Name: Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj protokół kowalencyjnego przyłączania polimerów do grotów dźwigników AFM do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Metoda umożliwia precyzyjne pomiary właściwości mechanicznych polimerów z dużą powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

B.N.B. i T.H. potwierdzają finansowanie przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, oraz przyznają HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. potwierdza częściowe wsparcie w ramach projektu LOEWE iNAPO poprzez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Badań Naukowych i Sztuki Kraju Związkowego Hesja. Dziękujemy dr Wolfgangowi Bronnerowi i dr Agne Zukauskaite z Instytutu Fraunhofera ds. Stosowanej Fizyki Ciała Stałego IAF za przekazanie wysokiej jakości płytek krzemowych pokrytych złotem.

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla przeglądu schematu.
1. Konfiguracja odczynnika
UWAGA: Polimery użyte do tego protokołu to: glikol maleimidowo-polietylenowy-trietoksysilan (silan-PEG-mal, 5 kDa), glikol tiolowo-polietylenowy-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), poli(N-izopropyloakrylamid) zakończony tiolem (PNiPAM-SH, 637 kDa) i polistyren zakończony tiolem (PS-SH, 1,3 mDa).
<ol>
	<li>Przygotować dobrze zdefiniowany PNiPAM-SH o wysokiej masie molowej poprzez polimeryzację rodnikową z przeniesieniem atomu, a następnie konwersję i redukcję funkcjonalnej grupy końcowej w celu wprowadzenia ugrupowania tiolowego, jak opisano w literaturze18. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się ze szczegółowymi strukturami.</li>
	<li>Do przechowywania chemikaliów należy przygotować mniejsze porcje w systemie suchego komory rękawicowej z atmosferą azotu, aby uniknąć narażenia na działanie tlenu atmosferycznego i wilgoci. PEG i PNiPAM są higroskopijne45,46 a funkcjonalne grupy końcowe PEG, PNiPAM i PS są znane z tego, że łatwo się utleniają, gdy są przechowywane w temperaturze otoczenia33,47,48. Wszystkie chemikalia muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Stosować rozpuszczalniki o czystości analitycznej lub wyższej. Co więcej, używaj ultraczystej wody do płukania chipów wspornikowych AFM i szkła, ponieważ eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami są bardzo wrażliwe na wszelkie zanieczyszczenia.</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu
UWAGA: Użyj pęsety i zlewek wykonanych ze stali nierdzewnej lub szkła. Użyj odwróconej pęsety, aby zapewnić pewny chwyt (np. model R3 SA o niskiej stałej sprężystości).
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór RCA (ultraczysta woda, nadtlenek wodoru i amoniak (5:1:1)) do czyszczenia szkła i pęsety.</li>
	<li>Umieść naczynia w zlewce i napełnij ją RCA, aż szkło lub pęseta zostaną całkowicie pokryte.</li>
	<li>Podgrzewać zlewkę z kroku 2.2 przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Następnie przepłukać naczynia ultraczystą wodą, aż nie będzie już można stwierdzić ostrego zapachu (co najmniej trzy razy).</li>
	<li>Wysuszyć szkło i pęsetę w piekarniku (120 °C).</li>
</ol>
3. Funkcjonalność końcówki
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane są rękawice, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Na każdym kroku używaj rękawic nitrylowych lub lateksowych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Podczas używania toluenu należy nosić rękawice odporne na rozpuszczalniki. Wszystkie kroki, o ile nie określono inaczej, są wykonywane w RT. Na każdym etapie należy używać świeżego sprzętu i rękawic, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia krzyżowego.
<ol>
	<li>Przeprowadzić aktywację powierzchniową poprzez zastosowanie plazmy tlenowej do chipa wspornikowego AFM MLCT-Bio-DC. 
	UWAGA: Efektywność obróbki plazmowej dla dalszych etapów funkcjonalizacji skaluje się wraz z zawartością tlenu w komorze plazmowej.
	<ol>
		<li>Użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej (40 kHz, 600 W).</li>
		<li>Użyj specjalnie zmodyfikowanego programu aktywacji: ewakuacja (0,1 mbar) – zalanie tlenem do ciśnienia: 0,2 mbar (4 min) – proces plazmowy (moc: 40%, czas trwania: 2 min, ciśnienie procesowe: 0,2 mbar).</li>
		<li>Przewietrzyć komorę i natychmiast przejść do kroku 3.2.2, aby zapobiec adsorpcji zanieczyszczeń z powietrza na wiórach wspornikowych AFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Silanizacja i PEGylacja 
	UWAGA: Czas jest krytycznym parametrem między krokami. W czasie oczekiwania przygotuj roztwory tak świeże, jak to możliwe. Grupy maleimidowe ulegają hydrolizie w środowisku wodnym, a tiole łatwo utleniają się do dwusiarczków w roztworze33,47 utrudniając reakcje funkcjonalizacji końcówki AFM.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór silanu-PEG-mal w toluenie (1,25 mg/ml) w odpornych na rozpuszczalniki probówkach z tworzywa sztucznego lub szkła i wlać 6 ml roztworu na płaskie szalki Petriego po 3 ml każda. 
		UWAGA: Jeśli w eksperymencie SMFS zaobserwowano wiązanie wielu polimerów sondy, mieszanie silanu-PEG-mal z niefunkcjonalnym silanem-PEG może zmniejszyć liczbę punktów kotwiczenia. Do regulacji warstwy pasywacyjnej można użyć PEG o różnych masach (tj. długościach konturów)27.</li>
		<li>Inkubować wióry wspornikowe AFM natychmiast po kroku 3.1.3 w roztworze silan-PEG-mal (do 10 wiórów na szalkę Petriego) przez 3 godziny w temperaturze 60 °C35.</li>
		<li>Wyjmij szalki Petriego z piekarnika i pozwól roztworowi ostygnąć przez co najmniej 10 minut.</li>
		<li>Dokładnie opłucz każdy chip wspornikowy AFM. Zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM podczas przechodzenia przez granicę faz powietrze-rozpuszczalnik, na przykład poprzez lekkie przechylenie tych wiórów podczas zanurzania w roztworze.
		<ol>
			<li>W przypadku polimerów PEG i PS spłukać trzykrotnie toluenem.</li>
			<li>W przypadku polimeru PNiPAM przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz co najmniej dwa wióry wspornikowe AFM jako kontrolne wióry wspornikowe AFM, pomijając krok 3.3 i przepłucz je w następujący sposób, aby zwiększyć polarność rozpuszczalnika:
		<ol>
			<li>W przypadku polimerów PEG i PS spłukać dwukrotnie etanolem i raz ultraczystą wodą.</li>
			<li>W przypadku polimeru PNiPAM spłukać dwukrotnie ultraczystą wodą. 
			UWAGA: Chipy wspornikowe Control AFM przeszły wszystkie etapy funkcjonalizacji z wyjątkiem mocowania polimerowego (krok 3.3). Służą one do udowodnienia czystości procesu funkcjonalizacji, systemu wspornikowych uchwytów wiórów AFM, powierzchni i rozpuszczalników użytych w eksperymencie SMFS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nasadka polimerowa kowalencyjna 
	UWAGA: Mimo, że oczekuje się, że końcówka wspornika AFM będzie całkowicie pokryta grupami maleimidowymi, istnieje tylko kilka miejsc wiązania dla polimeru pojedynczej sondy, ponieważ maleimid ulega hydrolizie w wodzie, co prowadzi do nieaktywnych PEGs47. Te nieaktywne PEG-i działają jak warstwa pasywacyjna, jak opisano powyżej.
	<ol>
		<li>Inkubować wióry wspornikowe AFM bezpośrednio po kroku 3.2.5 w jednym z następujących roztworów polimerowych na 3 ml szalek Petriego. Jeśli dany polimer nie zostanie prawidłowo rozpuszczony, należy użyć łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i dobrze wymieszać roztwór. 
		UWAGA: Ponieważ stosowanie polimerów zakończonych tiolem może prowadzić do powstawania wiązań dwusiarczkowych utrudniających reakcję z grupami maleimidowymi silanu-PEG-mal, zaleca się stosowanie środka redukującego, w szczególności jeśli krok 3.3 jest stosowany w wodnych dla polimerów rozpuszczalnych w wodzie33.
		<ol>
			<li>W przypadku polimerów PEG i PS należy stosować stężenie 1,25 mg/ml w toluenie przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.</li>
			<li>W przypadku polimerów PNiPAM należy stosować stężenie 1,25 mg/ml w etanolu przez 3 godziny w temperaturze RT. 
			UWAGA: Jeśli w eksperymencie SMFS zaobserwowano wiązanie wielu polimerów sondy, stężenie polimeru powinno zostać zmniejszone.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ostrożnie wypłucz każdy chip wspornikowy AFM.
		<ol>
			<li>W przypadku polimerów PEG i PS po 10 minutach schładzania spłukać dwukrotnie toluenem, dwukrotnie etanolem i raz wodą ultraczystą.</li>
			<li>W przypadku polimerów PNiPAM należy spłukać dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą ultraczystą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przechowuj każdy chip wspornikowy AFM oddzielnie na małej (1 ml) szalce Petriego wypełnionej ultraczystą wodą o temperaturze 4 °C do czasu użycia w eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie powierzchni
<ol>
	<li>Wafel z tlenku krzemu 
	UWAGA: Ta powierzchnia została użyta do SMFS z PEG i PNiPAM.
	<ol>
		<li>Pokrój wafel z tlenku krzemu na małe kawałki za pomocą noża diamentowego.</li>
		<li>Umieść kawałki tlenku krzemu oddzielnie w probówkach do mikrowirówek i napełnij te probówki etanolem.</li>
		<li>Sonikować kawałki tlenku krzemu przez 10 minut.</li>
		<li>Dwukrotnie opłucz kawałki tlenku krzemu etanolem i ostrożnie wysusz je pod strumieniem azotu. Kawałki tlenku krzemu należy natychmiast zużyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Samoorganizująca się monowarstwa hydrofobowego alkanu tiolu na złocie (SAM) 
	UWAGA: Ta powierzchnia była używana do SMFS z PS. Zobacz literature39,49, aby uzyskać więcej informacji na temat SAM.
	<ol>
		<li>Użyj płytki krzemowej pokrytej złotem (A [100], tytan 5 nm, złoto 100 nm), aby wykonać kroki 4.1.1 – 4.1.4.</li>
		<li>Inkubować kawałki powierzchni w roztworze 1-dodekantiolu (2 mM) przez 18 godzin.</li>
		<li>Świeżo przygotowane SAM-y opłucz dwukrotnie w etanolu.</li>
		<li>Suszyć SAM z przepływem azotu do bezpośredniego użycia lub przechowywać je w etanolu do 4 dni do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Akwizycja danych
UWAGA: Wszystkie pokazane tutaj pomiary zostały wykonane w ultraczystej wodzie za pomocą Cypher ES AFM przy użyciu ogrzewania i chłodzenia próbki do zmiany temperatury. Ogólnie rzecz biorąc, można stosować wszystkie AFM zapewniające możliwość pomiaru w cieczach.
<ol>
	<li>Włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do AFM.</li>
	<li>Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiaru w cieczach (np. Związek replikujący o wysokiej rozdzielczości 101RF lub klej utwardzany promieniami UV). 
	UWAGA: Te środki wiążące są wysoce obojętne i odporne na dużą liczbę rozpuszczalników polarnych. Przed użyciem należy sprawdzić odporność kleju na rozpuszczalniki niepolarne (np. toluen lub heksan) lub wysokie temperatury.</li>
	<li>Zanurz chip wspornikowy AFM i próbkę sondy w cieczy, tutaj: ultraczysta woda. 
	UWAGA: Kropla rozpuszczalnika (około 100 μl) może osadzać się na wspornikowym uchwycie wiórów AFM. Pokrycie wióra wspornika AFM rozpuszczalnikiem zmniejsza siły kapilarne, które w przeciwnym razie działałyby na wspornik AFM podczas zbliżania się do powierzchni próbki przechodzącej przez granicę faz powietrze-rozpuszczalnik</li>.
	<li>W razie potrzeby wyreguluj temperaturę i pozwól systemowi się zrównoważyć. 
	UWAGA: Zmiany temperatury mogą powodować ugięcie wspornika AFM z powodu efektu bimetalicznego dla wsporników AFM z powłoką odblaskową, taką jak aluminium lub złoto. Równowagę należy przeprowadzać z dala od powierzchni (kilka μm) do momentu, gdy nie obserwuje się dalszej zmiany sygnału ugięcia (do 15 minut dla MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Zmieniaj temperaturę losowo, aby wykluczyć jakiekolwiek efekty starzenia się funkcjonalizacji. Upewnij się, że zastosowane temperatury nie prowadzą do nieodwracalnego wygięcia wspornika AFM. 
	UWAGA: Jakikolwiek wpływ temperatury na właściwości rozpuszczalnika (taki jak parowanie lub zmiany lepkości) może utrudnić eksperymenty. W prezentowanych przykładach temperatura zmieniała się w zakresie do 40 K w krokach co 10 K, przyjmując wodę jako rozpuszczalnik (np. od 278 K do 318 K).</li>
	<li>Zbliż się do powierzchni, aby określić InvOLS (odwrotną czułość dźwigni optycznej), wykonując krzywe siły-wydłużenia na twardej powierzchni (takiej jak tlenek krzemu). W tym celu należy wziąć sygnał odchylenia fotodetektora (w V) w funkcji odległości piezoelektrycznej i określić nachylenie części reprezentującej wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem (reżim odpychający) za pomocą funkcji liniowej. Aby zmniejszyć liczbę błędów, należy wziąć średnią z co najmniej pięciu wartości, aby uzyskać ostateczną wartość InvOLS. Więcej informacji można znaleźć w literaturze4,39. 
	UWAGA: InvOLS można niezawodnie określić tylko na twardych powierzchniach. W przypadku eksperymentów na miękkich powierzchniach lub interfejsach upewnij się, że umieścisz twardą powierzchnię blisko miękkich powierzchni. Następnie kalibrację InvOLS można przeprowadzić przed lub po eksperymentach z miękkimi powierzchniami bez konieczności demontażu zestawu AFM.</li>
	<li>W celu wyznaczenia stałej sprężystości należy przesunąć wspornik AFM na wysokość, na której nie ma ani atrakcyjnych, ani odpychających interakcji między końcówką wspornika AFM a powierzchnią (kilka μm). Następnie nagraj widmo szumu termicznego, w którym wykreślana jest gęstość widmowa mocy (PSD) w funkcji częstotliwości. Następujące kroki są zwykle wykonywane przez zautomatyzowane funkcje wbudowane w komercyjne oprogramowanie AFM: po pierwsze, uzyskane widmo szumu termicznego jest analizowane poprzez dopasowanie funkcji do PSD, np. prostego oscylatora harmonicznych (SHO). Dopasowanie jest wykonane do minimum między pierwszym a drugim rezonansem. Po drugie, określa się powierzchnię pod zamontowaną częścią wykresu PSD w funkcji częstotliwości, reprezentującą średnie kwadratowe przemieszczenie wspornika AFM w kierunku pionowym. Na koniec twierdzenie o ekwipartycji służy do uzyskania stałej siły wspornika AFM28,50. 
	UWAGA: Należy zastosować odpowiedni zakres częstotliwości obejmujący pierwszy pik rezonansowy wspornika AFM. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu, należy zgromadzić co najmniej 10 plików PSD o najwyższej możliwej rozdzielczości częstotliwości.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment. Zapisuj mapy sił, biorąc krzywe rozciągnięcia siły w sposób przypominający siatkę (np. 10 x 10 punktów dla obszaru 20 x 20 μm2), aby uniknąć lokalnych skutków powierzchniowych (np. zanieczyszczeń, przemieszczeń) i uśrednić różne powierzchnie. 
	UWAGA: Typowe parametry to prędkość ciągnięcia 1 μm/s i częstotliwość próbkowania 5 kHz, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość. Częstotliwość pobierania próbek powinna być dostosowana, gdy prędkość ciągnięcia jest zmienna. Odległość cofania powinna być dostosowana do długości konturu lub desorpcji mierzonego polimeru (ok. dwukrotność oczekiwanej długości).</li>
	<li>Używaj i zmieniaj czas przebywania w kierunku powierzchni, aby pojedynczy polimer mógł przylegać do powierzchni (zwykle 0 – 5 s).</li>
	<li>Powtórz oznaczanie InvOLS i stałej sprężystości na końcu doświadczenia, aby sprawdzić konsystencję i stabilność systemu. 
	UWAGA: Aby uzyskać silną przyczepność między polimerem a powierzchnią, kalibrację można wykonać po faktycznym eksperymencie, aby zachować funkcjonalizację.</li>
</ol>
6. Ocena danych
UWAGA: Do oceny danych, do wykonania następujących kroków użyto specjalnie napisanego oprogramowania opartego na Igor Pro.
<ol>
	<li>Przelicz surowy sygnał ugięcia (w woltach) na wartości siły (w niutonach), mnożąc przez zarejestrowany InvOLS i wyznaczoną stałą sprężystości.</li>
	<li>Odejmij ugięcie wspornika AFM (po pomnożeniu surowego sygnału ugięcia za pomocą InvOLS) od odległości pokonywanej przez elementy piezoelektryczne w kierunku pionowym, aby uzyskać rzeczywiste wydłużenie (odległość końcówka-powierzchnia)4.</li>
	<li>Skorygować krzywe siła-wydłużenie uzyskane dla dryftu, dopasowując funkcję liniową do linii bazowej po ostatnim zdarzeniu i odejmując ją od krzywej siła-wydłużenie. Dopasowana część powinna stanowić wystarczające przedłużenie od powierzchni, gdzie nie obserwuje się ani przyciągających, ani odpychających oddziaływań między końcówką wspornika AFM a powierzchnią znajdującą się pod spodem. Następnie linia bazowa jest ustawiana na oś zerową. 
	UWAGA: W przypadku pomiarów na powierzchniach silnie odbijających światło, takich jak złoto, mogą pojawić się zakłócenia. Wynikają one z częściowego odbicia wiązki laserowej od powierzchni i od tyłu wspornika AFM. Tak więc uzyskane krzywe rozciągnięcia siły mogą pokazywać artefakt sygnału siły sinusoidalnej wzdłuż wydłużenia pionowego. Jest to artefakt, który utrudnia końcowe wartości siły. Aby nadal uwzględniać te krzywe siła-rozciągnięcie, możliwa jest korekta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Jeśli zakłócenia pojawiają się na krzywych rozciągnięcia siły, wybierz reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie (krzywa retrakcji) nie pokazującą żadnych innych zdarzeń poza ewentualnie szczytem niespecyficznej adhezji i tym samym artefaktem sinusoidalnym (tj. amplitudą i fazą) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Wygładź reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie, aby uzyskać wzór zakłóceń o niskiej częstotliwości.</li>
	<li>Wybierz krzywą siła-wydłużenie, która ma zostać skorygowana (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Nałóż obie krzywe rozciągnięcia siły z kroków 6.4. i 6.5., aby upewnić się, że obie pokazują ten sam artefakt sinusoidalny (tj. amplitudę i fazę) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Odejmij (wygładzoną) reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie od krzywej siła-wydłużenie, która ma zostać skorygowana, prowadząc do prostej, a nie sinusoidalnej linii bazowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby niespecyficzny pik adhezji krzywej reprezentatywnej różnił się od wszelkich zdarzeń pojedynczych cząsteczek pojawiających się w krzywych, które mają być korygowane. W rzeczywistości wybór krzywej reprezentatywnej jest kluczowy dla prawidłowej korekty.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

SMFS oparty na AFM jest jednym z głównych narzędzi do badania oddziaływań pojedynczych cząsteczek w fizyce polimerów. Aby przeprowadzić prawdziwy eksperyment z pojedynczą cząsteczką, niezbędne jest kowalencyjne przymocowanie polimeru sondy do końcówki wspornika AFM.
Wiele wcześniejszych prac opiera się na eksperymentach z nanopołowami, w szczególności dla PNiPAM, gdzie polimery są adsorbowane na powierzchni, a następnie rozciągane poprzez losowe wybieranie ich z podłoża za pomocą końcówki wspornikowej AFM30,31. Może to zmienić wyniki i prowadzić do błędnej interpretacji zachowania pojedynczej cząsteczki. W tym przypadku efekty kooperacyjne mogą zdominować wyniki, ponieważ nie można wykluczyć interakcji z sąsiednimi polimerami. Ma to duży wpływ na wyniki, szczególnie w przypadku polimerów, które wykazują znacznie inne zachowanie w masie w porównaniu z pojedynczymi izolowanymi cząsteczkami57,58.
Przedstawiony tutaj protokół funkcjonalizacji jest niezawodny i może być łatwo zastosowany do różnych polimerów, niezależnie od ich długości konturu, hydrofobowości lub sterycznej przeszkody monomerów. Dodatkowo zapewniona jest pasywacja, aby zapobiec niepożądanym interakcjom między polimerem pojedynczej sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią pod spodem. Ponadto przedstawiono ocenę krzywych siła-wydłużenie pokazujących zdarzenia rozciągania. Zaproponowano tam procedurę wyznaczania krzywych siły głównej-wydłużenia. Daje to lepszy sposób na ujawnienie, np. wpływu związanego z temperaturą na zachowanie siły rozciągniętej. Ponadto zapewniono analizę zdarzeń desorpcji pojedynczych cząsteczek o stałym płaskowyżu siły. Podano również prosty sposób korygowania artefaktów sygnału siły sinusoidalnej w krzywych rozciągnięcia siły, które w przeciwnym razie mogłyby pogorszyć wyniki eksperymentu.
W porównaniu ze Stetterem i wsp.39, przedstawiona tutaj procedura funkcjonalizacji została zredukowana do trzech kroków zamiast czterech, a niezawodność procedury uległa poprawie. Główną korzyścią płynącą z przeprowadzenia pegylacji i silanizacji w jednym kroku jest lepiej kontrolowana reakcja i zwiększenie wydajności. Ponadto trzeba przygotować mniej roztworów i wymagana jest mniejsza liczba etapów płukania. Zmniejsza to wysiłek i czas potrzebny na przygotowanie oraz zwiększa powtarzalność. Co więcej, przesuwanie wsporników AFM jest zawsze krytyczną częścią procesu funkcjonalizacji. Przeniesienie z jednego rozwiązania na drugie zawsze wiąże się z ryzykiem silnego wpływu na jakość funkcjonalizacji z powodu transferów przez interfejs powietrze-woda lub utraty wsporników AFM przez niewłaściwe użycie pęsety.
Aby udowodnić prawidłowe kowalencyjne połączenie pojedynczego polimeru z końcówką wspornikową AFM, muszą być spełnione różne warunki. Po pierwsze, wsporniki sterujące AFM mają niebagatelne znaczenie i powinny być przygotowane na każdą funkcjonalizację. Proces funkcjonalizacji i płynna komórka do przeprowadzania eksperymentów są uważane za czyste tylko wtedy, gdy niewielka liczba krzywych siła-rozciągnięcie wykazuje rozciągnięcia lub plateau w eksperymencie kontrolnym (w przedstawionych przykładach mniej niż 2%).
Wyraźny wzór rozciągania bez dalszych spadków lub maksimów jest niezbędny do prawidłowego rozciągania pojedynczej cząsteczki. Dodatkowo należy przeanalizować zależność siły zrywającej od szybkości obciążenia siłą przy zerwaniu lub całkowitej odpowiedzi sprężystej krzywej rozciągania w celu wykluczenia jednoczesnej desorpcji wielu polimerów59,60. W przypadku PEG i PNiPAM odpowiednio 19% i 42% krzywych siła-rozciągnięcie wykonanych w różnych miejscach powierzchni wykazywało taki wzór rozciągania. Aby uzyskać zdarzenia rozciągające, fizysorpcja polimeru do odpowiedniej powierzchni leżącej pod spodem musi być silna. W przeciwnym razie obserwuje się zdarzenie desorpcji podobne do plateau. Jest to jeszcze bardziej decydujące dla wykrywania zdarzeń rozciągania przy dużych siłach (do 500 pN lub więcej). Ponieważ ta silna fizysorpcja nie jest spełniona dla każdej krzywej rozciągnięcia siły, wydajność takich zdarzeń jest mniejsza niż w przypadku czystych zdarzeń desorpcji podobnych do plateau. Alternatywnie można zastosować silnie przylegające grupy, takie jak katechole lub chemisorpcja między polimerem a leżącą pod spodem powierzchnią. Wymaga to jednak wprowadzenia kolejnych grup funkcyjnych lub miejsc sprzęgania w polimerze61,62.
W rzeczywistości masa (tj. długość konturu) polimeru stanowi cenny odcisk palca. Chociaż masy nie można bezpośrednio przełożyć na zmierzoną długość konturu z następujących powodów, rozkład długości jest bardzo cenny dla zdefiniowania zdarzeń pojedynczych cząsteczek. W przypadku polimeru PNiPAM o niskiej polidyspersyjności (Ɖ = 1,28) stwierdzono istotne różnice w wartościach wydłużenia dla uzyskanych zdarzeń rozciągania (a tym samym w długości polimeru) w eksperymentach. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być określenie długości polimeru i jego rozkładu. W chromatografii wykluczającej według wielkości (SEC) określa się względną masę docelowego polimeru w porównaniu z wzorcami, takimi jak PS lub poli(metakrylan metylu) (PMMA)63. Oczekuje się, że przypuszczalna masa względna będzie odbiegać od bezwzględnej masy cząsteczkowej, ponieważ promień hydrodynamiczny docelowego polimeru i wzorca może się znacznie różnić. Dodatkowo warstwa silanu może być oligomeryzowana przez fałszywą wodę w toluenie podczas procesu funkcjonalizacji. Przymocowanie takich oligomerów do końcówki wspornika AFM prowadzi do uzyskania bardziej elastycznej warstwy z mniejszą liczbą punktów kotwiczenia64. Ponadto punkt przyczepienia polimeru do warstwy krzemu niekoniecznie musi znajdować się na wierzchołku, co prowadzi do przesunięcia wykrytych wartości długości29. Podczas gdy model polimerowy, taki jak łańcuch ślimakowy (WLC) lub model łańcucha swobodnie łączonego (FJC), nie może prawidłowo odtworzyć odpowiedniego zachowania siły-wydłużenia dla PEG lub PNiPAM w całym zakresie rozciągnięcia 18,29,41,65,66, taki model polimerowy może być cenny dla innych układów polimerowych i białkowych 10,15,67,68.
Kowalencyjne przyłączenie pojedynczego polimeru PS (o długości konturu większej niż 1 μm) uważa się za udane tylko wtedy, gdy znaczna liczba krzywych siła-rozciągnięcie wykazuje wystarczająco długi plateau stałej siły (rysunek 5). Plateau wynikający z desorpcji pojedynczego polimeru jest definiowany przez pojedynczy gwałtowny spadek stałej siły do linii podstawowej przy pewnym rozciągnięciu, jak pokazano na rysunku 5A. Jeśli więcej polimerów jest przymocowanych do końcówki wspornika AFM, obserwuje się kaskadę płaskowyżów56 (Rysunek 5C). Długość plateau (długość desorpcji), skorelowana z długością konturu polimeru51, musi być znacznie dłuższa niż jakikolwiek pik adhezji ze względu na niespecyficzne przyleganie końcówki wspornika AFM do powierzchni leżącej pod spodem (tutaj około 200 nm). Cechy pojawiające się wyłącznie na pojedynczej krzywej siła-wydłużenie nie powinny być interpretowane. W prezentowanych eksperymentach co najmniej 80 ze 100 krzywych wykazało plateau dłuższe niż 200 nm na co najmniej dwóch mapach sił w dwóch różnych miejscach na powierzchni. Ponadto rozkład długości desorpcji, przy użyciu wykresów punktowych, takich jak pokazano na rysunku 5B i 5D, ujawnia, czy i ile polimerów jest związanych z końcówką wspornika AFM. W przypadku PS wąski rozkład siły desorpcji i długości zaczerpnięty z płaskowyżów krzywych siła-wydłużenie posłużył jako dowód udanego przyłączenia kowalencyjnego. To ostatecznie udowodniło sukces protokołu funkcjonalizacji. Dlatego gorąco rekomendujemy aby takie rozkłady siły i długości prezentować w publikacjach.
Ocena krzywych siła-wydłużenie przy użyciu wbudowanych algorytmów, które zawierają wiele wstępnie ustawionych parametrów, powinna być wykonywana ostrożnie. Powodem jest na przykład to, że stała częstotliwość próbkowania nie jest odpowiednia dla każdej zastosowanej prędkości ciągnięcia lub że automatyczne wygładzanie krzywych siła-wydłużenie może uśrednić ważne szczegóły. Zazwyczaj właściwe zrozumienie danej procedury oceny może zapobiec błędom w procedurze oceny, które z kolei mogą silnie wpłynąć na końcowe wyniki eksperymentu SMFS opartego na AFM.
Podsumowując, przedstawiamy protokół funkcjonalizacji, który jest niezawodny i można go łatwo zastosować do różnych polimerów. Ponadto przedstawiono właściwą ocenę krzywych rozciągnięcia siły pojedynczej cząsteczki, co pozwala na wyznaczenie parametrów fizycznych, takich jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji. Przedstawione protokoły i procedury są cenne dla badania systemów reagujących na bodźce na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Od czasu wynalezienia w latach 80. XX wieku1, mikroskop sił atomowych (AFM) stał się jedną z najważniejszych technik obrazowania w naukach przyrodniczych, oferując sub-nanometrową rozdzielczość przestrzenną, rozdzielczość siły sub-Piconewton i możliwość pomiaru w różnych warunkach rozpuszczalnikowych i temperaturowych2,3,4,5,6,7.
Oprócz obrazowania8,9, AFM służy do wykonywania spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki (SMFS), dając wgląd w interakcje adhezyjne między pojedynczym polimerem a powierzchniami, właściwości fizyczne pojedynczych polimerów i mechanizmy rozwijania białek7,10,11,12,13,14,15,16. W zwykłym eksperymencie SMFS funkcjonalizowana końcówka wspornika styka się z powierzchnią, tak że polimer na końcówce wspornika AFM dociera do tej powierzchni. Poprzez cofnięcie końcówki wspornika AFM od powierzchni, zmiana ugięcia wspornika AFM jest przekształcana w siłę prowadzącą do krzywej siła-wydłużenie4. Parametry fizyczne, takie jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji, mogą być określane jako zależne od różnych parametrów, takich jak prędkość ciągnięcia, czas przebywania na powierzchni, głębokość wgłębienia w powierzchnię, temperatura, rozpuszczalnik17,18 i różne powierzchnie, takie jak podłoża stałe, folie polimerowe lub dwuwarstwy lipidowe19,20,21,22. Co więcej, polimer może być badany w różnych kierunkach przestrzennych, badając w ten sposób właściwości cierne polimeru23,24,25,26.
Kowalencyjne połączenie badanego polimeru z końcówką wspornika AFM jest niezbędne dla takich badań. W ten sposób wysoka wydajność pojedynczych cząsteczek z jednym i tym samym polimerem związanym z końcówką wspornikową AFM zapobiega wszelkim odchyleniom wyników wynikającym z kalibracji stałej sprężystości wspornika AFM27,28, różne punkty mocowania29 lub różnych polimerów (o różnych długościach konturów), takich jak w przypadku eksperymentów z nanopołowami30, 31,32. Można również w znacznym stopniu zapobiec interakcjom z innymi polimerami, a także efektom uśredniania18,28. Do kowalencyjnego mocowania polimeru do końcówki wspornika AFM można zastosować różne rodzaje modyfikacji chemicznych, z których wiele podsumowano w książce Hermanson33. Reakcje łączenia na bazie amin i tioli, a także chemia kliknięć to najczęściej stosowane metody w funkcjonalizacji końcówek kantylowych AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke i wsp.40 pokazują, jak używać chemii 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)/NHS do przyłączenia białka do końcówki wspornika AFM. Jednak wspomniane grupy funkcyjne mają tendencję do sieciowania, co prowadzi do utraty funkcjonalności43,44. Ponadto karbodiymidy wykazują tendencję do szybkiej hydrolizy w roztworze43. Grupy maleimidowe i tiolowe są na ogół bardziej stabilne i nie wykazują reakcji sieciowania. Prezentowany protokół jest optymalizacją wcześniej opublikowanych protokołów podanych w references35,39.
Tutaj prezentowany jest niezawodny protokół funkcjonalizacji, który można łatwo dostosować do dużej liczby różnych polimerów, niezależnie od właściwości takich jak długość konturu czy hydrofobowość. Jako przykład wybrano trzy różne polimery: hydrofilowy glikol polietylenowy (PEG) i poli(N-izopropyloakrylamid) (PNiPAM) oraz polistyren hydrofobowy o wysokiej masie molowej (PS). Aby zapewnić zdolność wiązania kowalencyjnego z odpowiednią cząsteczką łącznika, trzy polimery wybrano tak, aby zawierały telecheliczne ugrupowanie tiolowe jako funkcjonalną grupę końcową. Sama cząsteczka łącznika jest zazwyczaj krótkim polimerem PEG z dwoma miejscami aktywnymi, grupą silanową na jednym końcu i grupą maleimidową na drugim końcu. Pierwsza z nich umożliwia kowalencyjne przymocowanie do końcówki wspornika AFM, a druga reakcję wiązania z grupą tiolową funkcjonalizowanego polimeru o wysokiej masie molowej. Ponadto nieaktywne cząsteczki łącznikowe PEG służą jako warstwa pasywacyjna, aby zapobiec niepożądanym interakcjom między polimerem sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią pod spodem.

<table><tbody><tr><td>1-dodekanetiol (&ge; 98%)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>417364-500ML</td><td>Używany do roztworu</td></tr><tr><td>amoniaku SAM (30%)</td><td>Roth, Niemcy</td><td>CP17.2</td><td>Używany do czyszczenia</td></tr><tr><td>Cypher ES</td><td>Asylum Research, firmy Oxford Instruments, USA-AFM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Etanol (&ge; 99,9%)</td><td>Roth, Niemcy</td><td>PO76.1</td><td>Wafel</td></tr><tr><td>krzemowy pokryty złotem</td><td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Niemcy</td> <td>-</td> <td>używany do SAM</td></tr> High <tr><td>Resolution Replicating Compound</td><td>Microset Products Ltd, Wielka Brytania</td><td>101RF</td><td>Środek wiążący</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H1009</td><td>Używany do czyszczenia</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics, USA-Środowisko</td><td></td> <td>oprogramowania</td></tr><tr><td>Tetra-30-LF-PC</td><td>Diener Electronic, Niemcy-Komora</td><td></td> <td>plazmowa</td></tr><tr><td>Maleimid-glikol polietylenowy-trietoksysilan</td><td>Creative PEG works, USA</td><td>PHB-1923</td><td>Polimer łącznikowy</td></tr><tr><td>MLCT-Bio-DC</td><td>Bruker, USA</td><td>MLCT-Bio-DC</td><td>AFM</td></tr><tr><td>wafel Prime CZ-Si, typ n (fosfor) TTV < 10 &micro; m</td><td>MicroChemicals, Niemcy</td><td>WSA40600250 P1314SNN1</td><td>Wafel krzemowy</td></tr><tr><td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&Omega; cm</td><td>Elga LabWater, Niemcy</td><td>10034-540</td><td>Źródło wody ultraczystej</td></tr><tr><td>R3 SA</td><td>Vomm GmbH, Niemcy</td><td>5803</td><td>Pęseta</td>ślepa</tr><tr><td>Poli(N-izopropyloakrylaamid) zakończony tiolem)</td> <td>Gallei Group, Uniwersytet Kraju Saary,</td> <td>Niemcy-Polimer</td><td></td></tr> <tr><td>sondy PNiPAMPolistyren zakończony tiolem</td><td>Źródło polimeru, Kanada</td><td>P40722-SSH</td><td>Polimer sondy PS</td></tr><tr><td>Tiol-glikol polietylenowy-tiol</td><td>Creative PEGWorks, USA</td><td>PSB-615</td><td>Polimer sondy PEG</td></tr><tr><td>Toluen (99,99%)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>T324-500</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr></tbody></table>

kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na afm

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM) jest idealnym narzędziem do badania oddziaływań między pojedynczym polimerem a powierzchniami. W prawdziwym eksperymencie z pojedynczą cząsteczką niezbędne jest kowalencyjne przyłączenie cząsteczki sondy, ponieważ tylko wtedy można uzyskać setki śladów rozciągnięcia siły z jedną i tą samą pojedynczą cząsteczką. Wiele śladów jest z kolei koniecznych, aby udowodnić, że badana jest tylko pojedyncza cząsteczka. Ponadto pasywacja ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niepożądanym interakcjom między pojedynczą cząsteczką sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią znajdującą się pod spodem. Przedstawiony tutaj protokół funkcjonalizacji jest niezawodny i można go łatwo zastosować do różnych polimerów. Charakterystyczne zdarzenia pojedynczej cząsteczki (tj. rozciągnięcia i płaskowyże) są wykrywane w śladach siły-rozciągnięcia. Na podstawie tych zdarzeń można uzyskać parametry fizyczne, takie jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji. Jest to szczególnie ważne dla precyzyjnego badania układów reagujących na bodźce na poziomie pojedynczej cząsteczki. Jako przykładowe systemy poli(glikol etylenowy) (PEG), poli(N-izopropyloakrylamid) (PNiPAM) i polistyren (PS) są rozciągane i desorbowane z SiOx (dla PEG i PNiPAM) oraz z hydrofobowych samoorganizujących się powierzchni jednowarstwowych (dla PS) w środowisku wodnym.

Poniższe przykłady przedstawiają wyniki rozciągania i desorpcji pojedynczych cząsteczek polimerów PEG, PNiPAM i PS. Wszystkie końcówki dźwigarów AFM zostały funkcjonalizowane zgodnie z powyższym protokołem. Pomiary PEG i PNiPAM przeprowadzono na SiOx przy zmiennej temperaturze. Szczegółową dyskusję dotyczącą uzyskanych, zależnych od temperatury krzywych rozciągania dla PEG i PNiPAM można znaleźć w pracy Kolberg et al.18 Innym motywem siła-wydłużenie jest plateau stałej siły (np. podczas desorpcji PS z samoorganizujących się monolayerów alkanotioli zakończonych grupami metylowymi na złocie (SAM) w wodzie4,27,39,51).
Przykład 1: Rozciąganie PEG i PNiPAM w wodzie 
Zależne od temperatury zachowanie podczas rozciągania w wodzie mierzono przy użyciu pojedynczych polimerów PNiPAM i PEG, kowalencyjnie związanych jednym końcem z końcówką dźwigni AFM i fizysorbowanych drugim końcem na powierzchni SiOx. Po kalibracji i eksperymentach kontrolnych czystości (mniej niż 2% krzywych siła-wydłużenie wykazało zdarzenia pojedynczych cząsteczek), dla każdej dźwigni AFM zarejestrowano co najmniej dwie mapy sił. Eksperyment zależny od temperatury przeprowadzono poprzez zarejestrowanie co najmniej jednej mapy sił w każdej temperaturze. W przypadku pojawienia się tylko kilku zdarzeń rozciągania, odpowiednią dźwignię AFM odrzucano i pobierano kolejną dźwignię AFM z płytki (zazwyczaj w kolejności C, B, D i E urządzenia MLCT-Bio-DC). Dla przykładowych danych PEG w 95 z 500 zmierzonych krzywych siła-wydłużenie zaobserwowano pojedyncze zdarzenie rozciągania (19%). W przypadku PNiPAM wzór rozciągania wystąpił w 252 z 600 krzywych siła-wydłużenie (42%). Aby umożliwić lepsze porównanie krzywych siła-wydłużenie, dla każdej temperatury wygenerowano jedną krzywą główną. W tym celu wybrano wyłącznie te krzywe ze zdarzeniem rozciągania do co najmniej 500 pN, w których fluktuacje konformacyjne i efekty rozpuszczalnika są pomijalne52. Ostateczna liczba uwzględnionych rozciągnięć wyniosła 3 przy 278 K, 7 przy 298 K i 4 przy 318 K dla PEG oraz 4 przy 278 K, 3 przy 298 K i 3 przy 318 K dla PNiPAM18.
Procedura generowania krzywych wzorcowych przedstawiona jest na Rysunku 3. Wybrane krzywe siła-wydłużenie (Rysunek 3A) zostają przeskalowane do długości L0 (wydłużenie przy sile 500 pN), patrz Rysunek 3B. Piki adhezji wykazują dużą zmienność niespecyficznej adhezji między powierzchnią a końcówką dźwigni AFM, jednak nie wpływają one na charakterystykę rozciągania polimeru. Po połączeniu przeskalowanych krzywych siła-wydłużenie zostają one uśrednione poprzez wygładzanie binominalne, jak pokazano na Rysunku 3C. W tym celu filtr Gaussa splotuje dane z znormalizowanymi współczynami pochodzącymi z trójkąta Pascala na poziomie równym parametrowi wygładzania 2053. Ostatecznie dla każdej temperatury uzyskano krzywą wzorcową, jak przedstawiono na Rysunku 3D. Powiększenie pokazuje zakres, w którym wpływ temperatury na charakterystykę siła-wydłużenie jest najbardziej wyraźny.
Porównanie zachowania temperaturowego PEG (A) i PNiPAM (B) przedstawiono na Rysunku 4. W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. Przy zwiększeniu temperatury z 278 do 318 K odnotowano wzrost przeskalowanego wydłużenia o około 5% przy sile 100 pN. Dla PNiPAM stwierdzono przeciwstawne przesunięcie zależne od temperatury. Przy zwiększeniu temperatury z 278 do 328 K zaobserwowano spadek przeskalowanego wydłużenia o około 1% przy sile 100 pN. Ponadto wolną energię rozciągania można było wyznaczyć z głównych krzywych siła-wydłużenie poprzez obliczenie pola pod krzywą dla dowolnej wartości siły. Metodę tę można wykorzystać do wyodrębnienia wkładów energetycznych i entropowych wolnej energii rozciągania przy użyciu symulacji dynamiki molekularnej (MD)18.
Przykład 2: Desorpcja PS z powierzchni SAM w wodzie 
Desorpcję PS z powierzchni SAM w wodzie można wykorzystać do wyznaczenia siły i długości desorpcji, a tym samym do ilościowego określenia oddziaływania hydrofobowego. Po kalibracji zarejestrowano co najmniej dwie mapy sił w dwóch różnych miejscach powierzchni. W przypadku pomyślnego przyczepienia polimeru, krzywe siła-rozciągnięcie wykazały plateau stałej siły jako cechę charakterystyczną, patrz Rysunek 5A oraz Rysunek 5C. Desorpcja o charakterze plateau jest obserwowana, gdy dynamika badanych wiązań jest znacznie szybsza niż prędkość rozciągania grota dźwigni AFM (stan quasi-równowagi). Siły desorpcji z krzywych siła-rozciągnięcie o charakterze plateau pozwalają bezpośrednio wyznaczyć swobodną energię adhezji poprzez całkowanie śladu siła-rozciągnięcie54. Wykorzystano je do określenia oddziaływań elektrostatycznych, dyspersyjnych i hydrofobowych, a także właściwości tarcia pojedynczych polimerów na powierzchniach w środowisku ciekłym2,4,23,51,54,55.
Każdy plateau stałej siły dopasowano do krzywej sigmoidalnej w celu wyznaczenia siły desorpcji oraz długości desorpcji, które następnie przedstawiono na histogramach. Histogramy dopasowano do rozkładu Gaussa, aby wyznaczyć wartość maksymalną i odchylenie standardowe. Dla lepszego przeglądu wartości siły i długości desorpcji przedstawiono wspólnie na wykresie punktowym, jak pokazano na Rysunku 5B oraz Rysunku 5D.
W przypadku polistyrenu na SAM w wodzie wyznaczone siły desorpcji odpowiadają wartościom uzyskanym wcześniej19,23. Ponieważ długość desorpcji koreluje z długością konturową polimeru51, rozkład długości desorpcji może służyć jako dowód kowalencyjnego wiązania odpowiedniego polimeru z wierzchołkiem sondy AFM za pomocą jego funkcjonalnej grupy końcowej. Zatem długość desorpcji pełni rolę swoistego odcisku palca.
W przypadku przyczepienia więcej niż jednego polimeru do końcówki dźwigni AFM, na krzywych siła-rozciągnięcie można zaobserwować kaskady plateau (dyskretne stopnie)56. Każde plateau reprezentuje desorpcję polimeru przy innym rozciągnięciu. Eksperyment przedstawiony na Rysunku 5C oraz Rysunku 5D ukazał typowy przypadek dwóch polimerów przyczepionych do końcówki dźwigni AFM w tym samym czasie. Poprzez dopasowanie końcowego zerwania, wyznaczono bimodalny rozkład długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. W tym przypadku mniejsza długość desorpcji wystąpiła w 90% krzywych siła-rozciągnięcie, albo jako pojedyncze plateau, albo jako dodatkowe plateau na dłuższym plateau, jak pokazano na Rysunku 5C. Większa długość desorpcji wystąpiła w 37% uzyskanych krzywych siła-rozciągnięcie. Zatem rozkład długości desorpcji może być wykorzystany do określenia liczby różnych polimerów przyczepionych do końcówki dźwigni AFM. Generalnie wąski rozkład wartości długości desorpcji jest dobrą wskazówką, że w uzyskanych krzywych siła-rozciągnięcie badany był jeden i ten sam pojedynczy polimer. Jednocześnie superpozycja odpowiednich krzywych siła-rozciągnięcie może posłużyć do rozstrzygnięcia, czy pomiar dotyczył jednego i tego samego pojedynczego polimeru.
Po potwierdzeniu kowalencyjnego wiązania pojedynczego polimeru PS można przeprowadzić dalsze eksperymenty z tym polimerem PS, zmieniając substrat (powierzchnię stałą, jak i filmy polimerowe), warunki rozpuszczalnika, temperaturę, prędkość rozciągania lub czas przebywania.
<img alt="Modyfikacja końcówki dźwigni AFM: aktywacja plazmą, silanizacja, schemat przyłączania polimeru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd procesu funkcjonalizacji końcówki. Przedstawiono chemiczną modyfikację końcówki dźwigni AFM po (1) aktywacji plazmą, (2) silanizacji/PEGylacji oraz (3) przyłączeniu polimeru. Dodatkowo pokazano szczegółowe struktury chemiczne zastosowanych polimerów, mianowicie PEG, PNiPAM i PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Seria wykresów siła-rozciąganie; skorygowany proces analizy danych, wynik eksperymentalny, badanie elastyczności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Eliminacja zakłóceń w krzywych siła-rozciąganie. (A) Znalezienie krzywej siła-rozciąganie wykazującej sinusoidalny artefakt sygnału siły wzdłuż rozciągania, ale pozbawionej zdarzenia rozciągania pojedynczej cząsteczki. (B) Wybór krzywej siła-rozciąganie ze zdarzeniem pojedynczej cząsteczki, która ma zostać skorygowana o artefakt sinusoidalny. (C) Nałożenie krzywych w celu sprawdzenia, czy artefakty sinusoidalne obu krzywych rzeczywiście są zgodne. (D) Poprzez odjęcie krzywej siła-rozciąganie (A) od (B) uzyskuje się krzywą siła-rozciąganie z linią bazową o przebiegu prostym. Chociaż piku adhezji nie można wykorzystać do dalszej analizy, krzywa siła-rozciąganie jest teraz skorygowana o artefakt, co prowadzi do znacznie dokładniejszych wartości siły w obszarze zdarzenia pojedynczej cząsteczki (tutaj: rozciąganie &gt; 0.2 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wykresów siła-wydłużenie w różnych temperaturach; schemat ze skalowaniem, łączeniem i porównaniem krzywych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyznaczenie krzywych wzorcowych z krzywych siła-wydłużenie PEG w temperaturze 298 K. (A) Dane eksperymentalne w 298 K, z wykorzystaniem 7 krzywych siła-wydłużenie. Po przeskalowaniu do długości L0 przy sile 500 pN (B), krzywe siła-wydłużenie mogą zostać połączone i uśrednione poprzez wygładzanie dwumianowe w celu uzyskania krzywej wzorcowej (C). Przeskalowane krzywe przedstawiono jako kropki, natomiast krzywą wzorcową jako linię ciągłą. Ostatecznie można porównać uzyskane krzywe wzorcowe dla różnych temperatur (D). Powiększenie wskazuje zakres, w którym wpływ temperatury na charakterystykę siła-wydłużenie jest najbardziej wyraźny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres siła-rozciągnięcie w różnych temperaturach; A: 278-318K, B: 278-328K; wynik analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie temperaturozależnych krzywych głównych PNiPAM i PEG. Dla PEG obserwuje się wzrost przeskalowanego rozciągnięcia przy 100 pN (średni zakres siły) wraz ze wzrostem temperatury (A), natomiast dla PNiPAM ujawniono przeciwstawne przesunięcie zależne od temperatury (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy i histogramy spektroskopii siła-rozciąganie, analiza oddziaływań molekularnych i rozkładu danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza krzywych siła-rozciąganie PS na SAM w wodzie. (A) Przykładowa krzywa siła-rozciąganie (niebieska) z sigmoidalnym dopasowaniem plateau (fioletowe). Dodatkowo strzałki wskazują wyznaczoną siłę (czerwona) i długość (zielona) plateau. Wartości siły desorpcji i długości desorpcji uzyskane za pomocą dopasowań sigmoidalnych przedstawiono na wykresie punktowym, a wynikowe histogramy dopasowano do rozkładu Gaussa. (B) Wyznaczone średnie wartości siły desorpcji i długości desorpcji wynoszą odpowiednio (112 ± 6) pN oraz (659 ± 7) nm, przy czym 93% krzywych siła-rozciąganie wykazuje takie pojedyncze zdarzenia plateau. (C) Przykładowa krzywa siła-rozciąganie (niebieska) dla dwóch polimerów przyłączonych do końcówki dźwigni AFM w tym samym czasie. Tutaj siła desorpcji wykazuje rozkład unimodalny ze średnią wartością siły (117 ± 5) pN, podczas gdy dla długości desorpcji stwierdzono rozkład bimodalny, prowadzący do średnich wartości długości (656 ± 9) nm i (1050 ± 16) nm. (D) 90% pobranych próbek krzywych siła-rozciąganie wykazuje wyłącznie pojedyncze zdarzenia plateau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek umożliwia nam pomiar parametrów fizycznych, które opisują właściwości mechaniczne i adhezyjne polimerów. W przypadku korzystania ze spektroskopii sił opartej na AFM do badania pojedynczych cząsteczek, niezbędne jest posiadanie niezawodnego i wydajnego protokołu kowalencyjnego wiązania tych cząsteczek z końcówką wspornikową AFM. Protokół ten można zastosować do wielu różnych polimerów, niezależnie od długości konturu czy hydrofobowości.Wszystkie czynności należy wykonywać w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane jest szkło odporne na rozpuszczalniki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Najpierw użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej.Uruchom program aktywacji powierzchni komory plazmowej, wybierając start, a następnie tak. Sprawdź, czy proces plazmowy działa prawidłowo. Proces plazmowy o wysokiej zawartości tlenu ma jasnoniebieski kolor.Podczas wykonywania programu aktywacji powierzchniowej rozpuść silan-PEG-mal w toluenie, aby uzyskać stężenie 1,25 miligrama na mililitr. Umieść trzy mililitry roztworu na płaskiej szalce Petriego. Po zakończeniu procesu plazmowego przewietrz komorę plazmową, wybierając opcję potwierdź, a następnie odpowietrzaj.Przejdź natychmiast do następnego kroku, aby zapobiec wchłanianiu zanieczyszczeń. Umieść frytki na szalce Petriego i inkubuj je przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i pozwól jej ostygnąć przez co najmniej 10 minut.Następnie opłucz frytki. W przypadku wiązania PEG lub polistyrenu należy trzykrotnie spłukać wióry toluenem. W przypadku wiązania polinipamu wióry należy przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.Aby zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM, podczas płukania należy lekko przechylić wióry. Wióry wspornikowe AFM muszą być odpowiednio wypłukane, aby usunąć nadmiar polimerów fizycznych, które mogą mieć wpływ na eksperyment. Płukanie należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu wsporników AFM.Na koniec przygotuj co najmniej dwa wióry, które będą służyć jako kontrole, które nie będą poddawane kowalencyjnemu przyłączeniu polimerowemu. W przypadku kontroli w porównaniu z wiórami PEG i polistyrenu spłucz dwukrotnie etanolem i raz wodą. W przypadku kontroli w porównaniu z chipsami z polinipamu, spłucz dwukrotnie wodą.Aby wykonać kowalencyjne mocowanie PEG lub polistyrenu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w toluenie o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj chipsy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji z PEG lub polistyrenem pozwól frytkom ostygnąć przez 10 minut.Wióry opłucz dwukrotnie toluenem, dwa razy etanolem i raz wodą. Aby wykonać kowalencyjne przyłączenie polinipamu, przygotuj trzy mililitry roztworu polimeru w etanolu o stężeniu 1,25 miligrama na mililitr. Dodaj roztwór i frytki na szalkę Petriego i inkubuj frytki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.Po inkubacji z polinipamem spłucz frytki dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą. Aby przechowywać chipsy do czasu wykorzystania w eksperymencie, umieść każdy chips osobno na mililitrowej szalce Petriego wypełnionej wodą. Utrzymuj szalki Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Najpierw włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do uchwytu na wióry. Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiarów w cieczy. Użyj pipety, aby zanurzyć chip w wodzie.Zamontuj powierzchnię próbki w AFM. Zanurz powierzchnię próbki w wodzie. Podłącz uchwyt na wióry do AFM.Następnie zbliż chip do powierzchni próbki. Użyj panelu środowiskowego, aby ustawić temperaturę docelową i włączyć przyciski opcji trybu i sprzężenia zwrotnego. Następnie pozwól systemowi zrównoważyć się przez około 15 minut.Aby wykonać krzywą wydłużenia siły, zbliż końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybierz pojedynczą siłę. Wynikowa krzywa przedstawia ugięcie w stosunku do odległości piezoelektrycznej z podejściem do powierzchni pokazanym na czerwono i wycofaniem pokazanym na niebiesko. Rozszerz część krzywej, która reprezentuje wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem.Aby wykonać dopasowanie liniowe, ustaw kursory na krzywej podejścia lub krzywej cofania i wybierz opcję Aktualizuj INVOLS z menu kontekstowego. Wynikowa wartość odwrotnej czułości dźwigni optycznej jest wyświetlana w panelu w lewym górnym rogu. Po powtórzeniu tej procedury co najmniej pięć razy oblicz średnią dla odwrotnej czułości dźwigni optycznej i wprowadź średnią w panelu.Ustaw wspornik AFM na wysokości około 100 mikrometrów nad powierzchnią, wybierając ruch, aby wstępnie włączyć. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu dla widma szumu termicznego, ustaw liczbę uśredniania na co najmniej 10 i wybierz najwyższą możliwą rozdzielczość częstotliwości. Następnie zarejestruj widmo szumu termicznego, wybierając opcję przechwytywania danych termicznych.Aby dopasować widmo szumu termicznego do prostej funkcji oscylatora harmonicznego, rozwiń część krzywej reprezentującą pierwszy pik rezonansowy. Następnie wybierz opcję Zainicjuj dopasowanie. Na koniec doprecyzuj dopasowanie za pomocą przycisku danych termicznych dopasowania.Odpowiednia stała siły pojawi się w panelu. Aby rozpocząć zbieranie danych, ustaw parametry eksperymentu. Ustaw prędkość ciągnięcia na jeden mikrometr na sekundę i wymuś spust na jeden nanoniuton.Zbliżyć końcówkę wspornika AFM do powierzchni i wybrać pojedynczą siłę, aby zarejestrować pojedynczą krzywą i określić, czy parametry należy dostosować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wybierz mapę F z panelu głównego. Aby uzyskać mapę sił ze 100 krzywymi, należy ustawić liczbę punktów sił i linii sił na 10.Rozpocznij nagrywanie mapy siły, wybierając opcję do mapy F. Weź krzywe wydłużenia siły w sposób przypominający siatkę, aby uniknąć lokalnych efektów powierzchni i uśrednić różne obszary powierzchni. Po doświadczeniu powtórz wyznaczanie odwrotnej czułości dźwigni optycznej i stałej sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.Pojedyncze polimery polinipamu i PEG zostały kowalencyjnie związane z końcówką wspornika AFM na jednym końcu i fizjosorbowane na powierzchni dwutlenku krzemu na drugim końcu. Aby zmierzyć rozciąganie zależne od temperatury, zidentyfikowano wyraźne zdarzenie rozciągania pojedynczej cząsteczki, po którym następuje końcowe maksimum na końcu odpowiedniej krzywej wydłużenia siły. Następnie generowana była jedna krzywa wzorcowa dla każdej temperatury.W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku polinipamu zaobserwowano odwrotną tendencję. Desorpcja polistyrenu z powierzchni SAM w wodzie może być wykorzystana do określenia siły i długości desorpcji.Gdy mocowanie polimeru zakończyło się sukcesem, krzywe wydłużenia siły wykazywały plateau stałej siły. Każdy plateau został wyposażony w krzywą sigmoidalną w celu określenia siły desorpcji i długości desorpcji. Obserwowane siły desorpcji odpowiadały wcześniej uzyskanym wartościom.Gdy więcej niż jeden polimer był przymocowany do końcówki wspornika AFM, zaobserwowano kaskady płaskowyżów na krzywych wydłużenia siły. Po przyłączeniu dwóch polimerów stwierdzono rozkład bimodalny dla długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. Funkcjonalizowana końcówka wspornikowa AFM może być używana do ilościowego określania odpowiedzi siłowej pojedynczych cząsteczek w środowisku ciekłym i przy bodźcach zewnętrznych.Stosowanie czystego sprzętu, rozpuszczalników, końcówek wysięgników AFM i wielokrotne płukanie jest bardzo ważne dla osiągnięcia wysokiego poziomu czystości, który powinien zostać potwierdzony przed opisanymi kontrolowanymi eksperymentami. Zaprezentowane protokoły i procedury utorowały drogę do lepszego zrozumienia systemów polimerowych reagujących na bodźce. Wyniki można bezpośrednio porównać z symulacjami dynamiki molekularnej.

covalent-attachment-single-molecules-for-afm-based-force

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Opisujemy metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Protokół ten obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację powierzchni i powlekanie PEG. Wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach, co zapewnia lepszą jakość pasywacji w porównaniu z istniejącymi metodami.

Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Opisujemy metodę skutecznego unieruchamiania BMP-2 na powierzchniach. Nasze podejście opiera się na tworzeniu samoorganizującej się monowarstwy w celu uzyskania kowalencyjnego wiązania BMP-2 poprzez jego wolne reszty aminowe. Ta metoda jest użytecznym narzędziem do badania sygnalizacji na błonie komórkowej.

Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Nanocząstki krzemionki zostały przygotowane przy użyciu katalizy kwasowej prekursora siloksanu i technik syntezy wspomaganych mikrofalami, co spowodowało kontrolowany wzrost nanomateriałów o średnicy od 30 do 250 nm. Dynamikę wzrostu można kontrolować, zmieniając początkowe stężenie kwasu krzemowego, czas reakcji i temperaturę reakcji.

Otrzymywanie nanocząstek krzemionki za pomocą katalizy kwasowej wspomaganej mikrofalami

Kawitacja akustyczna w cieczach poddanych działaniu ultradźwięków tworzy przejściowe ekstremalne warunki wewnątrz zapadających się pęcherzyków, które są źródłem niezwykłej reaktywności chemicznej i emisji światła, znanej jako sonoluminescencja. W obecności gazów szlachetnych powstaje plazma nierównowagowa. "Gorące" cząstki i fotony generowane przez zapadające się pęcherzyki są w stanie wzbudzić gatunki w roztworze.

Aktywacja cząsteczek, jonów i cząstek stałych za pomocą kawitacji akustycznej

Poznaj protokół kowalencyjnego przyłączania polimerów do grotów dźwigników AFM do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Metoda umożliwia precyzyjne pomiary właściwości mechanicznych polimerów z dużą powtarzalnością.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Przeglądaj więcej filmów