Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM
March 16th, 2020
Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.
Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek umożliwia nam pomiar parametrów fizycznych, które opisują właściwości mechaniczne i adhezyjne polimerów. W przypadku korzystania ze spektroskopii sił opartej na AFM do badania pojedynczych cząsteczek, niezbędne jest posiadanie niezawodnego i wydajnego protokołu kowalencyjnego wiązania tych cząsteczek z końcówką wspornikową AFM. Protokół ten można zastosować do wielu różnych polimerów, niezależnie od długości konturu czy hydrofobowości.
Wszystkie czynności należy wykonywać w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane jest szkło odporne na rozpuszczalniki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Najpierw użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej.
Uruchom program aktywacji powierzchni komory plazmowej, wybierając start, a następnie tak. Sprawdź, czy proces plazmowy działa prawidłowo. Proces plazmowy o wysokiej zawartości tlenu ma jasnoniebieski kolor.
Podczas wykonywania programu aktywacji powierzchniowej rozpuść silan-PEG-mal w toluenie, aby uzyskać stężenie 1,25 miligrama na mililitr. Umieść trzy mililitry roztworu na płaskiej szalce Petriego. Po zakończeniu procesu plazmowego przewietrz komorę plazmową, wybierając opcję potwierdź, a następnie odpowietrzaj.
Przejdź natychmiast do następnego kroku, aby zapobiec wchłanianiu zanieczyszczeń. Umieść frytki na szalce Petriego i inkubuj je przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i pozwól jej ostygnąć przez co najmniej 10 minut.
Następnie opłucz frytki. W przypadku wiązania PEG lub polistyrenu należy trzykrotnie spłukać wióry toluenem. W przypadku wiązania polinipamu wióry należy przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.
Aby zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM, podczas płukania należy lekko przechylić wióry. Wióry wspornikowe AFM muszą być odpowiednio wypłukane, aby usunąć nadmiar polimerów fizycznych, które mogą mieć wpływ na eksperyment. Płukanie należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu wsporników AFM.
Na koniec przygotuj co najmniej dwa wióry, które będą służyć jako kontrole, które nie będą poddawane kowalencyjnemu przyłączeniu polimerowemu. W przypadku kontroli w porównaniu z wiórami PEG i polistyrenu spłucz dwukrotnie etanolem i raz wodą. W przypadku kontroli w porównaniu z chipsami z polinipamu, spłucz dwukrotnie wodą.
Aby wykonać kowalencyjne mocowanie PEG lub polistyrenu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w toluenie o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj chipsy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji z PEG lub polistyrenem pozwól frytkom ostygnąć przez 10 minut.
Wióry opłucz dwukrotnie toluenem, dwa razy etanolem i raz wodą. Aby wykonać kowalencyjne przyłączenie polinipamu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w etanolu o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj frytki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.
Po inkubacji z polinipamem spłucz frytki dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą. Aby przechowywać chipsy do czasu wykorzystania w eksperymencie, umieść każdy chips osobno na mililitrowej szalce Petriego wypełnionej wodą. Utrzymuj szalki Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Najpierw włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do uchwytu na wióry. Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiarów w cieczy. Użyj pipety, aby zanurzyć chip w wodzie.
Zamontuj powierzchnię próbki w AFM. Zanurz powierzchnię próbki w wodzie. Podłącz uchwyt na wióry do AFM.
Następnie zbliż chip do powierzchni próbki. Użyj panelu środowiskowego, aby ustawić temperaturę docelową i włączyć przyciski opcji trybu i sprzężenia zwrotnego. Następnie pozwól systemowi zrównoważyć się przez około 15 minut.
Aby wykonać krzywą wydłużenia siły, zbliż końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybierz pojedynczą siłę. Wynikowa krzywa przedstawia ugięcie w stosunku do odległości piezoelektrycznej z podejściem do powierzchni pokazanym na czerwono i wycofaniem pokazanym na niebiesko. Rozszerz część krzywej, która reprezentuje wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem.
Aby wykonać dopasowanie liniowe, ustaw kursory na krzywej podejścia lub krzywej cofania i wybierz opcję Aktualizuj INVOLS z menu kontekstowego. Wynikowa wartość odwrotnej czułości dźwigni optycznej jest wyświetlana w panelu w lewym górnym rogu. Po powtórzeniu tej procedury co najmniej pięć razy oblicz średnią dla odwrotnej czułości dźwigni optycznej i wprowadź średnią w panelu.
Ustaw wspornik AFM na wysokości około 100 mikrometrów nad powierzchnią, wybierając ruch, aby wstępnie włączyć. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu dla widma szumu termicznego, ustaw liczbę uśredniania na co najmniej 10 i wybierz najwyższą możliwą rozdzielczość częstotliwości. Następnie zarejestruj widmo szumu termicznego, wybierając opcję przechwytywania danych termicznych.
Aby dopasować widmo szumu termicznego do prostej funkcji oscylatora harmonicznego, rozwiń część krzywej reprezentującą pierwszy pik rezonansowy. Następnie wybierz opcję Zainicjuj dopasowanie. Na koniec doprecyzuj dopasowanie za pomocą przycisku danych termicznych dopasowania.
Odpowiednia stała siły pojawi się w panelu. Aby rozpocząć zbieranie danych, ustaw parametry eksperymentu. Ustaw prędkość ciągnięcia na jeden mikrometr na sekundę i wymuś spust na jeden nanoniuton.
Zbliżyć końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybrać pojedynczą siłę, aby zarejestrować pojedynczą krzywą i określić, czy parametry należy dostosować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wybierz mapę F z panelu głównego. Aby uzyskać mapę sił ze 100 krzywymi, należy ustawić liczbę punktów sił i linii sił na 10.
Rozpocznij nagrywanie mapy siły, wybierając opcję do mapy F. Weź krzywe wydłużenia siły w sposób przypominający siatkę, aby uniknąć lokalnych efektów powierzchni i uśrednić różne obszary powierzchni. Po doświadczeniu powtórz wyznaczanie odwrotnej czułości dźwigni optycznej i stałej sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.
Pojedyncze polimery polinipamu i PEG zostały kowalencyjnie związane z końcówką wspornika AFM na jednym końcu i fizjosorbowane na powierzchni dwutlenku krzemu na drugim końcu. Aby zmierzyć rozciąganie zależne od temperatury, zidentyfikowano wyraźne zdarzenie rozciągania pojedynczej cząsteczki, po którym następuje końcowe maksimum na końcu odpowiedniej krzywej wydłużenia siły. Następnie generowana była jedna krzywa wzorcowa dla każdej temperatury.
W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku polinipamu zaobserwowano odwrotną tendencję. Desorpcja polistyrenu z powierzchni SAM w wodzie może być wykorzystana do określenia siły i długości desorpcji.
Gdy mocowanie polimeru zakończyło się sukcesem, krzywe wydłużenia siły wykazywały plateau stałej siły. Każdy plateau został wyposażony w krzywą sigmoidalną w celu określenia siły desorpcji i długości desorpcji. Obserwowane siły desorpcji odpowiadały wcześniej uzyskanym wartościom.
Gdy więcej niż jeden polimer był przymocowany do końcówki wspornika AFM, zaobserwowano kaskady płaskowyżów na krzywych wydłużenia siły. Po przyłączeniu dwóch polimerów stwierdzono rozkład bimodalny dla długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. Funkcjonalizowana końcówka wspornikowa AFM może być używana do ilościowego określania odpowiedzi siłowej pojedynczych cząsteczek w środowisku ciekłym i przy bodźcach zewnętrznych.
Stosowanie czystego sprzętu, rozpuszczalników, końcówek wysięgników AFM i wielokrotne płukanie jest bardzo ważne dla osiągnięcia wysokiego poziomu czystości, który powinien zostać potwierdzony przed opisanymi kontrolowanymi eksperymentami. Zaprezentowane protokoły i procedury utorowały drogę do lepszego zrozumienia systemów polimerowych reagujących na bodźce. Wyniki można bezpośrednio porównać z symulacjami dynamiki molekularnej.
Przegląd
Ten artykuł omawia protokół kowalentnego przymocowania cząsteczek sond do końcówek wahaczy mikroskopu sił atomowych (AFM), co jest kluczowe dla badania właściwości fizycznych polimerów. Metoda ta pozwala na pomiar sił rozciągających, sił desorpcyjnych i długości polimerów z dużą powtarzalnością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Nauki o polimerach
Tło
- Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek jest niezbędna do pomiaru właściwości mechanicznych polimerów.
- Niezawodne protokoły kowalentnego wiązania z wahaczami AFM są niezbędne do dokładnych pomiarów.
- Środki ostrożności są kluczowe podczas obsługi organicznych rozpuszczalników.
- Właściwe techniki płukania są niezbędne, aby uniknąć skażenia.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół kowalentnego przymocowania polimerów do wahaczy AFM.
- Zapewnić powtarzalność w pomiarach właściwości fizycznych polimerów.
- Ułatwić badania różnych polimerów niezależnie od ich cech.
Zastosowane metody
- Aktywacja powierzchni wahaczy AFM za pomocą komory plazmowej.
- Przygotowanie roztworów polimerów do kowalentnego wiązania.
- Protokoły inkubacji i płukania, aby zapewnić prawidłowe wiązanie.
- Pomiar krzywych rozciągania sił za pomocą AFM.
Główne wyniki
- Udane kowalentne przymocowanie PEG, polistyrenu i polinipamu do wahaczy AFM.
- Wykazana powtarzalność w pomiarach sił.
- Dostarczono kompleksową metodę przygotowywania i używania funkcjonalnych wahaczy AFM.
- Podkreślono znaczenie płukania i kontroli wahaczy w eksperymentach.
Wnioski
- Protokół umożliwia niezawodne badania właściwości polimerów za pomocą AFM.
- Właściwa przygotowanie i obsługa są kluczowe dla udanych eksperymentów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne typy i konfiguracje polimerów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Covalent single-molecule attachment enables reproducible force spectroscopy measurements critical for de-risking polymer-based therapeutic candidates. This approach provides quantitative mechanical and adhesive data that supports target validation and lead identification in stimuli-responsive drug delivery systems. By establishing reliable single-molecule benchmarks, the method enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-surface interactions to clarify binding mechanisms and functional target relevance.
- Operational Value: Provides hundreds of force-extension traces from a single molecule, reducing experimental variability and increasing data robustness.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying stretching and desorption forces under controlled stimuli, informing structure-property relationships.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative force-extension readouts (stretching force, desorption force, length) suitable for high-content polymer screening.
- Operational Value: Standardized covalent attachment and rinsing protocols ensure assay reproducibility across polymer types and experimental batches.
- Scalability: Functionalized AFM cantilevers can be stored and reused, enabling platform-wide deployment in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Force spectroscopy data from single molecules can be directly compared to molecular dynamics simulations, bridging scales for predictive modeling.
- Disease-Relevant Systems: Applicable to stimuli-responsive polymers (e.g., PEG, PNiPAM) used in drug delivery, enabling evaluation of temperature- or pH-dependent behavior.
- Preclinical De-risking: Measures desorption events under physiologically relevant conditions, supporting go/no-go decisions for formulation advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early polymer screening to preclinical formulation testing, providing mechanical property data that informs lead optimization and risk-adjusted advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of polymer adhesion and mechanical stability in liquid environments, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers standardized, quantitative force measurements that enable reliable comparison of polymer candidates across libraries.
- Analytics: Outputs include force and length parameters derived from sigmoidal fitting of plateaus, enabling statistical comparison of polymer batches.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to bulk polymer performance, supporting continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Functionalized chips can be prepared in batches, stored at 4°C, and reused across projects, maximizing resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in polymer-surface interactions, increasing confidence in target validation assays.
- Operational Value: High reproducibility through controlled covalent attachment and rigorous rinsing minimizes false positives and experimental noise.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions in polymer selection, reducing late-stage formulation failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer candidates based on quantified mechanical and adhesive profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, plasma surface treatment, and polymer solution handling.
- Needs plasma chamber, temperature-controlled incubator, solvent-resistant glassware, and AFM with liquid-cell capability.
- Demands standardization of rinsing protocols across teams to prevent capillary force artifacts and contamination.
- Must account for polymer-specific binding conditions (e.g., toluene vs. ethanol, incubation time/temperature) as outlined in the protocol.
- Practical limitation: Successful single-molecule interpretation depends on low surface density to avoid multi-molecule cascades in force traces.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
