Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Nasze badania koncentrują się na szczegółowej charakteryzacji mikrośrodowiska guza jajnika w celu identyfikacji predykcyjnych i terapeutycznych biomarkerów. Na przykład chcielibyśmy znaleźć markery przewidujące reakcję na chemię i oporność na chemię lub nowe cele terapeutyczne dla leczenia drugiego biegu. Wyzwania eksperymentalne obejmują obsługę próbki, ocenę jakości próbki oraz długość czasu jej przetwarzania.

Natomiast po stronie analizy danych wyzwania obejmują takie rzeczy jak rzadkość danych, podobnie jak w innych procesach pojedynczych komórek, a także mapowanie obszarów, zwłaszcza powtarzalnych. Po wyjęciu stereo-sekwencjonującego N-Chip z opakowania, zapisz numer identyfikacyjny chipa. Nie dotykając powierzchni N-Chip, wyczyść szkło 100% etanolem.

Za pomocą mikropipety ostrożnie nałóż 10 mikrolitrów ultrafioletowej żywicy ceramicznej utwardzalnej wokół krawędzi stereo-sekwencjonującego N-Chip. Użyj szczelnie zamkniętego wymazywacza, aby usunąć nadmiar żywicy, zostawiając tylko cienką linię wokół krawędzi odprysku. Umieść szkiełko w urządzeniu do utwardzania ultrafioletowego, upewniając się, że powierzchnia układu nie jest dotykana.

Następnie umieść nałożony na żywicę odprysk na nieprzezroczystą maskę na 405-nanometrowym świetle ultrafioletowym, aby oświetlić tył szkiełka i utwardzaj się przez pięć minut. Po utwardzeniu użyj szczelnie zamkniętych wymazów piankowych namoczonych w etanolu 100% molekularnym, następnie w 70% etanolu, a na końcu w wodzie bez nukleazy do czyszczenia wokół krawędzi nałożonej żywicą. Zanurz chip trzy razy w świeżej, beznukleazowej wodzie za pomocą stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Używając sprężonego powietrza, wysusz chip z pełną siłą powietrza pod kątem około 60 do 80 stopni, poruszając się po ukośnej powierzchni z odległości około pięciu centymetrów. Następnie nałóż równomiernie 150 mikrolitrów roztworu Poly-L-Lysine na całą powierzchnię chipu i inkubuj chip przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór poli-L-lizyny z chipa.

Po drugim myciu ostrożnie wysusz krawędzie szkiełka, nie dotykając powierzchni wyprysku. Solidnie wysusz chip za pomocą sprężonego powietrza, jak pokazano wcześniej. Podczas sekcji tkanki FFPE nie dotykaj bezpośrednio chipu i pokrywaj tylko 80% powierzchni tkanki.

Aby przygotować dwa mikrolitry jednoniciowego roztworu barwienia DNA w buforze SSC, rozcieńcz jednoniciowy odczynnik DNA kubitu buforem 5X SSC. Stwórz główną mieszankę roztworu barwiącego za pomocą rozcieńczenia inhibitora rybonukleazy o stężeniu 1 do 20, rozcieńczenia roztworu jednoniciowego DNA o stężeniu 1 do 200 oraz pozostałej objętości z buforem 5X SSC. Dodaj 150 mikrolitrów roztworu barwiącego do każdego odłamku i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie delikatnie usuwaj roztwór barwiący z rogu każdego odprysku pipetą. Po dwukrotnym umyciu chipu buforem SSC 0.1X przez 10 do 15 sekund, ostrożnie wysusz krawędzie zamka. Dodaj około trzech do pięciu mikrolitrów glicerolu na szkiełko, aby go zamontować.

Zrzuć pokrywkę z około jednego centymetra nad prowadnią, utrzymując ją na poziomie i upewniając się, że nie dotyka powierzchni wyprysku. Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne tkanek zabarwionych DNA na jednej nici za pomocą mikroskopu szerokopolnego, zapewniając 10% nakładania się kafelków obrazowych. Zszyj uzyskane obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, takim jak ImageJ, najpierw wykorzystując teoretyczne nakładanie się do wygenerowania przybliżonych pozycji kafelków, a następnie stosując nakładanie pikseli obliczeniowe, aby precyzyjnie dopracować kafelki.

Przetworz zszyte obrazy w oprogramowaniu StereoMap i poupewnij się, że kontrola jakości obrazu jest zaliczona, zanim kontynuuuję. Zanurz szkieł sekwencjonujący stereo w 30 mililitrach bufora SSC 0,1X, aż slip się odłączy. Upewnij się, że odczynnik do odłączania FFPE jest w temperaturze pokojowej i sprawdź go pod kątem cząstek.

Włącz termocykler i ustaw go na 30 stopni Celsjusza dla równowagi, 95 stopni Celsjusza na 30-minutową inkubację oraz nieskończone utrzymanie na czterech stopniach Celsjusza. Złóż uszczelkę kasety i włóż suwak chipu stereo do kasety. Następnie dodaj odczynnik FFPE do odłączania do kasety stereo-sekwencyjnej, przyklej taśmę uszczelniającą kasetę i potwierdzi, że jest szczelnie zamknięta.

Rozpocznij 30-minutową inkubację w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Po 10 minutach umieść 25 mililitrów metanolu w pojemniku o pojemności 50 mililitrów w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza, przygotowując około jednego mililitra na każde szkiełko do późniejszego użycia. Po wyjęciu chipu z termocyklera przenieś kasetę zamkową na stoł i zdejmij taśmę uszczelniającą.

Za pomocą pipety usuń i wyrzuć odczynnik FFPE do odłączania z kasety. Gdy odczynnik zostanie całkowicie usunięty, odłącz kasetę i uszczelkę i wyrzuć je. Pod sterylnym kapturem wysusz krawędź zamka i w razie potrzeby nałóż nową komorę silikonową.

Dodaj 500 mikrolitrów schłodzonego metanolu z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza, zapewniając, że cały odcinek jest zanurzony. Roztwór PR na suchym bloku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przed użyciem. Po utrwaleniu, w okapie spalinowym, zetrzyj nadmiar metanolu z preparatu i poczekaj, aż reszta metanolu na chipie wyparuje.

Złóż nową uszczelkę na końcu kasety. Po zakończeniu parowania umieść suwak układu stereo sekwencjonującego do kasety. Dodaj do chipu 200 mikrolitrów podgrzanego odczynnika permeablizacyjnego.

Przyklej taśmę uszczelniającą kasetę do sekwencjonowania stereo i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta. Wykonaj transkrypcję odwrotną, a następnie uwolnienie i oczyszczenie CDNA zgodnie z instrukcjami przedstawionymi tutaj. Podgrzej wodę wolną od nukleazy do 37 stopni Celsjusza.

Usuń uszczelkę z odprysku. Pipety energicznie przesuwaj każdy róg i środek odprysku na chusteczkę, nie drapiąc ani nie dotykając jej. Zbierz całą komplementarną mieszankę DNA z chipa i przelej ją do rurki wirówki o pojemności 1,5 lub 2,0 mililitra.

Dodaj 350 mikrolitrów wcześniej podgrzanej wody wolnej od nukleazy bezpośrednio na powierzchnię chipu. Pipetuj energicznie mniejszą pipetą, ustawiając końcówkę tak, by wywierać ogromną silę, nie dotykając chusteczki ani nie drapiąc odprysku. Połącz wash z 400 mikrolitrami komplementarnej mieszanki DNA zebranej wcześniej, zapewniając, że łączy się tylko materiał z jednego chipu.

Umieść na chipie 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy. Zamknąć szkiełko sekwencjonujące stereo i przechować do lodówki do końca protokołu. Segmentacja pojedynczych komórek za pomocą potoku SAW została osiągnięta na sekcjach FFPE, umożliwiając mapowanie na niepoliadenylowane RNA, takie jak tRNA, TRDMT1.

Interaktywna wizualizacja przestrzenna pokazała domniemane typy komórek za pomocą własnego oprogramowania StereoMap, z klastrami wyświetlanymi w różnych kolorach na powiększonym obszarze tkanki. Całkowita ekspresja niepoliadenylowanego RNA TRDMT1 została zwizualizowana za pomocą StereoPi. Adaptacje protokołu rozwiązują problemy związane z pełnym profilowaniem przestrzennym tkanek tłuszczowych i delikatnych w transkryptomice, poprawiając przyczepność tkanek, dostępność RNA oraz obsługę stereo-sekwencji na tych trudnych typach tkanek.

Stereo-seq obecnie zapewnia wyższą rozdzielczość niż inne metody transkryptomii przestrzennej, z rozdzielczością 500 nanometrów w porównaniu do dwóch mikronów. Zapewnia również bezstronne przechwytywanie potrzebne do badania mikrobiomu, transkrypcji wirusowych i niepoliadenylowanych.