111KL160</td><td>Do budowy biblioteki Stereo-seq OMNI FFPE</td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów stereo-seq FFPE</td><td>STOmics / Kompletna genomika</td><td>310AK002</td><td>Elementy akcesoriów OMNI przestrzennych zestawu 211SN114</td></tr><tr><td>Suwak stereo-seq N-chip (1cm x 1cm)</td><td>STOmics / Kompletna genomika</td><td>210CN114</td><td>Część układu OMNI przestrzennego zestawu 211SN114</td></tr><tr><td>Stereo-seq adapter PCR & nbsp;</td><td>STOmics / Kompletna genomika</td><td>301AUX001</td><td>Dla kroków hybrydyzacji PCR zmodyfikowane tak, aby pasowały do trzech podobnych do adaptera hybrydyzacji PCRmax Situ</td></tr><tr><td>Stereo-seq Transcriptomics N Kit</td><td>STOmics / Kompletna genomika</td><td>211KN114</td><td>Przestrzenny OMNI regent część zestawu 211SN114</td></tr><tr><td>Projektowanie chirurgiczne ogólnego przeznaczenia Przemysłowa żyletka</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>13-812-236</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy TE pH 8,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8890</td><td>Do elucii cDNA i bibliotek</td></tr><tr><td>Cyklery termiczne</td><td>BioRad / różne</td><td>1861096 /12015392 / różne</td><td>Maszyna PCR z ręczną pokrywką lub opcjami głębokiej studni (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler itd.)</td></tr><tr><td>Zestawy bufora pH Thermo Scientific Orion All-in-One</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>13-624-500</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel do wypływania tkanek - Digital XH-1003</td><td>Premiera</td><td>NC0779538</td><td>Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek</td></tr><tr><td>Okulary ochronne przed UV</td><td>Różne</td><td>Nie ma</td><td>Dla bezpieczeństwa podczas utwardzania UV</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247642</td><td>Dla deparafinizacji</td></tr></tbody></table>

kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Comprehensive Spatial Profiling of Species-agnostic Transcriptomes via Stereo-seq

Przestrzenny skład komórek wewnątrz gospodarza, a także bakterie lub ładunki wirusowe w tkance, mogą wpływać na interakcje typów komórek i analitów, które napędzają komórkę przez procesy specyficzne dla typu. Stereo-seq dla tkanek FFPE wykorzystuje losowe primowanie kodów przestrzennych, co różni się od standardowych metod transkryptomiki przestrzennej, które wykorzystują A'tailing do przechwytywania mRNA posłannika (mRNA) lub opartego na sondach do przechwytywania transkryptów specyficznych dla gatunku. Metody te nie uwzględniają nowszej wiedzy o wpływie i znaczeniu innych typów RNA pochodzących z długiego niekodującego RNA, mitochondrialnego, mikroRNA lub innych gatunków RNA, takich jak mikroby, wirusowe i grzybowe. Poniżej przedstawiono krok po kroku procedurę od przecięcia tkanek aż po przygotowanie biblioteki do zastosowań stereo-seq niezależnych od gatunków przestrzennych z detekcją RNA, wykorzystującą metodologię sondy randomer, która jest kompatybilna z tkankami formalinowo osadzonymi w parafinie (FFPE). Ta metoda stereo-seq wykorzystuje losowy kulkę przechwytu o rozmiarze 0,22 μm, która pojawia się w tablicy co 0,5 μm, co pozwala na rozdzielczość subkomórkową dzięki technologii opartej na sekwencjonowania. Ponieważ metoda ta wykrywa zarówno RNA gospodarza, jak i nie-gospodarza, protokół wymaga specyficznych kwestii, aby określić, co znajduje się wewnątrz tkanki, a co zostało zdeponowane podczas pobierania, konserwacji, cięcia i wykrywania (czyli środowiskowe i obsługa zanieczyszczeń). Na koniec, protokół ten pozwala uzyskać wysoką (pojedynczą) rozdzielczość gatunków wielokomórkowych w kontekście przestrzennym, dostarczając wglądu w dokładność i inter-aaktom typów komórek oraz gatunków patologicznych.

Poniższe dane pokazują zdolność do segmentacji pojedynczych komórek za pomocą pipeline'u SAW oraz mapowania na niepolialno-adenylowane RNA, takie jak tRNA (TRDMT1), z sekcji FFPE. Obiektywne dane ze Stereo-seq pozwalają zbadać znaczenie nie tylko mRNA, ale także tRNA, rRNA oraz RNA niebędących gospodarzem (jeśli są istotne). Korzystając z bezpośredniego wyjścia z pipelineSAW 16 oraz stereopii do oceny jakości wyjścia stereo-seq na Rysunku 3A-G<...

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

The spatial composition of cells within the host, as well as the bacteria or viral loads within the tissue, can impact the interaction of cell types and ...

Nasze badania koncentrują się na szczegółowej charakteryzacji mikrośrodowiska guza jajnika w celu identyfikacji predykcyjnych i terapeutycznych biomarkerów. Na przykład chcielibyśmy znaleźć markery przewidujące reakcję na chemię i oporność na chemię lub nowe cele terapeutyczne dla leczenia drugiego biegu. Wyzwania eksperymentalne obejmują obsługę próbki, ocenę jakości próbki oraz długość czasu jej przetwarzania.Natomiast po stronie analizy danych wyzwania obejmują takie rzeczy jak rzadkość danych, podobnie jak w innych procesach pojedynczych komórek, a także mapowanie obszarów, zwłaszcza powtarzalnych. Po wyjęciu stereo-sekwencjonującego N-Chip z opakowania, zapisz numer identyfikacyjny chipa. Nie dotykając powierzchni N-Chip, wyczyść szkło 100% etanolem.Za pomocą mikropipety ostrożnie nałóż 10 mikrolitrów ultrafioletowej żywicy ceramicznej utwardzalnej wokół krawędzi stereo-sekwencjonującego N-Chip. Użyj szczelnie zamkniętego wymazywacza, aby usunąć nadmiar żywicy, zostawiając tylko cienką linię wokół krawędzi odprysku. Umieść szkiełko w urządzeniu do utwardzania ultrafioletowego, upewniając się, że powierzchnia układu nie jest dotykana.Następnie umieść nałożony na żywicę odprysk na nieprzezroczystą maskę na 405-nanometrowym świetle ultrafioletowym, aby oświetlić tył szkiełka i utwardzaj się przez pięć minut. Po utwardzeniu użyj szczelnie zamkniętych wymazów piankowych namoczonych w etanolu 100% molekularnym, następnie w 70% etanolu, a na końcu w wodzie bez nukleazy do czyszczenia wokół krawędzi nałożonej żywicą. Zanurz chip trzy razy w świeżej, beznukleazowej wodzie za pomocą stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Używając sprężonego powietrza, wysusz chip z pełną siłą powietrza pod kątem około 60 do 80 stopni, poruszając się po ukośnej powierzchni z odległości około pięciu centymetrów. Następnie nałóż równomiernie 150 mikrolitrów roztworu Poly-L-Lysine na całą powierzchnię chipu i inkubuj chip przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór poli-L-lizyny z chipa.Po drugim myciu ostrożnie wysusz krawędzie szkiełka, nie dotykając powierzchni wyprysku. Solidnie wysusz chip za pomocą sprężonego powietrza, jak pokazano wcześniej. Podczas sekcji tkanki FFPE nie dotykaj bezpośrednio chipu i pokrywaj tylko 80% powierzchni tkanki.Aby przygotować dwa mikrolitry jednoniciowego roztworu barwienia DNA w buforze SSC, rozcieńcz jednoniciowy odczynnik DNA kubitu buforem 5X SSC. Stwórz główną mieszankę roztworu barwiącego za pomocą rozcieńczenia inhibitora rybonukleazy o stężeniu 1 do 20, rozcieńczenia roztworu jednoniciowego DNA o stężeniu 1 do 200 oraz pozostałej objętości z buforem 5X SSC. Dodaj 150 mikrolitrów roztworu barwiącego do każdego odłamku i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie delikatnie usuwaj roztwór barwiący z rogu każdego odprysku pipetą. Po dwukrotnym umyciu chipu buforem SSC 0.1X przez 10 do 15 sekund, ostrożnie wysusz krawędzie zamka. Dodaj około trzech do pięciu mikrolitrów glicerolu na szkiełko, aby go zamontować.Zrzuć pokrywkę z około jednego centymetra nad prowadnią, utrzymując ją na poziomie i upewniając się, że nie dotyka powierzchni wyprysku. Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne tkanek zabarwionych DNA na jednej nici za pomocą mikroskopu szerokopolnego, zapewniając 10% nakładania się kafelków obrazowych. Zszyj uzyskane obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, takim jak ImageJ, najpierw wykorzystując teoretyczne nakładanie się do wygenerowania przybliżonych pozycji kafelków, a następnie stosując nakładanie pikseli obliczeniowe, aby precyzyjnie dopracować kafelki.Przetworz zszyte obrazy w oprogramowaniu StereoMap i poupewnij się, że kontrola jakości obrazu jest zaliczona, zanim kontynuuuję. Zanurz szkieł sekwencjonujący stereo w 30 mililitrach bufora SSC 0,1X, aż slip się odłączy. Upewnij się, że odczynnik do odłączania FFPE jest w temperaturze pokojowej i sprawdź go pod kątem cząstek.Włącz termocykler i ustaw go na 30 stopni Celsjusza dla równowagi, 95 stopni Celsjusza na 30-minutową inkubację oraz nieskończone utrzymanie na czterech stopniach Celsjusza. Złóż uszczelkę kasety i włóż suwak chipu stereo do kasety. Następnie dodaj odczynnik FFPE do odłączania do kasety stereo-sekwencyjnej, przyklej taśmę uszczelniającą kasetę i potwierdzi, że jest szczelnie zamknięta.Rozpocznij 30-minutową inkubację w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Po 10 minutach umieść 25 mililitrów metanolu w pojemniku o pojemności 50 mililitrów w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza, przygotowując około jednego mililitra na każde szkiełko do późniejszego użycia. Po wyjęciu chipu z termocyklera przenieś kasetę zamkową na stoł i zdejmij taśmę uszczelniającą.Za pomocą pipety usuń i wyrzuć odczynnik FFPE do odłączania z kasety. Gdy odczynnik zostanie całkowicie usunięty, odłącz kasetę i uszczelkę i wyrzuć je. Pod sterylnym kapturem wysusz krawędź zamka i w razie potrzeby nałóż nową komorę silikonową.Dodaj 500 mikrolitrów schłodzonego metanolu z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza, zapewniając, że cały odcinek jest zanurzony. Roztwór PR na suchym bloku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przed użyciem. Po utrwaleniu, w okapie spalinowym, zetrzyj nadmiar metanolu z preparatu i poczekaj, aż reszta metanolu na chipie wyparuje.Złóż nową uszczelkę na końcu kasety. Po zakończeniu parowania umieść suwak układu stereo sekwencjonującego do kasety. Dodaj do chipu 200 mikrolitrów podgrzanego odczynnika permeablizacyjnego.Przyklej taśmę uszczelniającą kasetę do sekwencjonowania stereo i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta. Wykonaj transkrypcję odwrotną, a następnie uwolnienie i oczyszczenie CDNA zgodnie z instrukcjami przedstawionymi tutaj. Podgrzej wodę wolną od nukleazy do 37 stopni Celsjusza.Usuń uszczelkę z odprysku. Pipety energicznie przesuwaj każdy róg i środek odprysku na chusteczkę, nie drapiąc ani nie dotykając jej. Zbierz całą komplementarną mieszankę DNA z chipa i przelej ją do rurki wirówki o pojemności 1,5 lub 2,0 mililitra.Dodaj 350 mikrolitrów wcześniej podgrzanej wody wolnej od nukleazy bezpośrednio na powierzchnię chipu. Pipetuj energicznie mniejszą pipetą, ustawiając końcówkę tak, by wywierać ogromną silę, nie dotykając chusteczki ani nie drapiąc odprysku. Połącz wash z 400 mikrolitrami komplementarnej mieszanki DNA zebranej wcześniej, zapewniając, że łączy się tylko materiał z jednego chipu.Umieść na chipie 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy. Zamknąć szkiełko sekwencjonujące stereo i przechować do lodówki do końca protokołu. Segmentacja pojedynczych komórek za pomocą potoku SAW została osiągnięta na sekcjach FFPE, umożliwiając mapowanie na niepoliadenylowane RNA, takie jak tRNA, TRDMT1.Interaktywna wizualizacja przestrzenna pokazała domniemane typy komórek za pomocą własnego oprogramowania StereoMap, z klastrami wyświetlanymi w różnych kolorach na powiększonym obszarze tkanki. Całkowita ekspresja niepoliadenylowanego RNA TRDMT1 została zwizualizowana za pomocą StereoPi. Adaptacje protokołu rozwiązują problemy związane z pełnym profilowaniem przestrzennym tkanek tłuszczowych i delikatnych w transkryptomice, poprawiając przyczepność tkanek, dostępność RNA oraz obsługę stereo-sekwencji na tych trudnych typach tkanek.Stereo-seq obecnie zapewnia wyższą rozdzielczość niż inne metody transkryptomii przestrzennej, z rozdzielczością 500 nanometrów w porównaniu do dwóch mikronów. Zapewnia również bezstronne przechwytywanie potrzebne do badania mikrobiomu, transkrypcji wirusowych i niepoliadenylowanych.

comprehensive-spatial-profiling-species-agnostic-transcriptomes-via

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Ten protokół przedstawia porównawczy proces tworzenia transkryptomu i adnotacji de novo dla początkujących bioinformatyków. Przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie całkowicie za pośrednictwem CyVerse i połączony przez magazyn danych. Używany jest wiersz poleceń i graficzne interfejsy użytkownika, ale cały potrzebny kod jest dostępny do skopiowania i wklejenia.

Wykorzystanie zasobów CyVerse do transkryptomiki porównawczej de novo organizmów nieobjętych modelem

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę Stereo-seq do przestrzennego profilowania transkryptomów z tkanek FFPE w badaniach mikrośrodowiska nowotworowego jajnika. Technika umożliwia identyfikację biomarkerów predykcyjnych i terapeutycznych.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Przeglądaj więcej filmów