Trójwymiarowe wzory biofilmów inżynieryjnych za pomocą biodrukarki zrób to sam

Biodruk 3D z bakteriami to nowo opracowana technika. Protokół ten zapewnia łatwy sposób konstruowania biofilmów inżynieryjnych drukowanych w 3D z bakteriami. Główną zaletą tej techniki jest możliwość produkcji biofilmów drukowanych w 3D za pomocą niedrogiej domowej drukarki 3D.

Jednym z możliwych zastosowań naszej drukarki 3D jest tworzenie powtarzalnych biofilmów modelowych, które można wykorzystać do opracowania nowych terapii przeciwbakteryjnych. Nasze podejście do druku 3D można zastosować do każdego rodzaju bakterii, który jest kompatybilny z naszym biotuszem na bazie alginianu. Przygotowanie biotuszu i podłoży drukarskich jest dość standardową procedurą, podczas gdy proces drukowania 3D, a zwłaszcza kalibracja osi Z, jest kluczowym krokiem, który wymaga pewnej praktyki.

Kalibracja ustawionej wysokości dostępu będzie miała wpływ na rozdzielczość naszej drukarki 3D i jest mocno uzależniona od osobistego doświadczenia. Ta procedura wymaga ręcznych regulacji i trudno jest ją opisać w formie pisemnej. Podłącz końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do silikonowej rurki i zamontuj końcówkę pipety na głowicy ekstrudera drukarki 3D jako zamiennik oryginalnej wytłaczarki.

Następnie dodaj cztery mililitry pięciomolowego roztworu chlorku wapnia do 400 mililitrów 1% agaru rozpuszczonego w bulionie Luria-Bertani i uzupełnij go odpowiednimi antybiotykami i induktorami. Następnie dozuj 20 mililitrów roztworu agaru LB do każdej szalki Petriego o wymiarach 150 milimetrów na 15 milimetrów. Suszyć naczynie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, z pokrywką do połowy otwartą.

Przygotuj 3% roztwór alginianu sodu i podgrzej go trzykrotnie do temperatury wrzenia, aby wysterylizować roztwór. Następnie przechowuj sterylny roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu jego użycia. Aby przygotować bakteryjny składnik biotuszu, hoduj bakterie E. coli przenoszące plazmidy do konstytutywnej ekspresji GFP w 50 mililitrach pożywki LB zawierającej antybiotyki.

Wstrząśnij kulturą przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez noc. Po całonocnym wzroście kultury, osadzać bakterie przez pięć minut pod ciśnieniem 3, 220 razy większym niż grawitacja, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 mililitrach pożywki LB i dodać 10 mililitrów 3% alginianu sodu.

Podłącz drukarkę 3D do komputera i otwórz oprogramowanie do drukowania 3D. Kliknij przycisk Home (Strona główna) dla osi X, Y i Z, aby przesunąć głowicę drukującą do pozycji początkowej. Dla każdego wydruku należy umieścić przygotowane podłoże drukarskie w określonym miejscu na stole drukarskim.

Podnieś głowicę drukującą na wysokość ponad 22 milimetrów pod kontrolą ręczną, tak aby nie kolidowała z krawędzią szalki Petriego podczas ruchu. Umieść głowicę drukującą nad górną częścią płyty i przesuń ją w dół, aż końcówka pipety zetknie się z powierzchnią drukowania. Przypisz tę pozycję osi Z jako Z1, wysokość powierzchni drukowania.

Następnie podnieś głowicę drukującą i ręcznie przesuń ją poza obszar płyty. Jeśli odległość robocza między głowicą drukującą a powierzchnią płyty jest zdefiniowana jako Z2, wprowadź wysokość powierzchni drukowania wraz z odległością roboczą do programu drukowania jako wartość Z podczas drukowania. Załaduj wstępnie zaprogramowany plik G-code zawierający polecenia do drukowania żądanego kształtu.

W każdym wierszu polecenia można zmienić położenie głowicy drukującej w osiach X, Y i lub Z. Pamiętaj, aby wprowadzić wartość Z podczas wszystkich etapów drukowania jako wysokość powierzchni drukowania plus odległość robocza. Załaduj płynny biotusz do strzykawek i zamontuj je w pompie strzykawkowej biodrukarki 3D.

Następnie ustaw prędkość wytłaczania na 0,3 mililitra na godzinę. Wydrukuj biotusz na podłożu drukarskim, klikając przycisk Drukuj. Poczekaj z uruchomieniem pompy strzykawkowej do momentu rozpoczęcia drukowania i zetknięcia się głowicy drukującej z powierzchnią drukowania.

Podczas drukowania można całkowicie kontrolować ruch głowicy drukującej za pomocą oprogramowania. Zatrzymaj pompę strzykawkową, gdy tylko głowica drukująca dotrze do ostatniego punktu drukowania, w przeciwnym razie nadmiar biotuszu spadnie na podłoże drukarskie i zmniejszy rozdzielczość drukowania. W przypadku konstrukcji 3D wszystkie ruchy głowicy drukującej są kontrolowane w edytorze G-code.

Aby zwiększyć wysokość drukowania dla drugiej warstwy, wpisz wysokość drukowania pierwszej warstwy i zwiększ wartość Z w kodzie o 0,2 milimetra. Następnie zwiększ wartość Z o 0,1 milimetra, przechodząc do wyższej warstwy. Wydrukowane próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy do sześciu dni, aby umożliwić produkcję składników biofilmu, takich jak włókna Curli.

Następnie umieść płytkę na skanerze fluorescencyjnym i zobrazuj płytki. Aby rozpuścić matrycę alginianową, dodaj 20 mililitrów 0,5 molowego roztworu cytrynianu sodu o pH 7 do wydrukowanego podłoża. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, wstrząsając z prędkością 30 obr./min.

Następnie wyrzuć płyn i ponownie zobrazuj płytki, aby porównać je z obrazami płytek przed i po zabiegu cytrynianu. Biodrukarka 3D może tworzyć bakterie kapsułkujące hydrożele w różnych dwuwymiarowych i trójwymiarowych kształtach. Te wydrukowane kształty można następnie wykorzystać do oceny, czy tworzenie biofilmu zakończyło się sukcesem, czy też matryca alginianowa została całkowicie rozpuszczona za pomocą roztworu cytrynianu sodu.

W przypadku biotuszu bez indukowalnego plazmidu produkcyjnego Curli, wydrukowany wzór został całkowicie rozpuszczony po zabiegu cytrynianem sodu, co oznacza, że nie utworzyła się sieć Curli biofilmu. Bakterie zawierające indukowalny plazmid produkcyjny Curli nie zostały rozpuszczone po leczeniu cytrynianem sodu, co wskazuje, że wydrukowane bakterie były w stanie utworzyć sieć Curli wystarczająco rozległą, aby ustabilizować wydrukowany wzór bakterii. Aby konstruować struktury wielowarstwowe, dodatkowe warstwy można wydrukować, sterując edytorem G-code.

Zwiększenie liczby drukowanych warstw w próbce powodowało stopniowe zwiększanie szerokości i wysokości drukowanych struktur. Kiedy E. coli zmodyfikowane do indukowalnego wytwarzania białek Curli zostały wydrukowane w wielowarstwowych strukturach, leczenie cytrynianem sodu nie rozpuściło próbek, podczas gdy wielowarstwowe struktury zawierające E. coli niewytwarzające Curli zostały rozpuszczone. Najbardziej krytycznymi częściami procedury drukowania 3D są kalibracja osi Z oraz koordynacja rozpoczęcia drukowania i uruchomienia pompy strzykawkowej.

Biotusz opracowany dla tego procesu jest dość miękki i ma niską wytrzymałość. Dalsze modyfikacje biotuszu mogą być wprowadzane w celu zapewnienia i poprawy stabilności mechanicznej. Ta technika druku 3D umożliwia wytwarzanie biofilmów o doskonałych właściwościach mechanicznych, które mogą umożliwić wytwarzanie materiałów biomimetycznych.

Podczas obchodzenia się z tymi bakteriami należy nosić odpowiednią ochronę, taką jak rękawice.