Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek umożliwia nam pomiar parametrów fizycznych, które opisują właściwości mechaniczne i adhezyjne polimerów. W przypadku korzystania ze spektroskopii sił opartej na AFM do badania pojedynczych cząsteczek, niezbędne jest posiadanie niezawodnego i wydajnego protokołu kowalencyjnego wiązania tych cząsteczek z końcówką wspornikową AFM. Protokół ten można zastosować do wielu różnych polimerów, niezależnie od długości konturu czy hydrofobowości.

Wszystkie czynności należy wykonywać w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane jest szkło odporne na rozpuszczalniki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Najpierw użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej.

Uruchom program aktywacji powierzchni komory plazmowej, wybierając start, a następnie tak. Sprawdź, czy proces plazmowy działa prawidłowo. Proces plazmowy o wysokiej zawartości tlenu ma jasnoniebieski kolor.

Podczas wykonywania programu aktywacji powierzchniowej rozpuść silan-PEG-mal w toluenie, aby uzyskać stężenie 1,25 miligrama na mililitr. Umieść trzy mililitry roztworu na płaskiej szalce Petriego. Po zakończeniu procesu plazmowego przewietrz komorę plazmową, wybierając opcję potwierdź, a następnie odpowietrzaj.

Przejdź natychmiast do następnego kroku, aby zapobiec wchłanianiu zanieczyszczeń. Umieść frytki na szalce Petriego i inkubuj je przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i pozwól jej ostygnąć przez co najmniej 10 minut.

Następnie opłucz frytki. W przypadku wiązania PEG lub polistyrenu należy trzykrotnie spłukać wióry toluenem. W przypadku wiązania polinipamu wióry należy przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.

Aby zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM, podczas płukania należy lekko przechylić wióry. Wióry wspornikowe AFM muszą być odpowiednio wypłukane, aby usunąć nadmiar polimerów fizycznych, które mogą mieć wpływ na eksperyment. Płukanie należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu wsporników AFM.

Na koniec przygotuj co najmniej dwa wióry, które będą służyć jako kontrole, które nie będą poddawane kowalencyjnemu przyłączeniu polimerowemu. W przypadku kontroli w porównaniu z wiórami PEG i polistyrenu spłucz dwukrotnie etanolem i raz wodą. W przypadku kontroli w porównaniu z chipsami z polinipamu, spłucz dwukrotnie wodą.

Aby wykonać kowalencyjne mocowanie PEG lub polistyrenu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w toluenie o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj chipsy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji z PEG lub polistyrenem pozwól frytkom ostygnąć przez 10 minut.

Wióry opłucz dwukrotnie toluenem, dwa razy etanolem i raz wodą. Aby wykonać kowalencyjne przyłączenie polinipamu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w etanolu o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj frytki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.

Po inkubacji z polinipamem spłucz frytki dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą. Aby przechowywać chipsy do czasu wykorzystania w eksperymencie, umieść każdy chips osobno na mililitrowej szalce Petriego wypełnionej wodą. Utrzymuj szalki Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Najpierw włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do uchwytu na wióry. Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiarów w cieczy. Użyj pipety, aby zanurzyć chip w wodzie.

Zamontuj powierzchnię próbki w AFM. Zanurz powierzchnię próbki w wodzie. Podłącz uchwyt na wióry do AFM.

Następnie zbliż chip do powierzchni próbki. Użyj panelu środowiskowego, aby ustawić temperaturę docelową i włączyć przyciski opcji trybu i sprzężenia zwrotnego. Następnie pozwól systemowi zrównoważyć się przez około 15 minut.

Aby wykonać krzywą wydłużenia siły, zbliż końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybierz pojedynczą siłę. Wynikowa krzywa przedstawia ugięcie w stosunku do odległości piezoelektrycznej z podejściem do powierzchni pokazanym na czerwono i wycofaniem pokazanym na niebiesko. Rozszerz część krzywej, która reprezentuje wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem.

Aby wykonać dopasowanie liniowe, ustaw kursory na krzywej podejścia lub krzywej cofania i wybierz opcję Aktualizuj INVOLS z menu kontekstowego. Wynikowa wartość odwrotnej czułości dźwigni optycznej jest wyświetlana w panelu w lewym górnym rogu. Po powtórzeniu tej procedury co najmniej pięć razy oblicz średnią dla odwrotnej czułości dźwigni optycznej i wprowadź średnią w panelu.

Ustaw wspornik AFM na wysokości około 100 mikrometrów nad powierzchnią, wybierając ruch, aby wstępnie włączyć. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu dla widma szumu termicznego, ustaw liczbę uśredniania na co najmniej 10 i wybierz najwyższą możliwą rozdzielczość częstotliwości. Następnie zarejestruj widmo szumu termicznego, wybierając opcję przechwytywania danych termicznych.

Aby dopasować widmo szumu termicznego do prostej funkcji oscylatora harmonicznego, rozwiń część krzywej reprezentującą pierwszy pik rezonansowy. Następnie wybierz opcję Zainicjuj dopasowanie. Na koniec doprecyzuj dopasowanie za pomocą przycisku danych termicznych dopasowania.

Odpowiednia stała siły pojawi się w panelu. Aby rozpocząć zbieranie danych, ustaw parametry eksperymentu. Ustaw prędkość ciągnięcia na jeden mikrometr na sekundę i wymuś spust na jeden nanoniuton.

Zbliżyć końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybrać pojedynczą siłę, aby zarejestrować pojedynczą krzywą i określić, czy parametry należy dostosować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wybierz mapę F z panelu głównego. Aby uzyskać mapę sił ze 100 krzywymi, należy ustawić liczbę punktów sił i linii sił na 10.

Rozpocznij nagrywanie mapy siły, wybierając opcję do mapy F. Weź krzywe wydłużenia siły w sposób przypominający siatkę, aby uniknąć lokalnych efektów powierzchni i uśrednić różne obszary powierzchni. Po doświadczeniu powtórz wyznaczanie odwrotnej czułości dźwigni optycznej i stałej sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.

Pojedyncze polimery polinipamu i PEG zostały kowalencyjnie związane z końcówką wspornika AFM na jednym końcu i fizjosorbowane na powierzchni dwutlenku krzemu na drugim końcu. Aby zmierzyć rozciąganie zależne od temperatury, zidentyfikowano wyraźne zdarzenie rozciągania pojedynczej cząsteczki, po którym następuje końcowe maksimum na końcu odpowiedniej krzywej wydłużenia siły. Następnie generowana była jedna krzywa wzorcowa dla każdej temperatury.

W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku polinipamu zaobserwowano odwrotną tendencję. Desorpcja polistyrenu z powierzchni SAM w wodzie może być wykorzystana do określenia siły i długości desorpcji.

Gdy mocowanie polimeru zakończyło się sukcesem, krzywe wydłużenia siły wykazywały plateau stałej siły. Każdy plateau został wyposażony w krzywą sigmoidalną w celu określenia siły desorpcji i długości desorpcji. Obserwowane siły desorpcji odpowiadały wcześniej uzyskanym wartościom.

Gdy więcej niż jeden polimer był przymocowany do końcówki wspornika AFM, zaobserwowano kaskady płaskowyżów na krzywych wydłużenia siły. Po przyłączeniu dwóch polimerów stwierdzono rozkład bimodalny dla długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. Funkcjonalizowana końcówka wspornikowa AFM może być używana do ilościowego określania odpowiedzi siłowej pojedynczych cząsteczek w środowisku ciekłym i przy bodźcach zewnętrznych.

Stosowanie czystego sprzętu, rozpuszczalników, końcówek wysięgników AFM i wielokrotne płukanie jest bardzo ważne dla osiągnięcia wysokiego poziomu czystości, który powinien zostać potwierdzony przed opisanymi kontrolowanymi eksperymentami. Zaprezentowane protokoły i procedury utorowały drogę do lepszego zrozumienia systemów polimerowych reagujących na bodźce. Wyniki można bezpośrednio porównać z symulacjami dynamiki molekularnej.