Name: Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę wykrywania białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnego białka pułapkującego kmUTAG w komórkach ssaków i nicieni. Ta technika umożliwia wizualizację bez użycia przeciwciał, co jest kluczowe w badaniach nad rakiem i chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Kerschera za wsparcie, Nathalie Nguyen za krytyczne przeczytanie manuskryptu i Lidii Epp za sekwencjonowanie. Praca ta była wspierana przez fundusz komercjalizacji Commonwealth Research MF16-034-LS dla OK. Wsparcie badawcze dla studentów W&M zostało zapewnione przez fundusz Bavery Huston Research oraz stypendia Charles Center Honors dla RY i CH.

1. Wykrywanie SUMO w stałych komórkach hodowli tkankowej przy użyciu rekombinowanego białka pułapkującego KmUTAG-FL SUMO
<ol>
	<li>Hoduj wybrane komórki hodowli tkankowej na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 22 mm w 6-dołkowych płytkach TC, aż do uzyskania 70%–80% zlewu. Wykonaj kroki 1.2–1.8 na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Krótko umyć komórki 1 ml DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco)</li>
	<li>Do utrwalenia należy przygotować świeży roztwór 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) (rozcieńczony w DPBS). Aby utrwalić komórki, dodaj 2 ml 4% PFA w DPBS do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Wszystkie czynności związane z użyciem PFA należy wykonywać w laboratoryjnym kapturze ochronnym, a PFA należy odpowiednio zutylizować.</li>
	<li>Umyj utrwalone komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, 5 minut przy każdym myciu.</li>
	<li>Aby przepuszczalność komórek, inkubować przez 15 minut z 0,1% Triton X-100 w DPBS</li>
	<li>Umyj komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, po 5 minut każde mycie</li>
	<li>Inkubować komórki z 500 μl 0,1 M Glycine-HCL (pH 2,0) przez 10 s, a następnie natychmiast zneutralizować pH za pomocą 500 μL 10x buforu proteazy SUMO (SPB).</li>
	<li>Umyj komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, 5 min każde mycie</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienki i umieść je w komorze wilgotnościowej. Następnie należy przystąpić do inkubacji na szkiełku nakrywkowym w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Tylko do barwienia UTAG-fl: zmieszać 1 μg UTAG-fl ze 100 μl 1x SPB zawierającego 5 mM TCEP w probówce, odpipetować mieszaninę na komórki na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w komorze wilgotnościowej.</li>
		<li>Opcjonalnie, w przypadku współbarwienia przeciwciałami UTAG-FL i anty SUMO1, należy wykonać następujące czynności:
		<ol>
			<li>Wymieszać w probówce 1 μg UTAG-FL i 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (otrzymane do badań rozwojowych Hybridoma Bank9) ze 100 μl buforu blokującego, pipetować mieszaninę na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
			<li>Umyj komórki na szkiełku nakrywkowym 3 razy 200 μl DPBS, po 5 minut każde mycie.</li>
			<li>Wymieszać w probówce 0,5 μl sprzężonego przeciwciała przeciw myszom Alexa Fluor 488 ze 100 μl buforem blokującym, odpipetować mieszaninę na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby umyć szkiełka nakrywkowe, odpipetuj 200 μl DPBS na każde szkiełko nakrywkowe i pozostaw na miejscu na 10 minut. Powtórz pranie jeszcze 2 razy.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe z ostatniego prania i odwróć je na wstępnie oczyszczone szkiełko mikroskopowe z kroplą podłoża mocującego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przechowywać przez noc w zamrażarce w temperaturze -20°C przed obejrzeniem pod mikroskopem. Wizualizacja przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) i Alexa Fluor 488 (jeśli wykonywane jest opcjonalne współbarwienie SUMO2/3).</li>
</ol>
2. Wykrywanie SUMO w stałych gonadach nicieni za pomocą UTAG-fl
<ol>
	<li>Przenieś dorosłe hermafrodyty do kropli 8 μl bufora jajowego14 na dodatnio naładowanym szkiełku, które zostało pokryte poli-L-lizyną. Uwolnij gonady z robaków za pomocą igieł 27,5 G. Kontynuuj znakowanie przeciwciałami lub znakowanie UTAG-fl.</li>
	<li>W przypadku próbek znakowanych przeciwciałami należy postępować w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie, a następnie utrwalić przez noc w metanolu o temperaturze -20 °C w słoiku z koplinu.</li>
		<li>Również w słoikach Coplin umyj szkiełka 3 razy w 1x PBS, a następnie zablokuj na 20 minut w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,1% Tween 20.</li>
		<li>Dodać 30 μl przeciwciała anty-SUMO 6F2 (1:10) do każdego szkiełka pokrywającego próbki. Inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: SUMO 6F2 uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank15.</li>
		<li>W słoikach Coplin myć szkiełka przez 2 minuty w 1x PBS, a następnie przykryć i inkubować próbki z 30 μl koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom DyLight 488 (1:200) przez 1,5 godziny w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W słoikach Coplin myć szkiełka przez 2 minuty w 1x PBS, wykonać szybkie zanurzenie w dH20, a następnie zamontować szkiełka z medium montażowym (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku etykietowania KmUTAG-fl należy postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami:
	<ol>
		<li>Aby utrwalić komórki, dodaj 1 objętość 8% PF do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PF. Utrwalaj przez 10 minut w komorze wilgotnościowej, a następnie wygaszaj reakcję, przenosząc szkiełka do słoika Coplin zawierającego 1x PBS z 0,1 M glicyną przez co najmniej 5 minut.</li>
		<li>W słoikach Coplin myć komórki przez 5 minut w 1x PBS, a następnie przepuszczać próbki w 1x PBS zawierającym 0,1% Triton-X przez 10 minut.</li>
		<li>Myć w słoiku Coplin przez co najmniej 5 minut w 1x PBS, a następnie dodać 200 μl 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) do próbek na szkiełku przez 10 sekund. Natychmiast dodaj 200 μl 10x SPB, aby zneutralizować pH.</li>
		<li>Myj szkiełko w 1x PBS w słoiku Coplin przez 5 minut.</li>
		<li>Wyjmij szkiełko z płukania i odpipetuj 100 μL 1x SPB + 5mM TCEP zawierającego 2 μg UTAG-fl do nicieni na szkiełkach i inkubuj w komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę bez kołysania.</li>
		<li>Włóż szkiełko z powrotem do słoika Coplin i myj przez 15 minut w 1x PBS</li>
		<li>Wyjmij szkiełko z pralni, użyj chusteczki laboratoryjnej do wysuszenia wokół próbki, a następnie zamontuj szkiełka za pomocą 5 μl medium montażowego (patrz tabela materiałów). Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C. Wizualizuj za pomocą odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) i DyLight 488 (SUMO2/3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li>
<li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerscher%2C+O+%22SUMOylation%22">SUMOylation</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li>
<li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+%CE%B2-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li>
<li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2%2F3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+Blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+News%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li>
<li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li>
<li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).</li>
<li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769(2014).</li>
<li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive%2C+real-time+assays+of+helicase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li>
<li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF165%29.+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li>
<li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2%2F3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+%28Adhiron%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).</li>
<li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affimer+proteins+for+F-actin%3A+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).</li>
<li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li>
</ol>

Rekombinowane odczynniki kmUTAG są dostarczane społeczności naukowej za pośrednictwem Kerafast.com.

W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie kmUTAG-fl, białka rekombinowanego, do badań funkcjonalnych SUMO w utrwalonych komórkach ssaków i wypreparowanych gonadach nicieni. KmUTAG-fl to odporny na stres odczynnik specyficzny dla pan-SUMO, który rozpoznaje i wychwytuje natywne białka sprzężone z SUMO i łańcuchy SUMO. Ponieważ trzeciorzędowa struktura SUMO jest wysoce konserwatywna, jest bardzo prawdopodobne, że warianty SUMO z dodatkowych systemów modelowych i niemodelowych mogą być analizowane za pomocą odczynnika kmUTAG-...

Celem tej metody jest ułatwienie badania i analizy białek sprzężonych z SUMO za pomocą rekombinowanego białka UTAG (Ulp domain Tag). Jak opisano poniżej, UTAG może być stosowany zamiast innych odczynników i podejść do oczyszczania, wykrywania i wizualizacji białek modyfikowanych przez SUMO. W zależności od warunków wzrostu, komórki mogą zawierać setki lub tysiące białek, które są modyfikowane za pomocą łańcuchów SUMO lub SUMO (przegląd patrz Kerscher et al. 20061 i Kerscher 20162). Stanowi to znaczną trudność dla analiz funkcjonalnych określonych białek modyfikowanych SUMO, zwłaszcza że tylko część określonego celu sumoilacji jest faktycznie modyfikowana3. Oprócz ich ról w podstawowych procesach komórkowych, takich jak regulacja transkrypcji, homeostaza białek, odpowiedź na stres komórkowy i przebudowa chromatyny podczas mitozy i mejozy; teraz stało się wystarczająco jasne, że SUMO, białka modyfikowane SUMO i komponenty szlaku SUMO mają również potencjał jako biomarkery patologii, takich jak rak i zaburzenia neurodegeneracyjne4,5,6,7. Podkreśla to potrzebę solidnych, niezawodnych i łatwo dostępnych narzędzi oraz innowacyjnych podejść do wykrywania i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych metodą SUMO w różnych komórkach i próbkach.
W wielu systemach, przeciwciała specyficzne dla SUMO są odczynnikami z wyboru do wykrywania, izolacji i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych przez SUMO8,9. Jednak niektóre komercyjnie dostępne przeciwciała specyficzne dla SUMO są drogie, ograniczone pod względem ilości lub dostępności, podatne na wykazywanie bardzo zmiennego powinowactwa i reaktywności krzyżowej, a w niektórych przypadkach brakuje im odtwarzalności10. Jednym z alternatywnych podejść jest ekspresja SUMO znakowanego epitopem w transformowanych komórkach i organizmach, ale powiązanie znaczników epitopów z SUMO może sztucznie obniżyć jego koniugację z celami białkowymi11. Ponadto epitopy nie są przydatne, gdy oceniane są nieprzekształcone komórki lub tkanki.
Ulp1 to konserwatywna proteaza SUMO z S. cerevisiae, która zarówno przetwarza prekursor SUMO, jak i desumoiluje białka sprzężone z SUMO12. Opracowaliśmy odczynnik UTAG w oparciu o przypadkową obserwację, że mutacja katalitycznej cysteiny (C580S) w przetwarzaniu SUMO Ulp domain (UD) Ulp1 nie tylko zapobiega rozszczepieniu SUMO, ale także wychwytuje białka sprzężone z SUMO o wysokiej awidności12. Dla uproszczenia odnieśliśmy się do tego karboksylowo-końcowego fragmentu Ulp1 (C580S) pułapkującego SUMO jako UTAG (skrót od UD TAG). UTAG jest rekombinowanym białkiem pułapkującym pan-SUMO, które stanowi użyteczną alternatywę dla przeciwciał anty-SUMO stosowanych do izolacji i wykrywania białek modyfikowanych SUMO. Co ważne, w szczególności rozpoznaje natywnie złożone, sprzężone SUMO, a nie tylko jeden lub kilka epitopów na SUMO. Aby poprawić zarówno stabilność białka, jak i siłę wiązania SUMO UTAG, wygenerowaliśmy wariant UTAG z odpornych na stres drożdży Kluyveromyces marxianus (Km). KmUTAG ściśle wiąże koniugaty SUMO o powinowactwie nanomolowym13. Dodatkowo kmUTAG jest odporny na podwyższone temperatury (42 °C), czynniki redukujące (5 mM TCEP - chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny), denaturanty (do 2 M mocznika), utleniacze (0,6% nadtlenku wodoru) i detergenty niejonowe. Ta tolerancja na stres jest korzystna podczas trudnych warunków oczyszczania i wydłużonego czasu inkubacji, zapewniając jej stabilność i aktywność pułapkowania SUMO. Nic dziwnego jednak, że aktywność wychwytywania SUMO przez KmUTAG jest niekompatybilna z odczynnikami modyfikującymi cysteinę, detergentami jonowymi i całkowicie zdenaturowanymi ekstraktami białkowymi. Niezwykłe powinowactwo i właściwości KmUTAG wskazują, że odczynnik ten może stać się częścią standardowego repertuaru do badania sumoilowanych białek u wielu gatunków.
Tutaj oferujemy prostą metodę wykrywania białek modyfikowanych przez SUMO w komórkach ssaków i nicieni za pomocą rekombinowanego fluorescencyjnego białka fuzyjnego mCherry-KmUTAG (kmUTAG-fl).

<table><tbody><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003</td><td>Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla mysiego przeciwciała monoklonalnego</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, nie magnez</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 sprzężony AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-485-146</td><td>Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla mysiego przeciwciała monoklonalnego</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass do okularów nakrywkowych</td><td>Fisherbrand</td><td>12545101</td><td></td></tr><tr><td>FLUORO-GEL II z DAPI</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>50-246-93)</td><td>Nośnik montażowy w kroku 1.11</td></tr><tr><td>FLUORO-GEL z DABCO</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-02</td><td>Z DAPI dodanym do 1 &micro; g/ml; media montażowe w kroku 2.2.5</td></tr><tr><td>Glicyna-HCl</td><td>Odczynniki</td> biologiczne Fisher <td>BP3815</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna-HCl</td><td>ACROS Organics</td><td>6000-43-7</td><td></td></tr><tr><td>KmUTAG-fl</td><td>Odczynniki Kerafast</td><td></td><td>KmUTAG są dostępne na Kerafast.com</td></tr><tr><td>bufor blokujący Oneblock Western-CL</td><td>Prometheus</td><td>20-313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X roztwór</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>PNT2 linia komórkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613</td><td>Normalny nabłonek prostaty unieśmiertelniony SV40.</td></tr><tr><td>pSPOT1</td><td>(ChromoTek GmbH)</td><td>ev-1</td><td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td></tr><tr><td>SUMO 6F2</td><td>DSHB</td><td>SUMO 6F2</td><td>SUMO 6F2 został zdeponowany w DSHB przez Pelisch, F. / Hay, RT (dshb Hybridoma Product SUMO 6F2)</td></tr><tr><td>Bufor proteazy SUMO [10x]</td><td></td><td></td><td>500 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2% NP-40, 1,5 M NaCl</td></tr><tr><td>SUMO-2 Przeciwciało 8A2</td><td>DSHB</td><td>SUMO-2 8A2</td><td>SUMO-2 8A2 został zdeponowany w DSHB przez Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td></tr><tr><td>TCEP-HCL</td><td>GoldBio</td><td>51805-45-9</td><td>Stosowany jako środek redukujący w stężeniu 5mM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>9002-93-1</td><td>Używany do permeablacji w stężeniu 0,1% w DPBS/PBS (dla robaków)</td></tr></tbody></table>

lokalizacja białek modyfikowanych sumo za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Tutaj prezentujemy nową metodę badania sumoilacji białek i ich subkomórkowej lokalizacji w komórkach ssaków i oocytach nicieni. Metoda ta wykorzystuje rekombinowany zmodyfikowany fragment białka pułapkującego SUMO, kmUTAG, pochodzący z proteazy Ulp1 SUMO odpornych na stres pączkujących drożdży Kluyveromyces marxianus. Dostosowaliśmy właściwości kmUTAG do celów badania sumoilacji w różnych układach modelowych bez użycia przeciwciał. W przypadku badania SUMO, KmUTAG ma kilka zalet w porównaniu z podejściami opartymi na przeciwciałach. Ten odporny na stres odczynnik wychwytujący SUMO jest wytwarzany rekombinacyjnie, rozpoznaje natywne izoformy SUMO z wielu gatunków i w przeciwieństwie do komercyjnie dostępnych przeciwciał wykazuje zmniejszone powinowactwo do wolnego, niesprzężonego SUMO. Przedstawione tu reprezentatywne wyniki obejmują lokalizację koniugatów SUMO w komórkach hodowli tkankowych ssaków i oocytach nicieni.

KmUTAG-fl jest rekombinowanym białkiem pułapkującym SUMO, znakowanym mCherry. Aby wytworzyć kmUTAG-fl, sklonowano zoptymalizowany kodonowo mCherry-kmUTAG do bakteryjnego plazmidu nadekspresyjnego pSPOT1 (Rycina 1). Po indukcji białko kmUTAG-fl zostało oczyszczone na Spot-TRAP, eluowane i zamrożone do czasu dalszego użycia. Aby potwierdzić aktywność pułapkującą SUMO białka KmUTAG-fl, zweryfikowano jego wiązanie z koralkami sprzężonymi z SUMO1 oraz precypitację...

SUMO to niezbędne i wysoce konserwatywne, małe białko modyfikujące podobne do ubikwityny. W tym protokole opisujemy zastosowanie odpornego na stres rekombinowanego białka pułapkującego SUMO (kmUTAG) do wizualizacji natywnych, nieoznakowanych koniugatów SUMO i ich lokalizacji w różnych typach komórek.

Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Znaczenie tego protokołu polega na zastosowaniu nowego fluorescencyjnego białka UTAG wychwytującego SUMO do wykrywania modyfikatora białka SUMO w różnych komórkach eukariotycznych. Główną zaletą tej techniki jest prosty protokół wykrywania SUMO bez przeciwciał w różnych komórkach, w tym w hodowlach tkankowych ssaków i gonadach nicieni. SUMO odgrywa ważną rolę w nowotworach i zaburzeniach neurodegeneracyjnych, co podkreśla potrzebę solidnych i niezawodnych narzędzi do wykrywania i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych SUMO.Ponieważ SUMO jest wysoce konserwatywne, fluorescencyjne białko UTAG wychwytujące SUMO może być używane do znakowania sprzężonego SUMO w wielu różnych organizmach. Ten film pokazuje jego zastosowanie w komórkach ssaków. Ponadto w pełnym tekście opisano jego zastosowanie w oocytach nicieni.Wizualna demonstracja tej techniki dostarcza kluczowych wskazówek dotyczących leczenia komórek przed barwieniem i wykrywaniem SUMO. Na początek hoduj wybrane komórki hodowli tkankowej na 22-milimetrowych okrągłych szkiełkach nakrywkowych w sześciodołkowych płytkach TC, aż do uzyskania 70 do 80% zlewania się. Umyj komórki krótko jednym mililitrem DPBS.Aby utrwalić komórki, dodaj dwa mililitry świeżego 4% PFA i DPBS do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj utrwalone komórki trzy razy przez pięć minut w jednym mililitrze DPBS, jednocześnie nutując płytkę.Aby przepuszczalność komórek, inkubować przez 15 minut z 1%Triton X-100 w DPBS. Ponownie umyj komórki, jak poprzednio. Inkubować komórki z 500 mikrolitrami 1 molowej glicyny HCL pH 2 przez 10 sekund.Następnie natychmiast zneutralizuj pH za pomocą 500 mikrolitrów buforu proteazy 10X SUMO lub SPB. Po umyciu komórek jak poprzednio, usuń szkiełka pokrywy ze studzienki i umieść je w komorze wilgotnościowej. Tylko w przypadku barwienia UTAG-FL należy zmieszać jeden mikrogram UTAG-FL ze 100 mikrolitrami 1X SPB zawierającego pięć milimolowych TCEP w probówce.Następnie odpipetować mieszaninę na komórki na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę w komorze wilgotnościowej. Aby umyć szkiełka nakrywkowe, odpipetuj 200 mikrolitrów DPBS na każde szkiełko nakrywkowe i pozostaw na miejscu na 10 minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.Usuń szkiełka nakrywkowe z ostatniego prania i odwróć na wstępnie oczyszczone szkiełko mikroskopowe z kroplą podłoża montażowego. Przechowuj próbki przez noc w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza przed obejrzeniem pod mikroskopem. Wizualizuj komórki przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI i Texas Red.Zapoznaj się z pełnym tekstem, aby zapoznać się z protokołem oznaczania SUMO i utrwalonych gonad nicieni. Podczas gdy znakowanie komórek ssaków jest dość proste, znakowanie oocytów nicieni wymaga wcześniejszego przeszkolenia w zakresie sekcji gonad. KmUTAG-FL inkubowany ze stałymi komórkami PMT2 wykazywał wyraźne barwienie jądrowe.Widoczne było zarówno rozproszone zabarwienie jądrowe, jak i wyraźne ogniska jądrowe. Lokalizację jądrową potwierdzono za pomocą współbarwienia z DAPI. Zgodnie z aktywnością pułapkowania SUMO KmUTAG-FL, wzorzec lokalizacji jądrowej przypominał barwienie SUMO23.Barwienie współprzeciwciałem anty-SUMO23 8A2 potwierdziło kolokalizację KmUTAG-FL z sygnałem SUMO23. Potwierdza to skuteczność KmUTAG-FL w wykrywaniu SUMO23 w komórkach ssaków. Izolowane gonady z dorosłego hermafrodyty wytwarzającego oocyty c.Nicienie elegans oznaczono przeciwciałem anty-SUMO. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, przeciwciało anty-SUMO początkowo zlokalizowane było w plazmie jądrowej późnych oocytów miotycznych profazy. Następnie redystrybuował się do centralnego kompleksu pierścieniowego sparowanych homologów, gdy otoczka jądrowa rozpadła się, a chromosomy skierowały się w stronę płytki metafazowej.W równoległych preparatach gonady oznaczone KmUTAG-FL wykazały podobne wzorce. KmUTAG-FL przeszedł od znakowania nukleoplazmy do koncentrowania się na kompleksie pierścieniowym, gdy oocyty rozpoczęły i zakończyły proces rozpadu otoczki jądrowej. Wyniki te potwierdzają, że KmUTAG-FL jest użytecznym narzędziem do analizy miozy i procesów związanych z SUMO w ok.elegans i ewentualnie inne nicienie. Podczas wykonywania utrwalania bardzo ważne jest, aby używać świeżego paraformaldehydu i krótkiego czasu utrwalania, aby SUMO było natywnie złożone, aby mogło zostać rozpoznane przez KmUTAG. Ponieważ trzeciorzędowa struktura SUMO jest wysoce konserwatywna, jest bardzo prawdopodobne, że warianty SUMO z dodatkowych systemów modelowych i niemodelowych mogą być analizowane za pomocą odczynnika KmUTAG-FL.Obecnie używamy tego nowatorskiego fluorescencyjnego białka UTAG wychwytującego SUMO do badania funkcji SUMO podczas stresu komórkowego. Na koniec należy pamiętać, że wszystkie czynności związane z użyciem utrwalacza paraformaldehydu powinny być wykonywane w laboratoryjnym kapturze ochronnym, a odczynnik ten należy odpowiednio zutylizować.

localization-sumo-modified-proteins-using-fluorescent-sumo-trapping

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być stosowane z różnymi substratami w wielu dalszych zastosowaniach bez konieczności ponownego klonowania.

Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Precyzyjna lokalizacja mieszkańców Golgi jest kluczowa dla zrozumienia funkcji komórkowych Golgiego. Jednak konwencjonalna mikroskopia optyczna nie jest w stanie rozstrzygnąć struktury sub-Golgiego. Tutaj opisujemy protokół dla konwencjonalnej metody superrozdzielczości opartej na mikroskopii, mającej na celu ilościowe określenie sub-Golgiego lokalizacji białka.

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Małe modyfikatory związane z ubikwityną (SUMO) białka są sprzężone z resztami lizyny docelowych białek w celu regulacji różnych procesów komórkowych. W pracy opisano protokół wykrywania SUMOylacji białka siatkówczaka (Rb) w warunkach endogennych i egzogennych w komórkach ludzkich.

In vivo (in vivo) Wykrywanie i analiza sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania, izolowania, identyfikowania i charakteryzowania białek modyfikowanych przez SUMO in vivo, zarówno z ludzkich komórek wątroby, jak i guzów wątroby uzyskanych z mysich modeli raka wątrobowokomórkowego przy użyciu jednostek wiążących SUMO (SUBEs).

Jednostki wiążące SUMO (SUBE) jako narzędzia do wzbogacania, izolacji, identyfikacji i charakterystyki proteomu SUMO w raku wątroby

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Poznaj metodę wykrywania białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnego białka pułapkującego kmUTAG w komórkach ssaków i nicieni. Ta technika umożliwia wizualizację bez użycia przeciwciał, co jest kluczowe w badaniach nad rakiem i chorobami neurodegeneracyjnymi.

Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Przeglądaj więcej filmów