Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Nasz protokół może mapować komunikację chemiczną małych cząsteczek między komórkami i tkankami, a my zastosowaliśmy go specjalnie do badania małych cząsteczek w metatezie raka jajnika. Główną zaletą naszej techniki jest możliwość pomiaru małych cząsteczek w sposób bezznacznikowy przy zachowaniu integralności przestrzennej komórek i tkanek w 2D. Technika ta pozwoliła nam zbadać udział małych cząsteczek w przerzutach raka jajnika w sposób nieukierunkowany.

Może to doprowadzić do odkrycia nowych celów terapeutycznych i ścieżek, które wcześniej były pomijane. Metodologię tę można łatwo rozszerzyć na inne nowotwory, które mogą być hodowane w agarozie i każdej innej chorobie, w której składnik przestrzenny może być ważny dla uzyskanego fenotypu komórkowego. Upewnienie się, że wszystkie komórki i komponenty są w zasięgu ręki oraz cierpliwość w procesie suszenia jest niezbędne dla tego protokołu.

Pospieszny etap osuszania może często prowadzić do niskiej jakości danych ze spektrometrii mas. Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna w zrozumieniu naszych etapów przygotowania próbki i suszenia, ponieważ znacznie odbiegają one od typowych eksperymentów spektrometrii mas z obrazowaniem, które wykorzystują tkanki lub drobnoustroje na agarze. Na początek upłynnij agarozę w temperaturze 70 stopni Celsjusza na gorącym talerzu.

Umieść ośmiodołkową przegrodę na szkiełku nasączonym ITO. Poprzez standardowe traktowanie trypsyną, zbierz komórki MOE w 15-mililitrowej stożkowej probówce, odwiruj i dodaj jeden raz pożywkę DMEM do ponownego zawieszenia, aby uzyskać stężenie 50 000 komórek na 150 mikrolitrów, co stanowi dwukrotność pożądanej końcowej gęstości. W przypadku niepodzielonych kokultur użyj kleszczy, aby dodać eksplant jajnika do środka czterech studzienek.

Tuż przed posiewem połącz 200 mikrolitrów zawiesiny komórek i 200 mikrolitrów skroplonej agarozy w pojedynczych dwumililitrowych probówkach. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza. Natychmiast dodaj 300 mikrolitrów mieszaniny komórek i agarozy do każdej studzienki i wywieraj ciągły, delikatny nacisk w dół na rozdzielacz, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani mieszania między studzienkami.

Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza, a jajnik pozostaje w środku studzienki. Jeśli pipetowana agaroza naruszyła jajnik, delikatnie użyj końcówki pipety, aby ją wyśrodkować, zanim agaroza ostygnie. Następnie inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w nawilżanym inkubatorze.

W przypadku podzielonych kokultur wytnij przegrody z cienkiego, gładkiego tworzywa sztucznego. Używane są boki sterylnego, jednorazowego zbiornika na media. Przytnij je na tyle szeroko, aby dobrze pasowały do przeciwprostokątnej studni.

Umieść ośmiodołkową przegrodę na szkiełku poddanym obróbce ITO i włóż plastikowe przekładki po przekątnej do studzienek. Przygotuj hodowle komórkowe tak, jak poprzednio, i połącz 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i 100 mikrolitrów skroplonej agarozy w dwumililitrowej probówce. Natychmiast umieść 150 mikrolitrów mieszaniny komórek i agarozy po jednej stronie rozdzielacza, utrzymując nacisk na przegrodę w dół.

Pozwól agarozie ostygnąć i zestaleniu się przez około minutę, a następnie wyjmij rozdzielacz. Użyj kleszczy, aby umieścić eksplant jajnika na środku pustej połowy studzienki. Dodaj 150 mikrolitrów mieszaniny komórkowo-agarozowej na wierzch jajnika.

Inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w nawilżanym inkubatorze. Po czterech dniach wyjmij rozdzielacz komory z korków agarozowych. Płaską szpatułką oderwij boki agarozy od komory i delikatnie pociągnij komorę do góry.

Jeśli jakiekolwiek zatyczki agarozowe zostaną poruszone, delikatnie zmień ich położenie, aby się nie stykały. Umieść szkiełko w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około cztery godziny i obracaj o 90 stopni co godzinę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie ciepła w całej próbce. Szkiełko musi być całkowicie wysuszone.

W przeciwnym razie może to doprowadzić do eksplozji próbki w środowisku wysokiej próżni spektrometru mas MALDI-TOF. Suszenie szkiełka i monitorowanie postępu jest najważniejszym krokiem do osiągnięcia wysokiej rozdzielczości przestrzennej i jakości widm masowych. Jeśli wystąpi łuszczenie lub nadmierne marszczenie, nie zalecamy zbierania danych ze spektrometrii mas.

Mając parametry ustawione na opryskiwaczu matrycowym, nałóż roztwór matrycy na szkiełko. Aby użyć czerwieni fosforowej jako kalibru, dodaj jeden mikrolitr czerwieni fosforowej do czystego miejsca na szkiełku. Aby użyć mieszaniny peptydów jako kalibru, wymieszaj ją z matrycą na Parafilm w stosunku jeden do jednego, aby wspomóc jonizację, i umieść 0,5 do jednego mikrolitra na szkiełku.

Poczekaj, aż calibrant wyschnie przed akwizycją danych spektrometrii mas obrazowania. Narysuj X za pomocą markera permanentnego w każdym rogu slajdu i zrób zdjęcie optyczne za pomocą aparatu lub skanera w rozdzielczości 1200 dpi. W tym eksperymencie dokładne monitorowanie szkiełka w piecu jest niezbędne, aby zapewnić optymalny wysuszony szkiełko ITO, co skutkuje płaską, wysuszoną próbką z minimalnymi lub zerowymi zmarszczkami na powierzchni agarozy.

Ten rysunek pokazuje zmarszczki, których należy unikać. Zmarszczki mogą nieznacznie wpływać na wysokość, a tym samym na dokładność masy sygnałów spektrometrii mas obrazowania. Niewielkie zmarszczki nie wpłyną na jakość danych.

Optymalnie zlokalizowana tkanka powinna znajdować się jak najbliżej środka. Użyta tkanka powinna znajdować się w środku studzienki, jeśli jest niepodzielona, lub w środku półtrójkąta, jeśli jest podzielona tak, aby pozyskiwanie danych IMS nie było zanieczyszczone efektami krawędzi. Źle ustawiona tkanka, podczas obrazowania, może powodować fałszywe sygnały masy z efektów krawędziowych.

Wysuszony obraz szkiełka służy do uczenia spektrometru mas MALDI-TOF, które obszary należy obrazować. Małe obszary wokół tkanki jajnikowej wybrano do IMS przy 50 mikrometrach. Reprezentatywny obraz sygnału m-over-z jest pokazany dla niepodzielonych kokultur, a także dla konfiguracji dzielonej komory.

Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że uzyskane dane są tylko tak dobre, jak przygotowanie próbki. Zwróć szczególną uwagę na proces suszenia. Najbardziej ekscytującym aspektem jest walidacja małych cząsteczek odkrytych w ten sposób za pomocą innych eksperymentów, takich jak testy inwazji lub testy kolonizacji, w celu poinformowania o efektywnym stężeniu i przełożenia na biologię człowieka.

Oczekujemy, że otworzy to drzwi do odkrycia nowych ścieżek potencjalnych celów terapeutycznych w raku jajnika poprzez lepsze zrozumienie procesów zachodzących w pierwotnej metatezie raka jajnika.