Name: Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj metody identyfikacji inhibitorów wnikania wirusa Coxsackie A16 przy użyciu testów wnikania i analizy dokowania molekularnego. Protokół ten umożliwia odkrywanie małych cząsteczek o właściwościach przeciwwirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Joshua Beckhamowi z University of Texas w Austin za wsparcie techniczne przy dokowaniu molekularnym. Badanie to było częściowo wspierane przez finansowanie z Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (MOST107-2320-B-037-002 dla C.-J.L. i L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 i MOST107-2320-B-038-034-MY3 do L.-T.L.).

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe i infekcje wirusowe muszą być przeprowadzane w certyfikowanych kapturach bezpieczeństwa biologicznego, które są odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego próbek, z którymi się obchodzimy. Dwie małe cząsteczki z klasą taniny, kwas chebulagowy () i punikalagina (PUG), które, jak zaobserwowano, skutecznie blokują infekcję CVA169, są używane jako przykłady potencjalnych środków hamujących. Aby zapoznać się z podstawowymi zasadami technik wirusologicznych, rozprzestrzenianiem się wirusa, określaniem miana wirusa oraz pojęciami jednostek tworzących blaszkę (PFU) lub wielości infekcji (MOI), czytelnik jest odsyłany do reference10.
1. Hodowla komórkowa, preparat wirusa, preparat złożony i cytotoksyczność złożona
<ol>
	<li>Ludzkie komórki mięsaka prążkowanokomórkowego (RD) są komórkami gospodarza podatnymi na infekcję CVA1611. Hoduj komórki RD w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny G, 200 μg/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B w kolbach T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotować CVA16 poprzez namnażanie wirusa w komórkach RD i określić miano wirusa w PFU/ml. Aby zoptymalizować protokół, zapoznaj się z reference11.</li>
	<li>Przygotować badane związki i kontrole, używając ich odpowiednich rozpuszczalników: na przykład rozpuścić i PUG w dimetylosulfotlenku (DMSO). Dla wszystkich etapów infekcji podłoże podstawowe składało się z DMEM plus 2% FBS i antybiotyków. 
	nuta: Końcowe stężenie DMSO w traktowaniu badanym związkiem jest równe lub mniejsze niż 0,25% w doświadczeniach; 0,25% DMSO jest uwzględnione jako leczenie kontrolą ujemną w testach dla porównania.</li>
	<li>Przeprowadzić test cytotoksyczności badanych związków na komórkach RD przy użyciu odczynnika określającego żywotność komórek, takiego jak XTT (((2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-5-fenyloamino)-karbonylo]-2H-tetrazolowy wodorotlenek). Szczegółowy protokół można znaleźć na stronie reference12. Określić stężenia cytotoksyczności badanych związków za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak GraphPad Prism, zgodnie z protokołem producenta. Stężenia leków, które nie wpływają znacząco na żywotność komórek ( ≥95% żywotnych komórek) są wykorzystywane do pozostałej części badania.</li>
</ol>
2. Test czasu dodania leku
<ol>
	<li>Ocena wpływu leków na komórki gospodarza przed infekcją wirusową (leczenie wstępne)
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.</li>
		<li>Traktować komórki RD związkami testowymi w stężeniach niecytotoksycznych (określonych od kroku 1.4) w 1 ml objętości podłoża podstawowego przez 1 godzinę lub 4 godziny.</li>
		<li>Przemywać komórki 1-2 ml PBS przed dodaniem 50 PFU/studzienkę wirusa w pożywce podstawowej (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl) przez 1 godzinę. Kołysz płytką co 15 minut.</li>
		<li>Po zakażeniu ponownie przemyć monowarstwy za pomocą PBS, a następnie nałożyć 1 ml podłoża podstawowego zawierającego 0,8% metylocelulozy do dalszej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Po 72 godzinach inkubacji usunąć pożywkę wierzchnią i umyć studzienki za pomocą 2 ml PBS.</li>
		<li>Napraw studzienki za pomocą 0,5 ml 37% formaldehydu przez 15 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie przemyć za pomocą PBS.</li>
		<li>Zabarwić studzienki za pomocą 0,5 ml 0,5% roztworu fioletu krystalicznego. Następnie usuń roztwór plamy w ciągu 2 minut i umyj studzienki delikatnym strumieniem wody przed wysuszeniem na powietrzu.</li>
		<li>Policz blaszki wirusowe, umieszczając płytkę na pudełku z białym światłem. Oblicz procentowy (%) zakażenie CVA16 w następujący sposób: (Średnia # wirusa płytki nazębnej + lek / Średnia # wirusa płytki nazębnej + kontrola DMSO) × 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wpływu jednoczesnego dodawania leków i wirusa (koaddycja)
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.</li>
		<li>Traktować komórki RD związkami testowymi w odpowiednich stężeniach i 50 PFU/basenik CVA16 jednocześnie przez 1 godzinę (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl). Kołysz płytką co 15 minut.</li>
		<li>Przemyć komórki 1 ml PBS, a następnie nałożyć na 1-2 ml podłoża podstawowego zawierającego 0,8% metylocelulozy w celu dalszej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Zabarwić blaszki wirusowe fioletem krystalicznym po 72 godzinach od zakażenia i określić % infekcji CVA16 zgodnie z powyższym opisem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena skuteczności leczenia farmakologicznego po wniknięciu wirusa (po zakażeniu)
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.</li>
		<li>Zaszczepić komórki RD 50 PFU/studzienkę CVA16 (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl) przez 1 godzinę. Kołysz płytką co 15 minut.</li>
		<li>Przemyć studzienki 1-2 ml PBS i pokryć komórki pożywką podstawową zawierającą 0,8% metylocelulozy i odpowiednimi stężeniami badanych związków.</li>
		<li>Zabarwić blaszki wirusowe fioletem krystalicznym i policzyć po 72 godzinach od zakażenia i określić % inkubacji infekcji CVA16 opisanych powyżej. 
		nuta: Wszystkie mycia PBS wykonuj delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test wiązania oparty na cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić monowarstwę komórek w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zakażone komórki RD CVA16 (MOI = 100) w obecności i bez badanych związków przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Przeprowadzić inokulację wirusa na lodzie i następującą po niej inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C w celu utrzymania temperatury na poziomie 4 °C, co pozwala na wiązanie wirusa, ale nie na wnikanie.</li>
	<li>Usunąć inokulum wirusa i przemyć raz 1-2 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Podnieś komórki, dodając 1 ml lodowatego buforu dysocjacyjnego do studzienek na lodzie na 3 minuty, przed zebraniem komórek i ponownym ich umieszczeniem w lodowatym buforze cytometrii przepływowej (1x PBS plus 2% FBS).</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie za pomocą lodowatego buforu cytometrii przepływowej i utrwal komórki 0,5 ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut na lodzie.</li>
	<li>Przemyć komórki za pomocą PBS w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych lub słabo związanych wirusów, a następnie wybarwić komórki 1 ml przeciwciała anty-VP1 (1:2000; rozcieńczonego PBS zawierającego 3% BSA) na lodzie przez 1 godzinę, a następnie inkubować z drugorzędową anty-mysią IgG sprzężoną z Alexa 488 (1:250; rozcieńczoną w PBS zawierającym 3% BSA) na lodzie przez 1 godzinę. Wykonać płukanie PBS (3 razy) po każdym leczeniu przeciwciałami.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml lodowatego bufora cytometrii przepływowej i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym przy użyciu standardowych procedur. Prezentuj dane na histogramach za pomocą powiązanego oprogramowania i określaj ilościowo w celu reprezentacji wykresu słupkowego.</li>
</ol>
4. Test inaktywacji wirusów
<ol>
	<li>Wykonaj test inaktywacji wirusa zgodnie z wcześniejszym opisem12, stosując następujące warunki: 
	- Stężenie wyjściowe 106 PFU/ml CVA16. 
	- Monowarstwy komórek RD w płytkach 12-dołkowych o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. 
	- 50-krotne rozcieńczenie do miareczkowania związków leczniczych, w wyniku czego końcowe stężenie wirusa wynosi 50 PFU/basen. 
	- Umyj etapy przy użyciu 1-2 ml PBS. 
	- Podłoża nakładkowe zawierające 0,8% metylocelulozy.</li>
	<li>Wykonaj ostateczny odczyt infekcji wirusowej za pomocą procedury barwienia blaszek wirusowych fioletem krystalicznym, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Molekularna analiza dokowania
<ol>
	<li>Pobierz cząsteczki 3D badanych związków z PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Jeśli cząsteczki nie mają wgranej struktury 3D, pobierz struktury 2D lub użyj sekwencji ciągów SMILES i przekształć je w cząsteczki 3D za pomocą programu molekularnego (np. CORINA).</li>
	<li>Pobierz biologiczny zespół wirusów z Banku Danych Białkowych RCSB (https://www.rcsb.org/) i przygotuj model struktury wirusa za pomocą programu biokomputerowego (np. UCSF Chimera). Na przykład w przypadku dojrzałej struktury krystalicznej wirionu CVA16 (PDB: 5C4W)3, usuń rozpuszczalniki z pliku PDB, zastąp niekompletne łańcuchy boczne danymi z biblioteki Rotamer Dunbrach 2010 i dodaj wodory i ładunki do struktury, jak wcześniej zgłoszono13. Obiektami docelowymi mogą być dowolne białka wirusowe istotne dla zamierzonej analizy wraz z informacjami o złożeniu biologicznym (Bank Danych o Białkach).</li>
	<li>Zadokuj związki testowe na przygotowanej jednostce wirusa, używając na przykład UCSF Chimera i przeanalizuj pliki wyjściowe za pomocą oprogramowania do wizualizacji (np. Autodock Vina, PyMol):
	<ol>
		<li>Prześlij plik związku testowego do UCSF Chimera jako "ligand" i wykonaj dokowanie na ślepo, wybierając całe przygotowane białko wirusowe jako "receptor". Użyj myszy komputerowej lub gładzika, aby zmienić rozmiar woluminu wyszukiwania na cały "receptor". W "Opcjach zaawansowanych" ustaw maksymalną liczbę trybów wiązania. Ramki dokowania zostaną automatycznie uszeregowane od najwyższej do najniższej energii wiązania.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Oprócz dokowania na ślepo, ogranicz miejsce dokowania do białka wirusa w obszarach zainteresowania pochodzących z wyników dokowania na ślepo, ponownie za pomocą myszy lub gładzika, aby zmniejszyć głośność wyszukiwania (np. 100 Å x 100 Å x 100 A). Ten krok pomaga potwierdzić wyniki dokowania na ślepo i zwiększa specyficzność.</li>
		<li>Użyj systemu grafiki molekularnej (np. PyMol), aby przeanalizować pozycje trybów wiązania, przesyłając plik dokowania. Znajdź kontakty biegunowe od związku do białka wirusa, wybierając "ligand" i identyfikując kontakty biegunowe za pomocą opcji "do dowolnych atomów"; Zapoznaj się z wynikami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W tym raporcie opisaliśmy protokoły, które są przydatne do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe, które są ukierunkowane na wnikanie wirusa, w szczególności przeciwko CVA16 bez otoczki. Testy są zaprojektowane w taki sposób, aby przeanalizować wczesne zdarzenia podczas wnikania wirusa, co jest pomocne w wyjaśnieniu mechanizmu (mechanizmów) działania i potencjalnego celu (celów) aktywności przeciwwirusowej badanych czynników. "Test czasu dodania leku" pozwala na szerokie określenie potencjalnego celu badanych z...

Choroba rąk, stóp i jamy ustnej (HFMD) jest najczęściej wywoływana przez wirus Coxsackie A16 (CVA16) i enterowirus 71 (EV71) u małych dzieci. W ostatnim czasie w regionie Azji i Pacyfiku nastąpił znaczny wzrost HFMD wywołanej przez CVA16. Chociaż objawy mogą być łagodne, mogą wystąpić poważne powikłania, które wpływają na mózg i serce, z potencjalną śmiertelnością1,2. Obecnie nie ma licencjonowanych terapii przeciwwirusowych ani szczepionek przeciwko CVA16, a zatem istnieje pilna potrzeba opracowania strategii przeciwwirusowych w celu ograniczenia przyszłych epidemii i związanych z nimi powikłań.
CVA16 to wirus bezotoczkowy, który ma dwudziestościenny kapsyd złożony z pentamerów, z których każdy zawiera 4 białka strukturalne, a mianowicie VP1, VP2, VP3 i VP4. Wokół każdej pięciokrotnej osi pentameru znajduje się obszar "kanionu", który objawia się jako depresja i jest znany ze swojej roli w wiązaniu receptorów3. Na dnie tego kanionu znajduje się hydrofobowa kieszeń w regionie VP1, która zawiera naturalny ligand tłuszczowy o nazwie sfingozyna (SPH). Sugeruje się, że receptory komórkowe, takie jak ludzki ligand 1 glikoproteiny selektyny selektyny P (PSGL-1) i receptor zmiatacza klasy B 2 (SCARB2), odgrywają rolę w wiązaniu wirusa poprzez wypieranie tego ligandu, co powoduje zmiany konformacyjne kapsydu, a następnie wyrzucenie genomu wirusa do komórki gospodarza4,5,6. Zidentyfikowanie możliwych inhibitorów, które blokują kolejne zdarzenia w procesie wnikania wirusa, może dostarczyć potencjalnych strategii terapeutycznych przeciwko zakażeniu CVA16.
Etapy cyklu życia wirusa mogą być analizowane za pomocą eksperymentalnych metod jako cele, aby pomóc zidentyfikować środki przeciwwirusowe specyficzne dla danego trybu. Analiza czasu dodania leku bada efekt leczenia lekiem w różnych momentach infekcji wirusowej, w tym przed wejściem (dodane przed infekcją wirusową), wejście (dodane równocześnie z infekcją wirusową) i po wejściu (dodane po infekcji wirusowej)7. Wpływ można ocenić za pomocą standardowego testu płytki nazębnej, określając ilościowo liczbę blaszek wirusowych utworzonych w każdym z warunków leczenia. Test wiązania wirusa oparty na cytometrii przepływowej określa, czy lek zapobiega przyczepianiu się wirusa do komórek gospodarza. Osiąga się to poprzez przesunięcie temperatury z 37 °C, w której występuje większość infekcji wirusowych u ludzi, do 4 °C, gdzie wiriony są w stanie związać się z powierzchnią komórki gospodarza, ale nie są w stanie dostać się do komórek7. Cząsteczki wirusa związane z błoną komórkową są następnie oznaczane ilościowo poprzez barwienie immunologiczne antygenów wirusowych i oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. Z drugiej strony test inaktywacji wirusa pomaga ocenić potencjalne fizyczne interakcje leku z wolnymi cząsteczkami wirusa, osłaniając lub neutralizując wiriony, lub powodując agregacje lub zmiany konformacyjne, które sprawiają, że są one nieaktywne do kolejnych interakcji z powierzchnią komórki gospodarza podczas infekcji8,9. W tym eksperymencie inokulum wirusa może najpierw inkubować z lekiem, a następnie zostać rozcieńczone w celu miareczkowania leku przed zakażeniem monowarstwy komórki gospodarza i wykonaniem standardowego testu płytki nazębnej8. Wreszcie, dokowanie molekularne jest potężnym narzędziem do przewidywania potencjalnych miejsc interakcji leków na powierzchni wirionu, w tym glikoprotein wirusowych z wirusów otoczkowych i białek kapsydu wirusa z wirusów bezotoczkowych, przy użyciu algorytmów obliczeniowych. Pomaga to w mechanicznym określeniu celów działania leku i dostarcza przydatnych informacji, które można dalej walidować za pomocą dalszych testów.
Ostatnio zastosowaliśmy wyżej opisane metody do identyfikacji związków przeciwwirusowych, które skutecznie blokowały infekcję przez nieotoczkowy CVA169. W niniejszym artykule opisano i omówiono szczegółowe protokoły, które zostały zastosowane.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-sprzężone anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-VP1</td><td>Przeciwciało Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirus 71, reaguje krzyżowo z Coxsackie A16, klon 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Cytometr</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krystaliczny fiolet</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów toksykologicznych in vitro, Sigma</td><td></td><td>TOX2</td><td></td>na bazie XTT</tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; </td><td></td><td></td>Uniwersytet</tr><tr><td>Kalifornijski w San</td><td>Francisco</td><td></td><td></td> w Chimerze</tr></tbody></table>

wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi coxsackie a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Testy przeciwwirusowe, które mechanicznie badają wejście wirusa, są niezbędne do określenia, na którym etapie oceniane czynniki są najbardziej skuteczne, i pozwalają na identyfikację potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne podejścia do identyfikacji małych cząsteczek zdolnych do blokowania infekcji przez bezotoczkowy wirus Coxsackievirus A16 (CVA16) poprzez celowanie w cząsteczki wirusa lub określone etapy wczesnego wnikania wirusa. Testy obejmują analizę czasu dodania leku, test wiązania wirusa oparty na cytometrii przepływowej oraz test inaktywacji wirusa. Przedstawiamy również protokół dokowania molekularnego wykorzystujący białka kapsydu wirusa do przewidywania potencjalnych pozostałości, na które ukierunkowane są związki przeciwwirusowe. Testy te powinny pomóc w identyfikacji potencjalnych środków przeciwwirusowych, które działają na wnikanie wirusa. Przyszłe kierunki mogą badać te potencjalne inhibitory w celu dalszego rozwoju leków.

Test czasu dodania leku przedstawiono na Rycynie 1; obrazuje on wpływ leczenia małymi cząsteczkami CHLA i PUG na infekcję CVA16 przed wejściem wirusa (pretreatment), podczas wejścia wirusa (co-addition) lub po wejściu wirusa (post-infection). Obie małe cząsteczki wywarły jedynie marginalny wpływ na zakaźność CVA16 zarówno w przypadku wstępnego przygotowania komórek gospodarza przed infekcją wirusową (Rycina 1A), jak i leczenia po...

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Protokół ten może pomóc w odkryciu potencjalnych małych cząsteczek przeciwwirusowych dzięki podejściu opartemu na mechanizmie. Czas dodawania określa, na którym etapie infekcji mała cząsteczka wykazuje aktywność przeciwwirusową. Dokowanie molekularne pozwala przewidzieć interakcję między małą cząsteczką a białkami wirusa.Aby ocenić wpływ leków na komórki gospodarza przed infekcją wirusową, należy wysiać komórki RD na 12-dołkowych płytkach w gęstości posiewu dwa razy od 10 do piątej komórki na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc. Następnego ranka potraktować każdą studzienkę monowarstwy RD badanym związkiem będącym przedmiotem zainteresowania, w trzech egzemplarzach, w nietoksycznych stężeniach w jednym mililitrze podłoża podstawowego przez jedną lub cztery godziny.Pod koniec inkubacji poddanej działaniu substancji przemyć komórki jednym mililitrem PBS, a następnie dodać 50 jednostek wirusa tworzących blaszkę w 300 mikrolitrach podłoża podstawowego na studzienkę przez jedną godzinę, kołysząc co 15 minut. Pod koniec inkubacji infekcji przemyć komórki PBS i pokryć komórki jednym mililitrem świeżej pożywki podstawowej zawierającej 0,8% metylocelulozy. Po 72 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS i utrwal komórki 0,5 mililitra 37% formaldehydu na studzienkę przez 15 minut.Pod koniec utrwalania umyj studzienki PBS i zabarwij komórki 0,5 mililitra 0,5% roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę. Po dwóch minutach umyj studzienki delikatnym strumieniem wody i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść płytkę na białym pudełku świetlnym do liczenia i oblicz procent komórek zakażonych wirusem Coxsackie zgodnie ze wzorem.Aby przeprowadzić analizę dokowania molekularnego, pobierz cząsteczki 3D badanych związków z PubChem. Jeśli cząsteczka nie ma wgranej struktury 3D, pobierz strukturę 2D lub użyj sekwencji ciągów SMILE, aby przekształcić strukturę w cząsteczkę 3D za pomocą odpowiedniego programu molekularnego. Następnie pobierz jednostkę do biologicznego montażu wirusów z Banku Danych Białkowych RCSB.Za pomocą odpowiedniego programu bioinformatycznego usuń rozpuszczalniki z pliku Protein Data Bank, zastąp niekompletne łańcuchy boczne danymi z biblioteki rotamerów Dunbrack 2010 i dodaj wodór i ładunki do struktury, jak wcześniej raportowano. Aby zadokować związki testowe do przygotowanej jednostki wirusa, prześlij plik związku testowego do Chimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco jako ligand i wybierz całe przygotowane białko wirusowe jako receptor do wykonania ślepego dokowania. Aby uzyskać dodatkowe dokowanie, ogranicz miejsce dokowania do białka wirusowego do obszarów zainteresowania pochodzących z wyników dokowania na ślepo, jeszcze bardziej zmniejszając objętość wyszukiwania.Następnie prześlij plik dokowania do odpowiedniego systemu grafiki molekularnej, aby przeanalizować pozycje trybu wiązania. Wybierz ligand, aby znaleźć kontakty polarne od związku do białka wirusa, identyfikując kontakty polarne za pomocą opcji do dowolnych atomów. Obie małe cząsteczki testowane w tym reprezentatywnym eksperymencie wywarły jedynie marginalny wpływ na zakaźność wirusa Coxsackie A16, zarówno w leczeniu wstępnym komórek gospodarza przed infekcją wirusową, jak i po zakażeniu.W przeciwieństwie do tego, cząsteczki skutecznie zniosły infekcję o ponad 80% w leczeniu koaddycją, co sugeruje, że te dwa związki są najbardziej skuteczne, gdy są jednocześnie obecne z cząsteczkami wirusa na powierzchni komórki gospodarza podczas infekcji. Analiza wiązania oparta na cytometrii przepływowej potwierdza, że dwie taniny zapobiegały przedostawaniu się wirusa Coxsackie A16 do zakaźności, zapobiegając wiązaniu się cząstek wirusa z komórkami gospodarza. Molekularne dokowanie garbników wskazuje, że przewiduje się, że obie wiążą się w regionie kanionu pentamera wirusa Coxsackie, tuż nad wejściem do kieszeni, które zawiera czynnik kieszonkowy i odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w wiązaniu i wnikaniu wirusa Coxsackievirus do komórki gospodarza.W tych projekcjach powierzchniowych można zaobserwować unikalne pozostałości przewidywane z polarnych kontaktów małych cząsteczek wokół wejścia do kieszeni, z asparaginą-85, lizyną-257 i asparaginą-417 wspólnymi dla tych dwóch garbników. W przypadku dokowania molekularnego topologia białka wirusowego musi być brana pod uwagę przy ustalaniu rangi ramek wiążących. Dodatkowe eksperymenty mogą obejmować testowanie aktywności przeciwwirusowej związku na rekombinowanych wirusach, z odkrytymi mutacjami aminokwasów, aby potwierdzić ich znaczenie dla skuteczności leku.

use-viral-entry-assays-molecular-docking-analysis-for-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test inaktywacji wirusa, prezentując ocenę wpływu środków przeciwwirusowych na cząsteczki wirusa.

Ocena skuteczności przeciwwirusowego związku testowego za pomocą testu inaktywacji wirusa

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metody identyfikacji inhibitorów wnikania wirusa Coxsackie A16 przy użyciu testów wnikania i analizy dokowania molekularnego. Protokół ten umożliwia odkrywanie małych cząsteczek o właściwościach przeciwwirusowych.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16 (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Przeglądaj więcej filmów