Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Protokół ten może pomóc w odkryciu potencjalnych małych cząsteczek przeciwwirusowych dzięki podejściu opartemu na mechanizmie. Czas dodawania określa, na którym etapie infekcji mała cząsteczka wykazuje aktywność przeciwwirusową. Dokowanie molekularne pozwala przewidzieć interakcję między małą cząsteczką a białkami wirusa.

Aby ocenić wpływ leków na komórki gospodarza przed infekcją wirusową, należy wysiać komórki RD na 12-dołkowych płytkach w gęstości posiewu dwa razy od 10 do piątej komórki na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc. Następnego ranka potraktować każdą studzienkę monowarstwy RD badanym związkiem będącym przedmiotem zainteresowania, w trzech egzemplarzach, w nietoksycznych stężeniach w jednym mililitrze podłoża podstawowego przez jedną lub cztery godziny.

Pod koniec inkubacji poddanej działaniu substancji przemyć komórki jednym mililitrem PBS, a następnie dodać 50 jednostek wirusa tworzących blaszkę w 300 mikrolitrach podłoża podstawowego na studzienkę przez jedną godzinę, kołysząc co 15 minut. Pod koniec inkubacji infekcji przemyć komórki PBS i pokryć komórki jednym mililitrem świeżej pożywki podstawowej zawierającej 0,8% metylocelulozy. Po 72 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS i utrwal komórki 0,5 mililitra 37% formaldehydu na studzienkę przez 15 minut.

Pod koniec utrwalania umyj studzienki PBS i zabarwij komórki 0,5 mililitra 0,5% roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę. Po dwóch minutach umyj studzienki delikatnym strumieniem wody i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść płytkę na białym pudełku świetlnym do liczenia i oblicz procent komórek zakażonych wirusem Coxsackie zgodnie ze wzorem.

Aby przeprowadzić analizę dokowania molekularnego, pobierz cząsteczki 3D badanych związków z PubChem. Jeśli cząsteczka nie ma wgranej struktury 3D, pobierz strukturę 2D lub użyj sekwencji ciągów SMILE, aby przekształcić strukturę w cząsteczkę 3D za pomocą odpowiedniego programu molekularnego. Następnie pobierz jednostkę do biologicznego montażu wirusów z Banku Danych Białkowych RCSB.

Za pomocą odpowiedniego programu bioinformatycznego usuń rozpuszczalniki z pliku Protein Data Bank, zastąp niekompletne łańcuchy boczne danymi z biblioteki rotamerów Dunbrack 2010 i dodaj wodór i ładunki do struktury, jak wcześniej raportowano. Aby zadokować związki testowe do przygotowanej jednostki wirusa, prześlij plik związku testowego do Chimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco jako ligand i wybierz całe przygotowane białko wirusowe jako receptor do wykonania ślepego dokowania. Aby uzyskać dodatkowe dokowanie, ogranicz miejsce dokowania do białka wirusowego do obszarów zainteresowania pochodzących z wyników dokowania na ślepo, jeszcze bardziej zmniejszając objętość wyszukiwania.

Następnie prześlij plik dokowania do odpowiedniego systemu grafiki molekularnej, aby przeanalizować pozycje trybu wiązania. Wybierz ligand, aby znaleźć kontakty polarne od związku do białka wirusa, identyfikując kontakty polarne za pomocą opcji do dowolnych atomów. Obie małe cząsteczki testowane w tym reprezentatywnym eksperymencie wywarły jedynie marginalny wpływ na zakaźność wirusa Coxsackie A16, zarówno w leczeniu wstępnym komórek gospodarza przed infekcją wirusową, jak i po zakażeniu.

W przeciwieństwie do tego, cząsteczki skutecznie zniosły infekcję o ponad 80% w leczeniu koaddycją, co sugeruje, że te dwa związki są najbardziej skuteczne, gdy są jednocześnie obecne z cząsteczkami wirusa na powierzchni komórki gospodarza podczas infekcji. Analiza wiązania oparta na cytometrii przepływowej potwierdza, że dwie taniny zapobiegały przedostawaniu się wirusa Coxsackie A16 do zakaźności, zapobiegając wiązaniu się cząstek wirusa z komórkami gospodarza. Molekularne dokowanie garbników wskazuje, że przewiduje się, że obie wiążą się w regionie kanionu pentamera wirusa Coxsackie, tuż nad wejściem do kieszeni, które zawiera czynnik kieszonkowy i odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w wiązaniu i wnikaniu wirusa Coxsackievirus do komórki gospodarza.

W tych projekcjach powierzchniowych można zaobserwować unikalne pozostałości przewidywane z polarnych kontaktów małych cząsteczek wokół wejścia do kieszeni, z asparaginą-85, lizyną-257 i asparaginą-417 wspólnymi dla tych dwóch garbników. W przypadku dokowania molekularnego topologia białka wirusowego musi być brana pod uwagę przy ustalaniu rangi ramek wiążących. Dodatkowe eksperymenty mogą obejmować testowanie aktywności przeciwwirusowej związku na rekombinowanych wirusach, z odkrytymi mutacjami aminokwasów, aby potwierdzić ich znaczenie dla skuteczności leku.