Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Znaczenie tego protokołu polega na zastosowaniu nowego fluorescencyjnego białka UTAG wychwytującego SUMO do wykrywania modyfikatora białka SUMO w różnych komórkach eukariotycznych. Główną zaletą tej techniki jest prosty protokół wykrywania SUMO bez przeciwciał w różnych komórkach, w tym w hodowlach tkankowych ssaków i gonadach nicieni. SUMO odgrywa ważną rolę w nowotworach i zaburzeniach neurodegeneracyjnych, co podkreśla potrzebę solidnych i niezawodnych narzędzi do wykrywania i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych SUMO.

Ponieważ SUMO jest wysoce konserwatywne, fluorescencyjne białko UTAG wychwytujące SUMO może być używane do znakowania sprzężonego SUMO w wielu różnych organizmach. Ten film pokazuje jego zastosowanie w komórkach ssaków. Ponadto w pełnym tekście opisano jego zastosowanie w oocytach nicieni.

Wizualna demonstracja tej techniki dostarcza kluczowych wskazówek dotyczących leczenia komórek przed barwieniem i wykrywaniem SUMO. Na początek hoduj wybrane komórki hodowli tkankowej na 22-milimetrowych okrągłych szkiełkach nakrywkowych w sześciodołkowych płytkach TC, aż do uzyskania 70 do 80% zlewania się. Umyj komórki krótko jednym mililitrem DPBS.

Aby utrwalić komórki, dodaj dwa mililitry świeżego 4% PFA i DPBS do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj utrwalone komórki trzy razy przez pięć minut w jednym mililitrze DPBS, jednocześnie nutując płytkę.

Aby przepuszczalność komórek, inkubować przez 15 minut z 1%Triton X-100 w DPBS. Ponownie umyj komórki, jak poprzednio. Inkubować komórki z 500 mikrolitrami 1 molowej glicyny HCL pH 2 przez 10 sekund.

Następnie natychmiast zneutralizuj pH za pomocą 500 mikrolitrów buforu proteazy 10X SUMO lub SPB. Po umyciu komórek jak poprzednio, usuń szkiełka pokrywy ze studzienki i umieść je w komorze wilgotnościowej. Tylko w przypadku barwienia UTAG-FL należy zmieszać jeden mikrogram UTAG-FL ze 100 mikrolitrami 1X SPB zawierającego pięć milimolowych TCEP w probówce.

Następnie odpipetować mieszaninę na komórki na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę w komorze wilgotnościowej. Aby umyć szkiełka nakrywkowe, odpipetuj 200 mikrolitrów DPBS na każde szkiełko nakrywkowe i pozostaw na miejscu na 10 minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.

Usuń szkiełka nakrywkowe z ostatniego prania i odwróć na wstępnie oczyszczone szkiełko mikroskopowe z kroplą podłoża montażowego. Przechowuj próbki przez noc w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza przed obejrzeniem pod mikroskopem. Wizualizuj komórki przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI i Texas Red.

Zapoznaj się z pełnym tekstem, aby zapoznać się z protokołem oznaczania SUMO i utrwalonych gonad nicieni. Podczas gdy znakowanie komórek ssaków jest dość proste, znakowanie oocytów nicieni wymaga wcześniejszego przeszkolenia w zakresie sekcji gonad. KmUTAG-FL inkubowany ze stałymi komórkami PMT2 wykazywał wyraźne barwienie jądrowe.

Widoczne było zarówno rozproszone zabarwienie jądrowe, jak i wyraźne ogniska jądrowe. Lokalizację jądrową potwierdzono za pomocą współbarwienia z DAPI. Zgodnie z aktywnością pułapkowania SUMO KmUTAG-FL, wzorzec lokalizacji jądrowej przypominał barwienie SUMO23.

Barwienie współprzeciwciałem anty-SUMO23 8A2 potwierdziło kolokalizację KmUTAG-FL z sygnałem SUMO23. Potwierdza to skuteczność KmUTAG-FL w wykrywaniu SUMO23 w komórkach ssaków. Izolowane gonady z dorosłego hermafrodyty wytwarzającego oocyty c.

Nicienie elegans oznaczono przeciwciałem anty-SUMO. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, przeciwciało anty-SUMO początkowo zlokalizowane było w plazmie jądrowej późnych oocytów miotycznych profazy. Następnie redystrybuował się do centralnego kompleksu pierścieniowego sparowanych homologów, gdy otoczka jądrowa rozpadła się, a chromosomy skierowały się w stronę płytki metafazowej.

W równoległych preparatach gonady oznaczone KmUTAG-FL wykazały podobne wzorce. KmUTAG-FL przeszedł od znakowania nukleoplazmy do koncentrowania się na kompleksie pierścieniowym, gdy oocyty rozpoczęły i zakończyły proces rozpadu otoczki jądrowej. Wyniki te potwierdzają, że KmUTAG-FL jest użytecznym narzędziem do analizy miozy i procesów związanych z SUMO w ok.

elegans i ewentualnie inne nicienie. Podczas wykonywania utrwalania bardzo ważne jest, aby używać świeżego paraformaldehydu i krótkiego czasu utrwalania, aby SUMO było natywnie złożone, aby mogło zostać rozpoznane przez KmUTAG. Ponieważ trzeciorzędowa struktura SUMO jest wysoce konserwatywna, jest bardzo prawdopodobne, że warianty SUMO z dodatkowych systemów modelowych i niemodelowych mogą być analizowane za pomocą odczynnika KmUTAG-FL.

Obecnie używamy tego nowatorskiego fluorescencyjnego białka UTAG wychwytującego SUMO do badania funkcji SUMO podczas stresu komórkowego. Na koniec należy pamiętać, że wszystkie czynności związane z użyciem utrwalacza paraformaldehydu powinny być wykonywane w laboratoryjnym kapturze ochronnym, a odczynnik ten należy odpowiednio zutylizować.