Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM
16 marca 2020
Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.
Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek umożliwia nam pomiar parametrów fizycznych, które opisują właściwości mechaniczne i adhezyjne polimerów. W przypadku korzystania ze spektroskopii sił opartej na AFM do badania pojedynczych cząsteczek, niezbędne jest posiadanie niezawodnego i wydajnego protokołu kowalencyjnego wiązania tych cząsteczek z końcówką wspornikową AFM. Protokół ten można zastosować do wielu różnych polimerów, niezależnie od długości konturu czy hydrofobowości.
Wszystkie czynności należy wykonywać w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane jest szkło odporne na rozpuszczalniki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Najpierw użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej.
Uruchom program aktywacji powierzchni komory plazmowej, wybierając start, a następnie tak. Sprawdź, czy proces plazmowy działa prawidłowo. Proces plazmowy o wysokiej zawartości tlenu ma jasnoniebieski kolor.
Podczas wykonywania programu aktywacji powierzchniowej rozpuść silan-PEG-mal w toluenie, aby uzyskać stężenie 1,25 miligrama na mililitr. Umieść trzy mililitry roztworu na płaskiej szalce Petriego. Po zakończeniu procesu plazmowego przewietrz komorę plazmową, wybierając opcję potwierdź, a następnie odpowietrzaj.
Przejdź natychmiast do następnego kroku, aby zapobiec wchłanianiu zanieczyszczeń. Umieść frytki na szalce Petriego i inkubuj je przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i pozwól jej ostygnąć przez co najmniej 10 minut.
Następnie opłucz frytki. W przypadku wiązania PEG lub polistyrenu należy trzykrotnie spłukać wióry toluenem. W przypadku wiązania polinipamu wióry należy przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.
Aby zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM, podczas płukania należy lekko przechylić wióry. Wióry wspornikowe AFM muszą być odpowiednio wypłukane, aby usunąć nadmiar polimerów fizycznych, które mogą mieć wpływ na eksperyment. Płukanie należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu wsporników AFM.
Na koniec przygotuj co najmniej dwa wióry, które będą służyć jako kontrole, które nie będą poddawane kowalencyjnemu przyłączeniu polimerowemu. W przypadku kontroli w porównaniu z wiórami PEG i polistyrenu spłucz dwukrotnie etanolem i raz wodą. W przypadku kontroli w porównaniu z chipsami z polinipamu, spłucz dwukrotnie wodą.
Aby wykonać kowalencyjne mocowanie PEG lub polistyrenu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w toluenie o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj chipsy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji z PEG lub polistyrenem pozwól frytkom ostygnąć przez 10 minut.
Wióry opłucz dwukrotnie toluenem, dwa razy etanolem i raz wodą. Aby wykonać kowalencyjne przyłączenie polinipamu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w etanolu o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj frytki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.
Po inkubacji z polinipamem spłucz frytki dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą. Aby przechowywać chipsy do czasu wykorzystania w eksperymencie, umieść każdy chips osobno na mililitrowej szalce Petriego wypełnionej wodą. Utrzymuj szalki Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Najpierw włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do uchwytu na wióry. Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiarów w cieczy. Użyj pipety, aby zanurzyć chip w wodzie.
Zamontuj powierzchnię próbki w AFM. Zanurz powierzchnię próbki w wodzie. Podłącz uchwyt na wióry do AFM.
Następnie zbliż chip do powierzchni próbki. Użyj panelu środowiskowego, aby ustawić temperaturę docelową i włączyć przyciski opcji trybu i sprzężenia zwrotnego. Następnie pozwól systemowi zrównoważyć się przez około 15 minut.
Aby wykonać krzywą wydłużenia siły, zbliż końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybierz pojedynczą siłę. Wynikowa krzywa przedstawia ugięcie w stosunku do odległości piezoelektrycznej z podejściem do powierzchni pokazanym na czerwono i wycofaniem pokazanym na niebiesko. Rozszerz część krzywej, która reprezentuje wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem.
Aby wykonać dopasowanie liniowe, ustaw kursory na krzywej podejścia lub krzywej cofania i wybierz opcję Aktualizuj INVOLS z menu kontekstowego. Wynikowa wartość odwrotnej czułości dźwigni optycznej jest wyświetlana w panelu w lewym górnym rogu. Po powtórzeniu tej procedury co najmniej pięć razy oblicz średnią dla odwrotnej czułości dźwigni optycznej i wprowadź średnią w panelu.
Ustaw wspornik AFM na wysokości około 100 mikrometrów nad powierzchnią, wybierając ruch, aby wstępnie włączyć. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu dla widma szumu termicznego, ustaw liczbę uśredniania na co najmniej 10 i wybierz najwyższą możliwą rozdzielczość częstotliwości. Następnie zarejestruj widmo szumu termicznego, wybierając opcję przechwytywania danych termicznych.
Aby dopasować widmo szumu termicznego do prostej funkcji oscylatora harmonicznego, rozwiń część krzywej reprezentującą pierwszy pik rezonansowy. Następnie wybierz opcję Zainicjuj dopasowanie. Na koniec doprecyzuj dopasowanie za pomocą przycisku danych termicznych dopasowania.
Odpowiednia stała siły pojawi się w panelu. Aby rozpocząć zbieranie danych, ustaw parametry eksperymentu. Ustaw prędkość ciągnięcia na jeden mikrometr na sekundę i wymuś spust na jeden nanoniuton.
Zbliżyć końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybrać pojedynczą siłę, aby zarejestrować pojedynczą krzywą i określić, czy parametry należy dostosować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wybierz mapę F z panelu głównego. Aby uzyskać mapę sił ze 100 krzywymi, należy ustawić liczbę punktów sił i linii sił na 10.
Rozpocznij nagrywanie mapy siły, wybierając opcję do mapy F. Weź krzywe wydłużenia siły w sposób przypominający siatkę, aby uniknąć lokalnych efektów powierzchni i uśrednić różne obszary powierzchni. Po doświadczeniu powtórz wyznaczanie odwrotnej czułości dźwigni optycznej i stałej sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.
Pojedyncze polimery polinipamu i PEG zostały kowalencyjnie związane z końcówką wspornika AFM na jednym końcu i fizjosorbowane na powierzchni dwutlenku krzemu na drugim końcu. Aby zmierzyć rozciąganie zależne od temperatury, zidentyfikowano wyraźne zdarzenie rozciągania pojedynczej cząsteczki, po którym następuje końcowe maksimum na końcu odpowiedniej krzywej wydłużenia siły. Następnie generowana była jedna krzywa wzorcowa dla każdej temperatury.
W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku polinipamu zaobserwowano odwrotną tendencję. Desorpcja polistyrenu z powierzchni SAM w wodzie może być wykorzystana do określenia siły i długości desorpcji.
Gdy mocowanie polimeru zakończyło się sukcesem, krzywe wydłużenia siły wykazywały plateau stałej siły. Każdy plateau został wyposażony w krzywą sigmoidalną w celu określenia siły desorpcji i długości desorpcji. Obserwowane siły desorpcji odpowiadały wcześniej uzyskanym wartościom.
Gdy więcej niż jeden polimer był przymocowany do końcówki wspornika AFM, zaobserwowano kaskady płaskowyżów na krzywych wydłużenia siły. Po przyłączeniu dwóch polimerów stwierdzono rozkład bimodalny dla długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. Funkcjonalizowana końcówka wspornikowa AFM może być używana do ilościowego określania odpowiedzi siłowej pojedynczych cząsteczek w środowisku ciekłym i przy bodźcach zewnętrznych.
Stosowanie czystego sprzętu, rozpuszczalników, końcówek wysięgników AFM i wielokrotne płukanie jest bardzo ważne dla osiągnięcia wysokiego poziomu czystości, który powinien zostać potwierdzony przed opisanymi kontrolowanymi eksperymentami. Zaprezentowane protokoły i procedury utorowały drogę do lepszego zrozumienia systemów polimerowych reagujących na bodźce. Wyniki można bezpośrednio porównać z symulacjami dynamiki molekularnej.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono protokół kowalencyjnego przyłączania cząsteczek sondy do końcówek wsporników w mikroskopii sił atomowych (AFM), co jest kluczowe dla badania właściwości fizycznych polimerów. Metoda ta umożliwia pomiar sił rozciągania, sił desorpcji oraz długości polimerów z wysoką powtarzalnością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Nauka o polimerach
Wprowadzenie
- Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek jest niezbędna do pomiaru właściwości mechanicznych polimerów.
- Niezawodne protokoły wiązania kowalencyjnego do wsporników AFM są niezbędne dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Środki ostrożności są kluczowe podczas pracy z rozpuszczalnikami organicznymi.
- Właściwe techniki płukania są niezbędne w celu uniknięcia zanieczyszczeń.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół kowalentnego przywiązania polimerów do wsporników AFM.
- Aby zapewnić powtarzalność pomiarów właściwości fizycznych polimerów.
- Aby ułatwić badanie różnych polimerów, niezależnie od ich charakterystyki.
Zastosowane metody
- Aktywacja powierzchni płytek z wypustkami AFM za pomocą komory plazmowej.
- Przygotowanie roztworów polimerów do przyłączenia kowalencyjnego.
- Protokoły inkubacji i płukania w celu zapewnienia prawidłowego wiązania.
- Pomiar krzywych rozciągania sił przy użyciu AFM.
Główne wyniki
- Skuteczne kowalencyjne przyłączenie PEG, polistyrenu i polinitropraminy (polynipam) do wsporników AFM.
- Wykazana powtarzalność pomiarów siły.
- Przedstawienie kompleksowej metody przygotowania i wykorzystania funkcjonalizowanych wsporników AFM.
- Podkreślenie znaczenia płukania oraz stosowania chipów kontrolnych w eksperymentach.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia wiarygodne badanie właściwości polimerów przy użyciu AFM.
- Prawidłowe przygotowanie i obchodzenie się z próbkami są kluczowe dla powodzenia eksperymentów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne rodzaje i konfiguracje polimerów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kowalencyjne przyłączenie pojedynczej cząsteczki umożliwia powtarzalne pomiary spektroskopii sił, które mają kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka w przypadku kandydatów na leki terapeutyczne oparte na polimerach. Podejście to dostarcza ilościowych danych mechanicznych i adhezyjnych, które wspierają walidację celu oraz identyfikację wiodących związków w systemach dostarczania leków reagujących na bodźce. Poprzez ustanowienie niezawodnych punktów odniesienia dla pojedynczych cząsteczek, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wyborze modeli przedklinicznych i decyzjach dotyczących selekcji projektów w portfelu badawczym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań polimer-powierzchnia w celu wyjaśnienia mechanizmów wiązania i istotności funkcjonalnej celu.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie setek krzywych siła-wydłużenie z jednej cząsteczki, co zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa wiarygodność danych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację sił rozciągania i desorpcji pod wpływem kontrolowanych bodźców, dostarczając informacji o zależnościach struktura-właściwości.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty siły w funkcji rozciągania (siła rozciągania, siła desorpcji, długość), które są odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu polimerów.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane protokoły kowalencyjnego przyłączania i płukania zapewniają powtarzalność analizy dla różnych typów polimerów i partii eksperymentalnych.
- Skalowalność: Funkcjonalizowane sondy AFM mogą być przechowywane i używane ponownie, co umożliwia ich wdrożenie w całej platformie w ramach procesów odkrywania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Dane ze spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek mogą być bezpośrednio porównywane z symulacjami dynamiki molekularnej, co pozwala na łączenie skal w modelowaniu predykcyjnym.
- Układy istotne dla chorób: Metoda jest stosowalna w przypadku polimerów reagujących na bodźce (np. PEG, PNiPAM) wykorzystywanych w dostarczaniu leków, co umożliwia ocenę zachowania zależnego od temperatury lub pH.
- Prekliniczna redukcja ryzyka: Pomiar zdarzeń desorpcji w warunkach fizjologicznie istotnych wspomaga podejmowanie decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu prac nad rozwojem formulacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od wczesnego przesiewania polimerów po przedkliniczne testy formulacji – dostarczając danych o właściwościach mechanicznych, które służą do optymalizacji wiodących związków oraz oceny ryzyka przy dalszym rozwoju projektu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących adhezji polimerów i ich stabilności mechanicznej w środowiskach ciekłych, ograniczając niejednoznaczność mechanistyczną.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe pomiary siły, które umożliwiają wiarygodne porównywanie kandydackich polimerów w obrębie bibliotek.
- Analityka: Wyniki obejmują parametry siły i długości wyznaczone na podstawie dopasowania sigmoidalnego do plateau, co umożliwia statystyczne porównywanie partii polimerów.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie pojedynczych cząsteczek z właściwościami polimerów w skali makro, zapewniając ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonalizowane chipy mogą być przygotowywane w partiach, przechowywane w temperaturze 4°C i wykorzystywane ponownie w różnych projektach, co maksymalizuje efektywność zasobów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w oddziaływaniach polimer-powierzchnia, zwiększając pewność w testach walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Wysoka powtarzalność dzięki kontrolowanemu przyłączeniu kowalencyjnemu i rygorystycznemu płukaniu minimalizuje liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz szum eksperymentalny.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w wyborze polimerów w oparciu o dane, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia formulacji na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów polimerowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe profile mechaniczne i adhezyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w obsłudze AFM, plazmowej obróbce powierzchni oraz pracy z roztworami polimerów.
- Niezbędna jest komora plazmowa, inkubator z kontrolą temperatury, szkło laboratoryjne odporne na rozpuszczalniki oraz AFM z możliwością zastosowania celi z cieczą.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów płukania we wszystkich zespołach, aby zapobiec artefaktom sił kapilarnych i zanieczyszczeniom.
- Należy uwzględnić specyficzne dla danego polimeru warunki wiązania (np. toluen vs etanol, czas/temperatura inkubacji), zgodnie z opisem w protokole.
- Ograniczenie praktyczne: Prawidłowa interpretacja pojedynczych cząsteczek zależy od niskiej gęstości powierzchniowej, co pozwala uniknąć kaskad wielocząsteczkowych w pomiarach sił.
FAQ dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
