Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Rozpoznanie choroby Parkinsona nadal opiera się na klinicznych objawach zajęcia motorycznego, które pojawiają się później w przebiegu choroby, kiedy większość neuronów istoty czarnej jest już utracona. Protokół ten umożliwia analizę nerwów skórnych za pomocą biopsji skóry, która stanowi potencjalny nowy biomarker choroby, do wykorzystania w badaniach klinicznych. Biopsja skóry jest łatwą do oceny, nieinwazyjną procedurą, która umożliwia analizę obwodowej tkanki nerwowej, która jest podatna na patologię.

Wykrywanie agregatów alfa synukleiny za pomocą biopsji skóry może być wykorzystywane do celów diagnostycznych, prawdopodobnie we wczesnych fazach, kiedy potencjalne wyleczenie jest najbardziej skuteczne. Kontrolne biopsje skóry u tego samego pacjenta pozwalają na analizę czasu i specjalnego przebiegu rozprzestrzeniania się agregatu alfa synukleiny w ludzkim układzie nerwowym. Mogą one rzucić światło na patogenezę choroby.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować nowy roztwór utrwalający PLP, zgodnie z opisem w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Natychmiast po pobraniu biopsji skóry zanurz ją w probówce zawierającej 10 mililitrów roztworu utrwalającego. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia, w dygestorium, delikatnie usuń utrwalacz PLP. W tej samej probówce przemyj biopsję trzy razy przez pięć minut każda, używając pięciu mililitrów 0,1-molowego roztworu Sorensena na każde przemycie. Wyrzuć roztwór Sorensena i dodaj pięć mililitrów roztworu krioprotektantu.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przechowuj biopsję w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli cięcie kriotomem ma być wykonane w ciągu jednego tygodnia. Najpierw ustaw kriotom na minus 20 stopni Celsjusza.

Weź kriomold i napełnij go podłożem do zatapiania w krio. Za pomocą pęsety zanurz biopsję w podłożu do zatapiania krio, tak aby oś podłużna była równoległa do dna krioformy. Zatrzaskowo zamrozić próbkę ciekłym azotem, aby uzyskać stałą kostkę pożywki do zatapiania w krio zawierającą biopsję we właściwej orientacji.

Umieść próbkę w kriostacie i odczekaj 30 minut, aby biopsja mogła się zaaklimatyzować. Następnie utrwal próbkę na kriostacie i pokrój na odcinki o długości 50 mikrometrów. Za pomocą małej szczoteczki przenieś kriosekcje na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 mikrolitrów roztworu niezamarzającego w każdym dołku.

Następnie przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na początek napełnij niektóre dołki świeżej 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami roztworu myjącego. Przenieść sekcje do analizy z płyty do przechowywania na płytę zawierającą roztwór myjący.

Pozostaw skrawki w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś każdą sekcję do pustej studzienki zawierającej ten sam roztwór myjący i powtórz pranie. Następnie dodaj roztwór płuczący do sekcji i przenieś je do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu blokującego.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie cztery godziny. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, anty-PGP9,5 i anty-5G4, w roztworze roboczym. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia umyj skrawki w studzienkach zawierających roztwór myjący, jak opisano wcześniej. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, kozi anty-królik w celu wykrycia PGP9.5 i kozioł anty-mysz, aby wykryć 5G4 w roztworze roboczym. Umyte skrawki przenieść do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał wtórnych.

Przykryj płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Następnie umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Przenieś umyte odcinki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Następnie zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania. Dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełka i przykryj sekcję szkiełkiem nakrywkowym.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc. Następnego dnia przechowuj szkiełka w odpowiednim pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uważając, aby uniknąć ekspozycji na światło. Używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, view przekroje.

Uchwyć obrazy za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, aby przeanalizować sygnały dodatnie w sekcjach pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału, jak opisano w protokole tekstowym. Zgodnie z opisaną metodą w pęczkach nerwów skórnych unerwiających struktury autonomiczne pacjentów z chorobą Parkinsa wykrywa się agregaty alfa synukleiny znakowane przeciwciałem 5G4.

Morfologia złogów alfa synukleiny pojawia się jako kropkowany sygnał wzdłuż aksonów nerwów skórnych. Reprezentatywne zastosowanie tego protokołu u 19 pacjentów z chorobą Parkinsona i 17 osób z grupy kontrolnej w biopsjach skóry w trzech miejscach anatomicznych pokazuje, że 5G4 ma czułość 81% i swoistość 86% w porównaniu ze zdrowymi grupą kontrolną. Fosforylowana alfa synukleina ma czułość 56% i swoistość 100%5G4 i fosforylowane złogi alfa synukleinowo-dodatnie znajdują się głównie wokół gruczołów potowych, ale znajdują się również w mięśniach arrector pilus, małych naczyniach oraz splotach podnaskórkowych i skórnych, ale nigdy we śródnaskórkowych włóknach nerwowych.

Ogólnie rzecz biorąc, w świetle gruczołów potowych można zaobserwować niespecyficzny sygnał, który może być błędnie zinterpretowany jako dodatnia 5G4 lub fosforylowana alfa synukleina. Ten typ sygnału jest kropkowany, kulisty i najprawdopodobniej jest spowodowany wewnątrzświetlnym materiałem autofluorescencyjnym, jak wykazano w kontrolach technicznych bez przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Kolokalizacja z PGP9.5, która oznacza włókna nerwowe, które morfologicznie są nitkowate i wydłużone, pomaga zidentyfikować prawidłowy sygnał.

W związku z tym specyficzność sygnału 5G4 jest znacznie zwiększona przez podwójne barwienie immunologiczne za pomocą markera aksonalnego. Dokładne utrwalenie biopsji jest niezbędne do uzyskania dobrej jakości barwienia immunofluorescencyjnego i wiarygodnej interpretacji sygnałów fluorescencyjnych. Jeśli utrwalacz nie zostanie prawidłowo przygotowany lub jeśli wystąpiła nadmierna fiksacja, wynikiem będzie wysoka autofluorescencja, która zamaskuje sygnał włókien nerwowych przechodzących przez połączenie skórno-naskórkowe lub unerwie główne struktury skóry właściwej.

Najważniejszym etapem tej procedury jest utrwalenie tkanki. Zwróć uwagę na pH roztworu utrwalającego PLP i czas inkubacji, aby uniknąć autofluorescencji i specyficznego sygnału.