Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Technika ta służy jako podstawowa metoda w eksperymentach mających na celu zbadanie rozwoju embrionalnego lub larwalnego świerszcza. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest elastyczna i obsługuje kilka rodzajów podejść eksperymentalnych, takich jak te wykorzystujące interferencję RNA lub manipulację genomem. Procedurę zademonstruje Hadley Wilson Horch, główny badacz w laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, zwilż obracającą się płaszczyznę młynka ukosowarki kapiącą wodą. Umieść wyciągniętą igłę w ukosownicy i obróć ją pod kątem 20 stopni. Opuść igłę, aż dotknie płyty szlifierskiej i ukosuj ją przez dwie do trzech minut.

Oceń skos, umieszczając skośną igłę na podwójnej taśmie klejącej, która została przyklejona do szklanego szkiełka mikroskopowego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu złożonego wyposażonego w kamerę i oprogramowanie do akwizycji obrazu. Uzyskaj obraz igły za pomocą obiektywu 20x.

Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zmierzyć wewnętrzną średnicę światła igły tuż proksymalnie do skośnego otworu. Wyrzucić wszelkie igły z otworem mniejszym niż osiem mikrometrów lub większym niż 12 mikrometrów. Najpierw przygotuj 40 mililitrów 1% agarozy w wodzie i wlej ją do 10-centymetrowej szalki Petriego.

Umieść stempel jaja na powierzchni agarozy, zanim zastygnie. Gdy agaroza zastygnie, usuń stempel, aby odsłonić dołki. Następnie napełnij płytkę dołka agarozowego HBS zawierającym 1% penicylinę streptomycynę.

Przykryj naczynie pokrywką, zawiń ją w Parafilm i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego białym piaskiem z placu zabaw, aby przygotować naczynie do zbierania jaj, w którym świerszcze będą mogły składać jaja. Przykryj naczynie na jajka ręcznikiem papierowym pod kątem kwadratowym przyciętym na około 18 na 18 centymetrów.

Napełnij wodą z kranu przez ręcznik papierowy. Następnie przechyl szalkę Petriego i delikatnie ściśnij górną część, aby usunąć nadmiar wody. Wsuń rogi ręcznika papierowego pod kwadrat pod naczynie i umieść naczynie do jajek w odwróconej pokrywce, która pomoże utrzymać ręcznik papierowy na miejscu.

Umieść naczynie na jajka w pojemniku na świerszcze i pozwól dorosłym samicom złożyć jaja przez jedną do dwóch godzin. W międzyczasie pozwól naczyniu z agarozą ogrzać się do temperatury pokojowej, przygotowując się do trzymania jaj do wstrzykiwań. Gdy będziesz gotowy, wyjmij naczynie do zbierania jaj, zawierające teraz świeżo złożone jaja, z pojemnika na świerszcze.

Zdejmij ręcznik papierowy i umieść sitko o wielkości porów od 0,5 do jednego milimetra nad zlewką. Zawartość naczynia do składania jaj opłucz na sitku pod delikatnie płynącą wodą z kranu. Ziarna piasku spadną przez siatkę sitka do zlewki poniżej, podczas gdy jaja świerszcza pozostaną w koszu sitka.

Napełnij pojemnik wodą z odwróconej osmozy i umieść go na tacy. Odwróć sitko nad pojemnikiem i postukaj nim o naczynie, aby usunąć jajka z wody. Jajka opadną na dno pojemnika.

Następnie za pomocą nożyczek odetnij końcówkę końcówki pipety P1000, aby zrobić otwór o średnicy około trzech milimetrów. Umieść tę końcówkę na pipetrze P1000 i użyj jej do przeniesienia jaj z pojemnika do naczynia z foremek na jajka z agarozy. Za pomocą plastikowej pęsety ułóż jajka w dołkach agarozowych.

Każde jajko opadnie na dno pojedynczej studni. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, aż będzie gotowa do wstrzyknięcia. Na początek umieść miskę z jajkami pod mikroskopem preparacyjnym i wybierz małe powiększenie około 10x.

Pobrać 1,5 mikrolitra roztworu do wstrzykiwań za pomocą 20 mikrolitrowych końcówek nasycających i pipety P10 i włożyć końcówkę ładującą do szerokiego końca igły do wstrzykiwań. Wylać roztwór do wstrzykiwań do igły do wstrzykiwań. Włóż igłę do obudowy iniekcyjnej i dokręć, upewniając się, że igła jest prawidłowo i mocno włożona do obudowy.

Następnie ostrożnie włożyć obudowę iniekcji do mikromanipulatora, uważając, aby nie złamać się lub nie zostać zranionym przez igłę. Patrząc zarówno na jajka, jak i igłę przez mikroskop, przesuń igłę w pobliże X w lewym górnym rogu siatki naczynia. Opuścić igłę, aż końcówka wejdzie do roztworu buforowanego spawopicyną HBS i penicyliny w naczyniu.

Wyśrodkuj igłę w polu widzenia i przesuń naczynie na jajka tak, aby igła znajdowała się kilka milimetrów bliżej krawędzi naczynia niż jajka. Następnie ustaw mikroskop na filtr odpowiedni dla rodaminy, aby obserwować fluorescencję igły i skupić się na jej końcówce. Na mikrowstrzykiwaczu powoli obracać pokrętło balansu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wyciekać z igły do roztworu zawiesiny.

Następnie lekko przekręć pokrętło z powrotem w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż barwnik przestanie wyciekać z igły. Trzymając igłę wyśrodkowaną w polu view, przesuń miskę na jajka tak, aby igła była skierowana na jajko, które ma być wstrzyknięte jako pierwsze. Dostosuj powiększenie do około 50x, aby pojedyncze jajko wypełniło większość pola widzenia.

Za pomocą mikromanipulatora i dłoni należy przyłożyć miskę do jajek, aby przesunąć igłę na miejsce do wstrzyknięcia. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę i włóż końcówkę do pierwszego jaja, które ma zostać wstrzyknięte, upewniając się, że igła została wprowadzona na 20 do 30% długości jaja od tylnego końca jaja prostopadle do długiej osi jaja. Wstrzyknąć roztwór za pomocą pedału nożnego do wstrzykiwań lub przycisku wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu.

Mały bolus materiału fluorescencyjnego wewnątrz jaja będzie wskazywał na udane wstrzyknięcie. Następnie wycofaj igłę z jajka. Jeśli jajo zostanie przypadkowo wyjęte z dołka po wycofaniu igły, użyj małych kleszczy, aby wepchnąć jajo z powrotem do studzienki, jednocześnie chowając igłę.

W tym badaniu jaja świerszczy są wstrzykiwane przy użyciu techniki, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach, w tym między innymi w interferencji RNA i manipulacji genomem. Wskaźnik przeżycia jest jednym z ważnych parametrów oceny powodzenia tego eksperymentu. Większość martwych jaj można łatwo zidentyfikować wzrokiem, ponieważ żółtko i tkanka embrionalna w jaju zaczynają się nierównomiernie zbrylać, a ostatecznie większość żółtka migruje na jedną stronę jaja.

Oceniając po czterech do sześciu dniach, przeżyło ponad 85% niewstrzykniętych jaj, podczas gdy jaja wstrzyknięte eksperymentalnymi odczynnikami miały na ogół niższy wskaźnik przeżycia. Kontrolowanie wszystkich aspektów samego wstrzyknięcia, w tym nakłucia igły, wprowadzenia barwnika i buforu lub obecności nośnika lub dwuniciowego RNA, jest wymagane w celu zrozumienia prawdziwych skutków próby manipulacji eksperymentalnej. Sposób, w jaki ocenia się fenotypowe wyniki wstrzyknięcia, zależy od tego, co zostało wstrzyknięte.

Na przykład zmiany fenotypowe w wyniku specyficznych knockdownów mRNA mogą być oczywiste na poziomie anatomii ogólnej. Z drugiej strony, jeśli cDNA kodujące gen histonu 2B znakowany EGFP pod kontrolą promotora aktyny G.bimaculatus zostanie wstawiony do genomu świerszcza za pomocą transpozazy piggyback, możliwe staje się uwidocznienie każdego jądra w jaju za pomocą fluorescencji w celu wzbudzenia białka hist 2B znakowanego EGFP. Regulacja balansu, aby igły się nie zatykały, jest kluczowym krokiem w tej procedurze.

Po kolejnych wstrzyknięciach może być konieczne dokonanie kilku korekt, ponieważ żółtko czasami zatyka końcówkę igły. Świerszcz jest owadem półmetabolicznym, który rozgałęzia się zasadniczo na dobrze zbadane owady holometaboliczne, takie jak Drosophila. Badanie rozwoju świerszcza pomoże nam lepiej zrozumieć ewolucję i rozwój w całym królestwie zwierząt.

Ta technika wymaga trochę praktyki. Zalecamy wykonywanie iniekcji kontrolnych do momentu, gdy wskaźnik przeżycia cztery lub pięć dni po wstrzyknięciu wyniesie co najmniej 80%