Name: Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę swobodnej immunofluorescencji do wykrywania agregatów alfa synukleiny w skórnych włóknach nerwowych. Technika ta umożliwia wczesną diagnostykę choroby Parkinsona poprzez nieinwazyjną biopsję skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Parkinson Schweiz i ABREOC (Naukowej Radzie Doradczej ds. Badań Ente Ospedaliero Cantonale) za wsparcie finansowe tego badania.

Protokół został zatwierdzony przez Kantonalną Komisję Etyczną i wszyscy zapisani uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na badanie.
1. Kolekcja biopsji skóry
<ol>
	<li>Pozwól wykwalifikowanemu lekarzowi wykonać biopsję skóry w odpowiednich warunkach klinicznych.</li>
	<li>Wybierz obszar, w którym chcesz wykonać biopsję skóry i oczyść go wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór znieczulający z 1 ml lidokainy 2%.</li>
	<li>Trzymając igłę równolegle do obszaru, wstrzyknąć znieczulenie miejscowe podskórnie.</li>
	<li>Po sprawdzeniu efektu znieczulenia weź jednorazowy dziurkacz o średnicy 3 mm i delikatnie dociśnij rotacyjny i delikatny nacisk w dół, aby obrócić go w dół przez naskórek i skórę właściwą, aż do osiągnięcia podskórnej tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Wycofaj stempel.</li>
	<li>Użyj jednorazowych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć zatyczkę do skóry.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wyciąć podstawę próbki na poziomie tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Umieścić próbkę w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego lizynę i paraformaldehyd (PLP).</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar i przykryj go bandażem samoprzylepnym.</li>
</ol>
2. Utrwalanie i przechowywanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór utrwalający PLP (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Natychmiast po pobraniu biopsji skóry zanurzyć ją w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego PLP i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia, pod wyciągiem, delikatnie usunąć utrwalacz PLP i w tej samej probówce przemyć biopsję 3 razy przez 5 minut 5 ml 0,1 M roztworu Sorensena (Tabela 1).</li>
	<li>Odrzucić roztwór Sorensena i inkubować biopsję z 5 ml roztworu krioprotekcji O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać biopsję w temperaturze 4 °C, jeśli cięcie kriotomem jest wykonywane w ciągu 1 tygodnia; przechowywać biopsję w temperaturze -20 °C, jeśli cięcie jest wykonywane w ciągu 3 miesięcy; umieścić biopsję w kriofordzie (kroki 3.2-3.4) i przechowywać ją w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.</li>
</ol>
3. Cięcie tkanek za pomocą kriotomii
<ol>
	<li>Ustawić kriotom na -20 °C.</li>
	<li>Weź kriomold i napełnij go podłożem do zatapiania w krio. Unikaj tworzenia bąbelków.</li>
	<li>Za pomocą pęsety zanurz biopsję w podłożu do zatapiania w krioterapii z osią podłużną (naskórek - skóra właściwa) równoległą do dna krioformy.</li>
	<li>Zatrzaskowo zamroź próbkę ciekłym azotem, aby uzyskać stałą kostkę pożywki do zatapiania w krio, zawierającą biopsję we właściwej orientacji.</li>
	<li>Umieść próbkę w kriostacie i odczekaj 30 minut, aby biopsja mogła się zaaklimatyzować.</li>
	<li>Umieścić próbkę na kriostacie i wyciąć odcinki o grubości 50 μm.</li>
	<li>Za pomocą małego pędzelka przenieś kriosekcje na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 μl roztworu niezamarzającego w każdym dołku. Jedna sekcja na studzienkę.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	nuta: Jeśli analiza całej biopsji nie jest analizowana, należy ją przeciąć tylko częściowo. W takim przypadku skrawki muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C, a pozostała część biopsji w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Napełnij 96-dołkową płytkę 100 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Przenieść skrawki do analizy z płytki do przechowywania na nową zawierającą roztwór myjący. 1 sekcja na każdą studzienkę (4 sekcje na miejsce anatomiczne, na pacjenta: zwykle w sumie 12 sekcji na pacjenta).</li>
	<li>Pozostaw sekcję w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przenieś sekcję do innej studzienki zawierającej ten sam roztwór i powtórz pranie.</li>
	<li>Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu blokującego i inkubować przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała anty-PGP9.5 (poliklonalne królika, 1:1000) i anty-5G4 (monoklonalne myszy, 1:400) w roztworze roboczym.</li>
	<li>Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować je O/N w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zgodnie z punktem 4.3 przemyć sekcje 2 razy przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, przy użyciu 100 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (sprzężone z różnymi fluoroforami): kozi anty-królik w celu wykrycia PGP9.5 (1:700) i kozi anty-myszy w celu wykrycia 5G4 (1:700) w roztworze roboczym.</li>
	<li>Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Od tego momentu przykryj 96-dołkową płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z drugorzędowym przeciwciałem / przeciwciałami.</li>
	<li>Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl DAPI (rozcieńczonego 1:5 000 w PBS 1x) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania.</li>
	<li>Dodaj kilka kropel podłoża montażowego na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N przed użyciem mikroskopu konfokalnego/fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przechowywać preparaty w odpowiednim pudełku w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło. Przy dokładnym przechowywaniu sygnał będzie widoczny przez około 6 miesięcy. 
	nuta: Przeniesienie fragmentu z płytki 96-dołkowej zawierającej nowo pokrojone plastry do płytki 96-dołkowej zawierającej roztwór płuczący (krok 4.1) odbywa się za pomocą małej szczoteczki, która pomaga pobrać biopsję. Po przeniesieniu sekcji do pierwszej studzienki, za każdym razem, gdy plaster musi być inkubowany z innym roztworem, przenieś go z dołka do dołka za pomocą pędzla.</li>
</ol>
5. Obrazowanie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Oglądaj przekroje pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym (powiększenie 20X, 40X lub większe, użyj kolejnych klatek z przyrostem 2 μm na planie Z-stack, aby uzyskać najlepsze wyniki).</li>
	<li>Rejestrowanie obrazów za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu</li>
	<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (tj. ImageJ) do analizy sygnałów dodatnich w sekcjach pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału. Aby to zrobić, wykonaj czynności wymienione poniżej.
	<ol>
		<li>Otwórz plik za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
		<li>Kliknij Obraz > kolor > podziel kanały, aby przeanalizować każdy kanał koloru.</li>
		<li>Kliknij opcję Obraz > stos > projekt Z, aby uzyskać scalenie wielu przejęć sekcji.</li>
		<li>Kliknij opcję Obraz > kolor > scalić kanały, aby uzyskać scalenie różnych kanałów kolorów o tym samym pozyskaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór przeciw zamarzaniu 
			(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy)</td>
			<td>30% glicerolu 
			30% glikol etylenowy 
			30% dH2O 
			10% 2x Bufor fosforanowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór blokujący 
			(przygotuj się w tej chwili)</td>
			<td>4% normalna surowica kozia 
			1% Triton X-100 
			w Roztwór myjący</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krio-protectant 
			(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy)</td>
			<td>20% glicerol 
			80% roztwór Sorensena</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorofosforan disodowy, roztwór 
			(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy)</td>
			<td>0,45 M wodorofosforan disodowy (Na2HPO4) w dH2O 
			Filtr w sterylnej butelce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór lizyny 
			(przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni)</td>
			<td>50% 0,3M roztworu monochlorowodorku L-lizyny 
			50% 0,1 M roztworu Sorensena pH 7,6 
			pH 7,4, filtrować w sterylnej butelce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA) 8% 
			(przygotować pod wyciągiem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca)</td>
			<td>2,6 M PFA w dH2O (do 55°C_do nie przekraczać 60 °C<nr>, aby uniknąć tworzenia się kwasu mrówkowego) 
			filtr w sterylnej butelce</nr></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor fosforanowy 2x 
			(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy)</td>
			<td>6% roztwór fosforanu sodu (NaH2PO4) 
			45% roztwór fosforanu disodowego (Na2HPO4) wdH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór utrwalający PLP 
			(przygotuj się w tej chwili, pod wyciągiem )</td>
			<td>25% Paraformaldehyd 8% 
			0,01 M (meta)periodynian sodu 
			75% roztwór lizyny<</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diwodorofosforan sodu jednowodny 
			(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy)</td>
			<td>0,52 M diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4*H2O) w dH2O 
			Przefiltrować w sterylnej butelce.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór Sorensena 
			(przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca)</td>
			<td>2,5% roztwór fosforanu monosodowego 
			18,7% Roztwór fosforanu disodowego 
			pH7,6, w dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór myjący 
			(przygotuj się w tej chwili)</td>
			<td>0,25 M Trizma podstawa 
			0,26 mln NaCl 
			pH7,6, w dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór roboczy 
			(przygotuj się w tej chwili)</td>
			<td>50% roztwór blokujący 
			50% roztwór myjący</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wymagane rozwiązania. Lista wymaganych rozwiązań do protokołu oraz krótki opis sposobu jego przygotowania.

<ol><li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Tool+for+the+neurologist%27s+Tollbox%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li>
<li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilkinson%2C+PF+%22Skin%22">Skin</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).</li>
<li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+endings+in+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Federation+of+Neurological+Societies%2FPeripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li>
<li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-center%2C+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li>
<li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li>
<li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson%27s+disease%3A+a+window+into+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li>
<li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson%27s+disease+from+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li>
<li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+phosphorylated+%CE%B1-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li>
<li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li>
<li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy swobodnie unoszący się test immunofluorescencyjny do biopsji skóry w celu rozpoznania PD: wykorzystuje on podwójne barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-PGP9.5, markerem panaksonalnym i anty-5G4, przeciwciałem specyficznym dla konformacji, które rozpoznaje zagregowaną formę αSyn.
Wielkimi zaletami biopsji skóry w celach diagnostycznych w chorobie Parkinsona i ewentualnie w innych zaburzeniach konformacyjnych białek są: 1) bezpośredni dostęp do tkanki nerwowej podatnej na chorob...

Biopsja skóry zyskała ogromne znaczenie jako narzędzie diagnostyczne i badawcze w dziedzinie zaburzeń neurologicznych1. Rzeczywiście, naskórek i skóra właściwa zawierają obfite somatyczne czuciowe włókna nerwowe (zmielinizowane i niezmielinizowane), nocyceptywne wolne zakończenia nerwowe, receptory czuciowe i autonomiczne unerwienie gruczołów potowych, naczyń krwionośnych, gruczołów łojowych i mięśni arrector pilorum2.
W połowie XX wieku układ immunohistochemiczny przeciwciała PGP9.5 pozwolił na dowody rozległego unerwienia ludzkiego naskórka skóry ssaków3. PGP9.5 jest hydrolazą karboksylowo-końcową równomiernie rozmieszczoną wzdłuż aksonów zarówno ośrodka, jak i obwodowego układu nerwowego (PNS). Dostępność tego przeciwciała pozwoliła nie tylko na wyjaśnienie morfologii i anatomii PNS w skórze, ale także na przeprowadzenie badań nad chorobami z nim związanymi3,4. Biopsja skóry przyczyniła się do zdefiniowania nowej jednostki klinicznej: neuropatii drobnowłókien. Kilka międzynarodowych grup wykazało związek między utratą śródnaskórkowych włókien nerwowych a objawami/oznakami neuropatii małych włókien5 za pomocą analizy biopsji skóry i dostarczyło standaryzowane protokoły morfometrii nerwów, a także normatywne wartości referencyjne do stosowania w praktyce klinicznej6,7,8.
Ostatnio duża ilość dowodów wykazała, że choroby neurodegeneracyjne, charakteryzujące się nieprawidłowo pofałdowanymi nagromadzeniami białek w ośrodkowym układzie nerwowym, są patologiami wieloukładowymi9. Rzeczywiście, PD charakteryzuje się akumulacją αSyn w neuronie dopaminergicznym istoty czarnej, ale wykazano, że αSyn i jego patologiczna forma, fosforylowany αSyn (P-αSyn), można wykryć również w tkankach obwodowych. Błona śluzowa przewodu pokarmowego10, gruczoły ślinowe11, autonomiczne włókna skóry otaczające gruczoły potowe i mięśnie pilomotoryczne12,13,14, wykazują immunoreaktywność na patogenne formy αSyn, zgodnie z hipotezą Braaka, która intrygująco postuluje, że patologia αSyn może rozpocząć się w PNS z dużym wyprzedzeniem, zanim dojdzie do jej akumulacji w mózgu15. Ponadto wykazano obecność p-αSyn w nerwach skórnych pacjentów z zaburzeniami zachowania REM, które są uważane za prodromalne PD16,17, dlatego patologiczny skóry αSyn można uznać za obiecujący wczesny obwodowy histopatologiczny marker synukleinopatii.
Związek neuropatii małych włókien w PD został już wcześniej wykazany i stwierdzono, że gęstość wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych odzwierciedla postęp choroby18,19. W związku z tym biopsja skóry jest użytecznym narzędziem do badania neurodegeneracji w chorobie Parkinsona i do ustalenia przedśmiertnej diagnozy histopatologicznej choroby. Rzeczywiście, biopsja skóry ma tę wielką zaletę, że jest łatwo dostępną i mało inwazyjną procedurą, pozwalającą na analizę tkanki nerwowej podatnej na patologię. Wreszcie, możliwość powtórzenia biopsji skóry w toku obserwacji tych samych pacjentów pozwala na badanie podłużnej korelacji z postępem choroby.
W naszym laboratorium, wykorzystując podwójne barwienie immunologiczne za pomocą PGP9.5 i specyficznego dla konformacji przeciwciała monoklonalnego 5G4, które rozpoznaje specyficzne dla choroby formy αSyn, w tym małe agregaty20,21, udało nam się wykazać obecność agregatów αSyn w nerwach skórnych z obiecującą wysoką skutecznością diagnostyczną19. Analiza immunofluorescencyjna biopsji skóry w chorobach konformacyjnych wyróżnia się jako obiecujące źródło biomarkerów, łącząc zarówno wykrywanie agregatów białkowych, jak i pomiar neurodegeneracji in vivo. Poniżej przedstawiono łatwy i wszechstronny protokół postępowania z biopsją skóry i wykonywania swobodnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia agregatów αSyn. Co więcej, protokół ten można dostosować do celowania w dowolne inne interesujące białko ulegające ekspresji w PNS skóry.
Poniższy protokół badania został wykorzystany do oceny użyteczności diagnostycznej zagregowanej analizy αSyn w PNS PD za pomocą biopsji skóry19. Kryteriami włączenia do PD były: jednoznaczna diagnoza kliniczna zgodnie z kryteriami diagnostycznymi brytyjskiego Banku Mózgu, czas trwania choroby co najmniej 3 lata, brak historii rodzinnej oraz brak poważnych zaburzeń poznawczych lub poważnych objawów dysautonomicznych w historii. Kryteriami wykluczenia były znane przyczyny neuropatii (hemoglobina glikowana, kreatynina, witamina B12, TSH, immunofiksacja surowicy, HIV, HCV, kiła i borelioza). Każdy pacjent został poddany biopsjom skóry o średnicy 3 mm w trzech anatomicznych miejscach (szyja na poziomie skóry C8, udo 10 cm powyżej kolana, noga 10 cm powyżej kostki bocznej) po stronie, która była klinicznie bardziej dotknięta. Ogólnie rzecz biorąc, poniższy protokół dotyczy postępowania z biopsją skóry oraz wykonywania barwienia i analizy immunofluorescencyjnej w swobodnym przepływie. Dzięki temu może być dostosowany i wykorzystany do wykrywania innych interesujących białek w tkance skórnej.

<table><tbody><tr><td>5G4 (anty człowiek i alfa; Syneclein 5G4)</td><td>Analytik Jena Roboscreen</td><td>847-0102004001</td><td>Mysz monoklonalna&nbsp;</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Koza anty Królik IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1971418</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Koza przeciw mysim IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1922849</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>Roztwór wodorofosforanu disodowego</td><td>Merk Millipore</td><td>106586</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Aldrich Chemia</td><td></td><td></td>441244</tr><tr><td>PGP9.5</td><td>Abcam</td><td>ab15503</td><td>Poliklonalny</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>królika Sigma&nbsp;</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>Merck Millipore</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>(meta)periodynian sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1878</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Podłoże montażowe</td></tr></tbody></table>

celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Do tej pory, dla większości chorób neurodegeneracyjnych dostępna jest tylko pośmiertna ostateczna diagnoza histopatologiczna. W przypadku choroby Parkinsona (PD) diagnoza nadal opiera się tylko na klinicznych objawach zajęcia motorycznego, które pojawiają się w późniejszym przebiegu choroby, kiedy większość neuronów dopaminergicznych jest już utracona. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na biomarker, który będzie w stanie zidentyfikować pacjentów na początku choroby lub w przypadku ryzyka jej rozwoju. W ciągu ostatnich kilku lat biopsja skóry okazała się doskonałym narzędziem badawczym i diagnostycznym w chorobach nerwów obwodowych, takich jak neuropatia drobnowłóknowa. Co ciekawe, neuropatia małych włókien i złogi nerwowe alfa synukleiny (αSyn) zostały wykazane przez biopsję skóry u pacjentów z chorobą Parkinsona. Rzeczywiście, biopsja skóry ma tę wielką zaletę, że jest łatwo dostępną, minimalnie inwazyjną i bezbolesną procedurą, która umożliwia analizę obwodowej tkanki nerwowej podatnej na patologię. Co więcej, możliwość powtórzenia biopsji skóry w trakcie obserwacji tego samego pacjenta pozwala na badanie podłużnej korelacji z postępem choroby. Opracowaliśmy ustandaryzowany, niezawodny protokół do badania obecności agregatów αSyn we włóknach nerwowych skóry pacjenta z chorobą Parkinsona. Protokół ten obejmuje kilka krótkich etapów fiksacji, cięcie kriotomiczne, a następnie podwójne barwienie immunofluorescencyjne z dwoma specyficznymi przeciwciałami: anty Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) do oznaczania włókien nerwowych skóry i anty 5G4 do wykrywania agregatów αSyn. Jest to wszechstronny, czuły i łatwy do wykonania protokół, który może być również stosowany do celowania w inne białka interesujące nerwy skórne. Możliwość oznaczania agregatów αSyn jest kolejnym krokiem naprzód w kierunku wykorzystania biopsji skóry jako narzędzia do ustalenia przedśmiertnej diagnozy histopatologicznej PD.

Postępując zgodnie z opisaną procedurą (Rysunek 1), wykryliśmy agregaty αSyn, znakowane przeciwciałem 5G4, w skórnych pęczkach nerwowych unerwiających struktury autonomiczne u pacjentów z PD. Morfologia złogów alfa-synukleiny objawia się jako punktowy sygnał wzdłuż aksonów nerwów skórnych (Rysunek 2). Rzeczywiście, stosując ten protokół u 19 pacjentów z PD i 17 osób z grupy kontrolnej w biopsjach skóry w trzech miejscach anatomicznych (szyja, udo i dystalna częś...

Tutaj prezentujemy protokół swobodnego pośredniego testu immunofluorescencyjnego na odcinkach biopsji skóry, który pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby wariantów konformacji alfa synukleiny związanej z chorobą Parkinsona i wielu białek obwodowego układu nerwowego.

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Rozpoznanie choroby Parkinsona nadal opiera się na klinicznych objawach zajęcia motorycznego, które pojawiają się później w przebiegu choroby, kiedy większość neuronów istoty czarnej jest już utracona. Protokół ten umożliwia analizę nerwów skórnych za pomocą biopsji skóry, która stanowi potencjalny nowy biomarker choroby, do wykorzystania w badaniach klinicznych. Biopsja skóry jest łatwą do oceny, nieinwazyjną procedurą, która umożliwia analizę obwodowej tkanki nerwowej, która jest podatna na patologię.Wykrywanie agregatów alfa synukleiny za pomocą biopsji skóry może być wykorzystywane do celów diagnostycznych, prawdopodobnie we wczesnych fazach, kiedy potencjalne wyleczenie jest najbardziej skuteczne. Kontrolne biopsje skóry u tego samego pacjenta pozwalają na analizę czasu i specjalnego przebiegu rozprzestrzeniania się agregatu alfa synukleiny w ludzkim układzie nerwowym. Mogą one rzucić światło na patogenezę choroby.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować nowy roztwór utrwalający PLP, zgodnie z opisem w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Natychmiast po pobraniu biopsji skóry zanurz ją w probówce zawierającej 10 mililitrów roztworu utrwalającego. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia, w dygestorium, delikatnie usuń utrwalacz PLP. W tej samej probówce przemyj biopsję trzy razy przez pięć minut każda, używając pięciu mililitrów 0,1-molowego roztworu Sorensena na każde przemycie. Wyrzuć roztwór Sorensena i dodaj pięć mililitrów roztworu krioprotektantu.Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przechowuj biopsję w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli cięcie kriotomem ma być wykonane w ciągu jednego tygodnia. Najpierw ustaw kriotom na minus 20 stopni Celsjusza.Weź kriomold i napełnij go podłożem do zatapiania w krio. Za pomocą pęsety zanurz biopsję w podłożu do zatapiania krio, tak aby oś podłużna była równoległa do dna krioformy. Zatrzaskowo zamrozić próbkę ciekłym azotem, aby uzyskać stałą kostkę pożywki do zatapiania w krio zawierającą biopsję we właściwej orientacji.Umieść próbkę w kriostacie i odczekaj 30 minut, aby biopsja mogła się zaaklimatyzować. Następnie utrwal próbkę na kriostacie i pokrój na odcinki o długości 50 mikrometrów. Za pomocą małej szczoteczki przenieś kriosekcje na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 mikrolitrów roztworu niezamarzającego w każdym dołku.Następnie przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na początek napełnij niektóre dołki świeżej 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami roztworu myjącego. Przenieść sekcje do analizy z płyty do przechowywania na płytę zawierającą roztwór myjący.Pozostaw skrawki w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś każdą sekcję do pustej studzienki zawierającej ten sam roztwór myjący i powtórz pranie. Następnie dodaj roztwór płuczący do sekcji i przenieś je do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu blokującego.Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie cztery godziny. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, anty-PGP9,5 i anty-5G4, w roztworze roboczym. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia umyj skrawki w studzienkach zawierających roztwór myjący, jak opisano wcześniej. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, kozi anty-królik w celu wykrycia PGP9.5 i kozioł anty-mysz, aby wykryć 5G4 w roztworze roboczym. Umyte skrawki przenieść do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciał wtórnych.Przykryj płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Następnie umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Przenieś umyte odcinki do nowych studzienek zawierających 100 mikrolitrów DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Umyj sekcje dwa razy w roztworze myjącym, jak opisano wcześniej. Następnie zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania. Dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełka i przykryj sekcję szkiełkiem nakrywkowym.Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc. Następnego dnia przechowuj szkiełka w odpowiednim pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uważając, aby uniknąć ekspozycji na światło. Używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, view przekroje.Uchwyć obrazy za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, aby przeanalizować sygnały dodatnie w sekcjach pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału, jak opisano w protokole tekstowym. Zgodnie z opisaną metodą w pęczkach nerwów skórnych unerwiających struktury autonomiczne pacjentów z chorobą Parkinsa wykrywa się agregaty alfa synukleiny znakowane przeciwciałem 5G4.Morfologia złogów alfa synukleiny pojawia się jako kropkowany sygnał wzdłuż aksonów nerwów skórnych. Reprezentatywne zastosowanie tego protokołu u 19 pacjentów z chorobą Parkinsona i 17 osób z grupy kontrolnej w biopsjach skóry w trzech miejscach anatomicznych pokazuje, że 5G4 ma czułość 81% i swoistość 86% w porównaniu ze zdrowymi grupą kontrolną. Fosforylowana alfa synukleina ma czułość 56% i swoistość 100%5G4 i fosforylowane złogi alfa synukleinowo-dodatnie znajdują się głównie wokół gruczołów potowych, ale znajdują się również w mięśniach arrector pilus, małych naczyniach oraz splotach podnaskórkowych i skórnych, ale nigdy we śródnaskórkowych włóknach nerwowych.Ogólnie rzecz biorąc, w świetle gruczołów potowych można zaobserwować niespecyficzny sygnał, który może być błędnie zinterpretowany jako dodatnia 5G4 lub fosforylowana alfa synukleina. Ten typ sygnału jest kropkowany, kulisty i najprawdopodobniej jest spowodowany wewnątrzświetlnym materiałem autofluorescencyjnym, jak wykazano w kontrolach technicznych bez przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Kolokalizacja z PGP9.5, która oznacza włókna nerwowe, które morfologicznie są nitkowate i wydłużone, pomaga zidentyfikować prawidłowy sygnał.W związku z tym specyficzność sygnału 5G4 jest znacznie zwiększona przez podwójne barwienie immunologiczne za pomocą markera aksonalnego. Dokładne utrwalenie biopsji jest niezbędne do uzyskania dobrej jakości barwienia immunofluorescencyjnego i wiarygodnej interpretacji sygnałów fluorescencyjnych. Jeśli utrwalacz nie zostanie prawidłowo przygotowany lub jeśli wystąpiła nadmierna fiksacja, wynikiem będzie wysoka autofluorescencja, która zamaskuje sygnał włókien nerwowych przechodzących przez połączenie skórno-naskórkowe lub unerwie główne struktury skóry właściwej.Najważniejszym etapem tej procedury jest utrwalenie tkanki. Zwróć uwagę na pH roztworu utrwalającego PLP i czas inkubacji, aby uniknąć autofluorescencji i specyficznego sygnału.

targeting-alpha-synuclein-aggregates-cutaneous-peripheral-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dodaj bufor ładujący zawierający detergent, środek redukujący i barwnik śledzący.

Wykrywanie fosforylowanej alfa-synukleiny za pomocą Western Blotting

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny do wykrywania specyficznych dla choroby neurodegeneracyjnej agregatów alfa-synukleiny na odcinkach biopsji skóry. Swobodne barwienie immunologiczne stosuje się do fluorescencyjnego znakowania hydrolazy karboksylowej i agregatów alfa-synukleiny w neuronach skórnych. Pod mikroskopem konfokalnym komórki z fluorescencją obu przeciwciał wskazują na obecność agregatów alfa-synukleiny w neuronach skóry.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania agregatów alfa-synukleiny w sekcji biopsji skóry

Ten film demonstruje immunologiczne barwienie neuronów leczonych agregatami alfa-synukleiny (αS). Neurony są najpierw traktowane agregatami αS. Następnie są one utrwalane, przepuszczalne i traktowane roztworem blokującym. Dodaje się przeciwciała pierwszorzędowe, a następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwienie jądrowe. Próbka jest następnie montowana i obserwowana pod mikroskopem.

Barwienie immunologiczne neuronów traktowanych agregatami alfa-synukleiny

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Poznaj metodę swobodnej immunofluorescencji do wykrywania agregatów alfa synukleiny w skórnych włóknach nerwowych. Technika ta umożliwia wczesną diagnostykę choroby Parkinsona poprzez nieinwazyjną biopsję skóry.

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów