Kompleksowy program autopsji dla osób ze stwardnieniem rozsianym

Celem naszych badań jest poznanie patogenezy stwardnienia rozsianego. Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy program szybkiej autopsji, aby uzyskać i zbadać mózgi osób ze stwardnieniem rozsianym. Istnieją dwa szczególne aspekty naszego programu autopsji, pierwszym z nich jest to, że jest on szybki. Zbieramy dane o tym, że mózg umiera poniżej sześciu do ośmiu godzin.

Pozwala to na prowadzenie najnowocześniejszych badań molekularnych. Drugim aspektem jest to, że wykonujemy rezonans magnetyczny in situ, zanim poruszymy mózgiem. Pozwala to na skorelowanie zmian patologicznych ze zmianami w obrazowaniu mózgu.

Demonstracja wizualna pozwala widzom zrozumieć, w jaki sposób organizujemy naszą przestrzeń i czas, aby osiągnąć optymalne rezultaty. Przetwarzanie tkanek, które odbywa się szybko i ostrożnie, pozwala na analizę RNA, barwienie immunologiczne, immunoblotting i korelacje MRI. Nowi badacze mogą mieć problemy z przetwarzaniem tkanek o słabej integralności tkanki.

Unikanie długiego czasu fiksacji pośmiertnej jest ważne, a prążki rdzenia tkankowego MRI mogą być trudne, dlatego konsultacja z ekspertami ds. analizy MRI może być bardzo przydatna. Procedurę zademonstrują Emilie Christie i Christina Volsko. Technicy z naszego laboratorium.

Po obrazowaniu rezonansu magnetycznego in situ zważ i sfotografuj mózg, a następnie umieść przyczepioną oponę twardą w pojemniku z 4% paraformaldehydem lub PFA. Oddziel móżdżek i pień mózgu od mózgu i sfotografuj mózg. Za pomocą sondy oddzielić nerwy wzrokowe, skrzyżowanie i drogi oddechowe, a następnie wyciąć strukturę skalpelem.

Oddziel półkule mózgowe wzdłużnie i sfotografuj każdą półkulę z osobna. Nałóż tusz na pierwszorzędową korę ruchową lub PMC na lewą półkulę, ponownie sfotografuj tkankę i umieść tkankę w pojemniku o pojemności 3,3 litra w celu długiego utrwalenia. Aby wyciąć PMC dla prawej półkuli, usuń pokrywające opony mózgowe i ponownie sfotografuj tkankę.

Następnie należy przeciąć PMC za pomocą skalpela. Następnie sfotografuj wycięty PMC obok półkuli. Pokrój PMC na sześć równych sekcji i narysuj aspekt rostralny każdej sekcji.

Następnie umieść co drugą sekcję w pojemnikach wypełnionych PFA w celu krótkiego zamocowania. I zatrzaskowo zamroź pozostałe sekcje do przechowywania w szczelnie zamkniętych torebkach do zamrażania, w lodówce numer jeden. Przetnij prawą półkulę od przodu do tyłu na odcinki koronalne o grubości jednego centymetra.

Zamocuj co drugą sekcję w PFA i zamroź pozostałe sekcje do przechowywania w szczelnie zamkniętych torebkach do zamrażania, w lodówce numer jeden. Oddziel pień mózgu od móżdżku i umieść pień mózgu w pojemniku wypełnionym PFA w celu krótkiego utrwalenia. Przetnij każdą półkulę móżdżku na cztery równo zamocowane sekcje strzałkowe i sfotografuj widok przyśrodkowy i boczny.

Następnie umieść lewe plastry półkuli móżdżku w pojemniku z PFA w celu krótkiego utrwalenia. I zamroź prawe plastry półkuli móżdżku do przechowywania w szczelnie zamkniętych torebkach do zamrażania, w lodówce numer jeden. Po uzyskaniu rdzenia kręgowego z korzeniami nerwowymi należy usunąć oponę twardą rdzenia kręgowego i przechowywać oponę twardą w PFA.

Oddziel lewe i prawe przednie i tylne korzenie nerwowe i odetnij lewe przednie i tylne korzenie nerwowe od rdzenia kręgowego w celu krótkiego utrwalenia w PFA. Odetnij prawe przednie i tylne korzenie nerwowe od rdzenia kręgowego i zatrzaskowo zamroź te tkanki do przechowywania w szczelnie zamkniętych torebkach do zamrażania, w lodówce numer dwa. Następnie sfotografuj najbardziej ogonowe 20 centymetrów rdzenia kręgowego i wytnij dwucentymetrowe odcinki transferowe od kierunku ogonowego do rostralnego rdzenia kręgowego w celu krótkiego mocowania PFA i zatrzaskowego zamrożenia.

Następnie sfotografuj pozostałą część rostralną rdzenia kręgowego. I wytnij dwucentymetrowe odcinki transferowe od kierunku ogonowego do rostralnego sznurka, aby uzyskać krótkie mocowanie PFA i zatrzaskowe zamrażanie. Wytnij interesujące Cię odcinki z krótkich lub długich utrwalonych tkanek.

Umieścić skrawki w indywidualnych dołkach na płytce sześciodołkowej i przemyć chusteczki trzema pięciominutowymi płukaniami w dwóch mililitrach świeżego PBS na pranie, potrząsając. W celu pobrania antygenu należy podgrzać skrawki w kuchence mikrofalowej przez dwie do trzech minut w szklanej zlewce zawierającej około 30 mililitrów 10-mililitrowego buforu cytrynianu. Gdy sekcje ostygną do temperatury pokojowej, przenieś próbki na nową sześciodołkową płytkę na trzy pięciominutowe płukania i dwa mililitry PBS, plus 0,3% Triton X-100 na studzienkę, na mycie.

Następnie endogenna peroksydaza blokuje się w dwóch mililitrach 3% nadtlenku wodoru i 0,3% Triton X-100 w PBS przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć sekcje trzy razy w dwóch mililitrach PBS plus Triton X-100 na pranie, jak pokazano. Następnie zablokuj dwa mililitry 3% normalnej surowicy koziej i PBS plus Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj skrawki od nocy do pięciu dni w pierwotnych przeciwciałach będących przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie trzy pięciominutowe płukania w dwóch mililitrach PBS na pranie. Skrawki inkubować w roztworze kompleksu awidyna-biotyna lub kompleksie ABC przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj trzy pięciominutowe mycia w PBS.

Oznacz skrawki dwoma mililitrami przefiltrowanej diaminobenzydyny uzupełnionej nadtlenkiem wodoru na studzienkę przez trzy do ośmiu minut. Gdy kolor odpowiednio się rozwinie, umyj skrawki trzy razy w PBS i indywidualnie przenieś każdą sekcję do pojemnika wypełnionego PBS. Umieść każdą sekcję płasko, pod pojedynczymi szkiełkami tkankowymi.

I delikatnie podnieś każdy slajd z PBS, utrzymując sekcje tak płaskie, jak to możliwe. Użyj dwóch pędzli, aby delikatnie spłaszczyć i rozciągnąć każdą chusteczkę. I użyj ręcznika papierowego, aby zetrzeć nadmiar wody.

Następnie zamontuj sekcje za pomocą odpowiedniego medium montażowego i uszczelnij każdą szkiełko nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci. Wycinki tkanek są badane pod kątem obecności zmian w istocie białej, a wybrane regiony są barwione pod kątem aktywności immunologicznej i demielinizacji. W ostrych zmianach mnogich Sceloris wiele z tych zdemielinizowanych aksonów działa jak opuszki retrakcyjne aksonów, które odbijają proksymalne końce przeciętych aksonów.

Gęstość transektowanych aksonów w ostrych zmianach przekracza 11000 na milimetr sześcienny w aktywnych zmianach w porównaniu do zaledwie 15 w sąsiednich obszarach istoty białej niezmienionych chorobowo. Nowo powstałe oligodendrocyty są również obecne w wielu przewlekłych zmianach chorobowych na stwardnienie rozsiane. Procesy te wiążą się z demielinizowanymi aksonami, ale ich nie mielinują.

Reprezentatywne, bezstronne poszukiwanie zmian genów neuronalnych w szybko zamrożonym kortekście ruchowym uzyskanym od pacjentów z przewlekłym stwardnieniem rozsianym zidentyfikowało znaczące redukcje 23 jądrowych i kodowanych mitochondrialnych informacyjnych RNA Badania uwierzytelniające przy użyciu immunocytochemii i hybrydyzacji in situ wykazały, że geny te były znacznie wzbogacone w neurony projekcyjne kory i że mitochondria wyizolowane z aksonów projekcyjnych wykazują zmniejszoną glikolizę. Porównanie ekspresji genów neuronodów w zmielinizowanych i zdemielinizowanych hipokampach ujawnia zmniejszenie liczby neuronalnych informacyjnych RNA, w tym białek zaangażowanych w pamięć i uczenie się. Ponadto, w porównaniu z korą kontrolną, utrata neuronów korowych jest znacznie większa w subpopulacji pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, którzy mają demielinizację rdzenia kręgowego i kortekstu mózgu, ale nie istoty białej mózgu.

Podczas przetwarzania tkanek należy upewnić się, że podczas cięcia odcinków koronalnych są one cięte konsekwentnie pod względem grubości i orientacji. I że leżą płasko, gdy unoszą się w utrwalaczu lub po zamrożeniu. Oprócz analizy immunohistochemicznej, pobranie zamrożonych tkanek daje nam możliwość przeprowadzenia analizy genetycznej i proteomicznej.

Techniki te pomogły w identyfikacji nowej kohorty pacjentów ze stwardnieniem rozsianym ze zmianami w istocie białej mózgu w MRI, ale bez znaczącej demielinizacji istoty białej. Określane jako stwardnienie rozsiane kory mięśniowej.