Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

W tym filmie opisujemy badanie modelowe dotyczące mechanizmu toksyczności amyloidu na poziomie błony przy użyciu mitochondriów mózgu szczura jako modelu biologicznego in vitro. Pomimo narastającego doniesienia opisującego mechanizm zaburzeń błon przez agregat amyloidowy w modelowych układach fosfolipidowych, badano bezpośrednio zdarzenia rozpoczynające się od rozwoju błony biologicznej. W niniejszym filmie opisujemy włókienka amyloidowe alfa-synukleiny, analizując błonę mitochondriów mózgu szczura jako model biologiczny in vitro.

Uważamy, że mitochondria jako organelle z dobrze scharakteryzowanymi błonami mogą stanowić niezwykle przydatny system modelu biologicznego do badań molekularnych związanych z mechanizmem cytotoksyczności amyloidu na poziomie błony w odniesieniu do chorób neurodegeneracyjnych. Odetnij głowę szczura gilotyną dla małych zwierząt i usuń mózg z wagi w ciągu jednej minuty od dekapitacji szczura, aby ograniczyć możliwe pogorszenie właściwości mitochondriów. Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać wszystko na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.

Przemyć tkankę dwukrotnie 30 mililitrami buforu izolacyjnego. Przenieść do zlewki zawierającej zimny bufor izolacyjny i drobno zmielić mózg nożyczkami. Przenieś zawiesinę tkankową do 20-mililitrowego homogenizatora odbijanego na zimno.

Homogenizuj kawałki tkanki za pomocą dziewięciu ruchów w górę iw dół za pomocą zmotoryzowanego tłuczka. Pozostaw mieszaninę na lodzie na około 30 sekund po każdej serii trzech ruchów homogenizacji, aby upewnić się, że homogenat pozostaje zimny. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej i odwirować przy stężeniu 1,300 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Ostrożnie zdekantować supernatant i przenieść go do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej. Wirować w temperaturze 21 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w podłożu o gradiencie gęstości, delikatnie mieszając mieszaninę pipetą.

Wirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 30, 700 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą pipety Pasteura usuń ostry koniec materiału nagromadzonego na górze, który w większości zawiera mielinę. Dodać osiem mililitrów buforu izolacyjnego do frakcji mitochondrialnej, delikatnie mieszając mieszaninę pipetą.

Wirować w temperaturze 16, 700 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając luźny osad na dnie nienaruszony. Dodaj jeden mililitr 10 miligramów na mililitr BSA wolnego od kwasów tłuszczowych do probówki wirówkowej, delikatnie mieszając mieszaninę końcówką pipety.

Uzupełnić objętość do pięciu mililitrów, dodając bufor izolacyjny. Wirować w temperaturze 6 900 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. To powinno dać twardy osad.

Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad mitochondrialny w buforze izolacyjnym. Rozcieńczyć homogenat mitochondrialny do jednego miligrama na mililitr za pomocą zimnego buforu izolacyjnego i umieścić w dwóch probówkach o pojemności 1,5 mililitra, zwykle 195 mikrolitrów mitochondriów na probówkę. Dodaj pięć mikrolitrów 20% objętości na objętość Triton X-100 do jednej probówki jako pozytywną kontrolę dla maksymalnej aktywności enzymu i pięć mikrolitrów wody dejonizowanej do innej probówki w celu kontroli, a następnie wymieszaj z mieszadłem.

Inkubować probówki przez 10 minut w ciepłej łaźni wodnej ustawionej na 30 stopni Celsjusza. Mitochondria osadów przez odwirowanie probówek w wirniku o stałym kącie nachylenia w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Ostrożnie zebrać otrzymane supernatanty w celu oceny aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej jabłczanu przy użyciu standardowego testu spektrofotometrycznego opisanego w następnej części.

Oblicz integralność błony mitochondrialnej w następujący sposób. Do oznaczania aktywności dehydrogenazy jabłczanowej pipetować 890 i 880 mikrolitrów 50 milimolowych Tris-HCL do ślepej próby i kuwet testowych próbek, a następnie odpowiednio 100 mikrolitrów 50 milimolowego szczawiooctanu i 10 mikrolitrów 10 milimolowych beta-NADH. Umieść kuwety w spektrofotometrze i odnieś się do ślepej próby.

Dodaj 10 mikrolitrów homogenatu mitochondrialnego po jednym miligramie na mililitr do kuwety na próbkę. Natychmiast wymieszaj przez odwrócenie. Rekordowy spadek absorbancji spowodowany utlenianiem NADH przy 340 nanometrach przez jedną minutę.

W przypadku migotania amyloidu alfa-synukleiny dodaj 294 mikrolitry roztworu białkowego, 200 mikromolowych do każdej 1,5 mililitrowej probówki. Następnie dodaj sześć mikrolitrów roztworu ThT na jeden milimol. Wymieszać roztwory i inkubować probówki w termomikserze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu przy 800 obr./min.

W przypadku migotania amyloidu insuliny bydlęcej dodać 637 mikrolitrów roztworu białkowego, 250 mikromolowych do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 13 mikrolitrów roztworu ThT jeden milimol, a następnie wymieszaj. Dodaj podwielokrotności 200 mikrolitrów roztworów białkowych do każdego dołka na przezroczystej 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem.

Uszczelnij płytkę krystalicznie czystą taśmą uszczelniającą. Załadować płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych Cytation 5. Mierz fluorescencję ThT w 30-minutowych odstępach przez 12 godzin.

Użyj wzbudzenia przy 440 nanometrach i emisji przy 485 nanometrach. Wybierz studnie. Potrząsaj płytką przez pięć sekund przed każdym pomiarem.

Ustaw temperaturę na 57 stopni Celsjusza bez mieszania. Przygotuj dwie serie 1,5 mililitrowych probówek zawierających homogenaty mitochondrialne, jedną serię do testu uwalniania MDH, a drugą do pomiaru mitochondrialnego ROS. Dodać porcje świeżych lub amyloidowych włókienek alfa-synukleiny, insuliny bydlęcej lub lizozymu białka jaja kurzego do homogenatu mitochondrialnego, a następnie delikatnie pipetować.

Inkubować probówki zawierające zawiesiny mitochondrialne przez 30 minut w ciepłej łaźni wodnej ustawionej na 30 stopni Celsjusza. W przypadku testu uwalniania dehydrogenazy jabłczanowej odwirować inkubowane homogenaty mitochondrialne w stężeniu 16 000 G przez 15 minut. Ostrożnie zebrać otrzymane supernatanty do oznaczenia aktywności mitochondrialnego MDH, jak opisano w czwartej części sekcji protokołu.

Oblicz uwalnianie MDH w następujący sposób. Do pomiaru ROS mitochondriów należy pobrać pipetę 191 mikrolitrów inkubowanego homogenatu mitochondrialnego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Dodaj cztery mikrolitry 50 mikromolowych DCFDA.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów 200-milimolowego bursztynianu. Inkubować płytkę przez 30 minut w ciepłej łaźni wodnej ustawionej na 30 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Załaduj płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych Cytation 5 i zmierz intensywność fluorescencji zgodnie z sekcją protokołu.

Integralność błony mitochondrialnej oceniano, mierząc aktywność MDH w izolowanych mitochondriach przed i po przerwaniu błony i uwolnieniu enzymu przez Triton X-100. Jak widzisz, zazwyczaj stwierdzaliśmy, że preparaty mitochondrialne są w około 93% nienaruszone. Test fluorescencji ThT przeprowadzono w celu monitorowania wzrostu włókienek amyloidowych.

Krzywa migotania amyloidu trzech białek wykazała typowy wzór sigmoidalny, osiągający plateau po około 96, 12 i 96 godzinach odpowiednio dla alfa-synukleiny, insuliny bydlęcej i lizozymu białka jaja kurzego, co sugeruje tworzenie włókienek amyloidowych, które było bardziej potwierdzone przez pomiar AFM. Możliwe przenikanie i uszkodzenie błony mitochondrialnej przez włókienka amyloidowe badano poprzez uwalnianie mitochondrialnego MDH i pomiar mitochondrialnego ROS. Jak widać na lewym wykresie, znaczne uwalnianie MDH zaobserwowano po dodaniu włókien amyloidowych alfa-synukleiny do mitochondriów.

Podczas gdy włókienka insuliny wykryły niewielkie uwalnianie, włókienka lizozymu z białka jaja kurzego okazały się nieskuteczne. Prawy wykres pokazuje wpływ włókienek amyloidowych na zawartość mitochondrialnych ROS. Chociaż nie zaobserwowano znaczącego wzrostu mitochondrialnych ROS po dodaniu lizozymu białka jaja kurzego lub włókien amyloidu insuliny, leczenie włókienkami alfa-synukleiny doprowadziło do znacznego wzrostu zawartości ROS w mitochondriach mózgu.

Niniejszy film opisuje modelowe badanie mechanizmu cytotoksyczności zagregowanej kości strzałkowej na poziomie błony, pokazując, w jaki sposób fibryle amyloidowe powstające z różnych białek mogą powodować różne stopnie uszkodzenia błony i przepuszczalności. Podczas gdy niektóre tematy włókien amyloidowych i ich specyficznej błony wiążącej wydają się zapewniać zdolność do interakcji i powodowania destabilizacji i późniejszych zaburzeń błon. Po tym filmie będziesz mógł zbadać interakcję natywnych, prefibrylarnych i dojrzałych włókien amyloidowych różnych peptydów oraz z mitochondriami wyizolowanymi z różnych tkanek lub różnych obszarów mózgu.