Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16
15 lipca 2019
Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.
Protokół ten może pomóc w odkryciu potencjalnych małych cząsteczek przeciwwirusowych dzięki podejściu opartemu na mechanizmie. Czas dodawania określa, na którym etapie infekcji mała cząsteczka wykazuje aktywność przeciwwirusową. Dokowanie molekularne pozwala przewidzieć interakcję między małą cząsteczką a białkami wirusa.
Aby ocenić wpływ leków na komórki gospodarza przed infekcją wirusową, należy wysiać komórki RD na 12-dołkowych płytkach w gęstości posiewu dwa razy od 10 do piątej komórki na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc. Następnego ranka potraktować każdą studzienkę monowarstwy RD badanym związkiem będącym przedmiotem zainteresowania, w trzech egzemplarzach, w nietoksycznych stężeniach w jednym mililitrze podłoża podstawowego przez jedną lub cztery godziny.
Pod koniec inkubacji poddanej działaniu substancji przemyć komórki jednym mililitrem PBS, a następnie dodać 50 jednostek wirusa tworzących blaszkę w 300 mikrolitrach podłoża podstawowego na studzienkę przez jedną godzinę, kołysząc co 15 minut. Pod koniec inkubacji infekcji przemyć komórki PBS i pokryć komórki jednym mililitrem świeżej pożywki podstawowej zawierającej 0,8% metylocelulozy. Po 72 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS i utrwal komórki 0,5 mililitra 37% formaldehydu na studzienkę przez 15 minut.
Pod koniec utrwalania umyj studzienki PBS i zabarwij komórki 0,5 mililitra 0,5% roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę. Po dwóch minutach umyj studzienki delikatnym strumieniem wody i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść płytkę na białym pudełku świetlnym do liczenia i oblicz procent komórek zakażonych wirusem Coxsackie zgodnie ze wzorem.
Aby przeprowadzić analizę dokowania molekularnego, pobierz cząsteczki 3D badanych związków z PubChem. Jeśli cząsteczka nie ma wgranej struktury 3D, pobierz strukturę 2D lub użyj sekwencji ciągów SMILE, aby przekształcić strukturę w cząsteczkę 3D za pomocą odpowiedniego programu molekularnego. Następnie pobierz jednostkę do biologicznego montażu wirusów z Banku Danych Białkowych RCSB.
Za pomocą odpowiedniego programu bioinformatycznego usuń rozpuszczalniki z pliku Protein Data Bank, zastąp niekompletne łańcuchy boczne danymi z biblioteki rotamerów Dunbrack 2010 i dodaj wodór i ładunki do struktury, jak wcześniej raportowano. Aby zadokować związki testowe do przygotowanej jednostki wirusa, prześlij plik związku testowego do Chimera Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco jako ligand i wybierz całe przygotowane białko wirusowe jako receptor do wykonania ślepego dokowania. Aby uzyskać dodatkowe dokowanie, ogranicz miejsce dokowania do białka wirusowego do obszarów zainteresowania pochodzących z wyników dokowania na ślepo, jeszcze bardziej zmniejszając objętość wyszukiwania.
Następnie prześlij plik dokowania do odpowiedniego systemu grafiki molekularnej, aby przeanalizować pozycje trybu wiązania. Wybierz ligand, aby znaleźć kontakty polarne od związku do białka wirusa, identyfikując kontakty polarne za pomocą opcji do dowolnych atomów. Obie małe cząsteczki testowane w tym reprezentatywnym eksperymencie wywarły jedynie marginalny wpływ na zakaźność wirusa Coxsackie A16, zarówno w leczeniu wstępnym komórek gospodarza przed infekcją wirusową, jak i po zakażeniu.
W przeciwieństwie do tego, cząsteczki skutecznie zniosły infekcję o ponad 80% w leczeniu koaddycją, co sugeruje, że te dwa związki są najbardziej skuteczne, gdy są jednocześnie obecne z cząsteczkami wirusa na powierzchni komórki gospodarza podczas infekcji. Analiza wiązania oparta na cytometrii przepływowej potwierdza, że dwie taniny zapobiegały przedostawaniu się wirusa Coxsackie A16 do zakaźności, zapobiegając wiązaniu się cząstek wirusa z komórkami gospodarza. Molekularne dokowanie garbników wskazuje, że przewiduje się, że obie wiążą się w regionie kanionu pentamera wirusa Coxsackie, tuż nad wejściem do kieszeni, które zawiera czynnik kieszonkowy i odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w wiązaniu i wnikaniu wirusa Coxsackievirus do komórki gospodarza.
W tych projekcjach powierzchniowych można zaobserwować unikalne pozostałości przewidywane z polarnych kontaktów małych cząsteczek wokół wejścia do kieszeni, z asparaginą-85, lizyną-257 i asparaginą-417 wspólnymi dla tych dwóch garbników. W przypadku dokowania molekularnego topologia białka wirusowego musi być brana pod uwagę przy ustalaniu rangi ramek wiążących. Dodatkowe eksperymenty mogą obejmować testowanie aktywności przeciwwirusowej związku na rekombinowanych wirusach, z odkrytymi mutacjami aminokwasów, aby potwierdzić ich znaczenie dla skuteczności leku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wspomaga odkrywanie potencjalnych małocząsteczkowych związków przeciwwirusowych w podejściu opartym na mechanizmie działania. Przedstawia on różne testy dotyczące wnikania wirusa w celu identyfikacji kandydatów na inhibitory wnikania wirusa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Farmakologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Zrozumienie mechanizmu wnikania wirusa do komórki jest kluczowe dla opracowywania terapii przeciwwirusowych.
- Małe cząsteczki mogą hamować wnikanie wirusa na różnych etapach.
- Testy analityczne mogą pomóc w identyfikacji skutecznych kandydatów na leki przeciwwirusowe.
- Podejścia oparte na mechanizmie działania usprawniają proces odkrywania nowych leków.
Cel badania
- Przedstawienie testów służących do identyfikacji inhibitorów wnikania wirusów.
- Ocena aktywności przeciwwirusowej małych cząsteczek.
- Stworzenie ram dla przyszłego odkrywania leków przeciwwirusowych.
Zastosowane metody
- Analiza czasu dodania (time of addition assay) w celu określenia etapu infekcji, na który wpływa mała cząsteczka.
- Dokowanie molekularne w celu przewidzenia oddziaływań między małymi cząsteczkami a białkami wirusowymi.
- Protokoły wysiewania i traktowania komórek RD.
- Ocena wpływu leku na komórki gospodarza przed infekcją wirusową.
Główne wyniki
- Identyfikacja kandydackich małych cząsteczek o właściwościach przeciwwirusowych.
- Wgląd w czas wystąpienia aktywności przeciwwirusowej podczas infekcji.
- Przewidywane interakcje między małymi cząsteczkami a białkami wirusowymi.
- Ocena odpowiedzi komórek gospodarza na leczenie przeciwwirusowe.
Wnioski
- Protokół zapewnia systematyczne podejście do odkrywania leków przeciwwirusowych.
- Testy mogą skutecznie identyfikować potencjalne inhibitory wnikania wirusów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym schemacie w celu opracowania nowych leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mechanistyczne odkrywanie leków przeciwwirusowych wymaga precyzyjnej identyfikacji związków blokujących wnikanie wirusa, co stanowi krytyczny punkt zwrotny w wczesnej fazie infekcji. Niniejszy protokół umożliwia walidację celu poprzez wskazanie etapu aktywności przeciwwirusowej i przewidywanie oddziaływań molekularnych z białkami wirusa. Taka minimalizacja ryzyka wspiera identyfikację związków wiodących oraz selekcję projektów w procesie rozwoju leków przeciwwirusowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną poprzez określenie, na którym etapie infekcji cząsteczki małocząsteczkowe wykazują działanie przeciwwirusowe, z wykorzystaniem analizy czasu dodania leku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe odczyty zahamowania infekcji w celu wsparcia walidacji celu oraz redukcji ryzyka mechanistycznego.
- Wartość prognostyczna: Wykorzystuje dokowanie molekularne do przewidywania miejsc wiązania na białkach kapsydu wirusowego, umożliwiając potwierdzenie celu na poziomie poszczególnych reszt aminokwasowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wykorzystanie testów wiązania opartych na cytometrii przepływowej do ilościowego pomiaru przylegania cząstek wirusowych do komórek gospodarza.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja testów inaktywacji wirusa oraz testów czasu dodania w celu odtwarzalnej oceny skuteczności związków w różnych warunkach.
- Skalowalność: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (komórki RD) do późniejszych procesów przesiewowych i ponownego wykorzystania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane dotyczące hamowania wczesnego wnikania z pewnością predykcyjną w zakresie skuteczności przeciwwirusowej poprzez potwierdzenie w testach ortogonalnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Waliduje zaangażowanie celu poprzez korelację aminokwasów przewidzianych w dokowaniu (np. asparagina-85, lizyna-257, asparagina-417) z funkcjonalnymi danymi o wiązaniu.
- Znaczenie modeli przedklinicznych: Wykorzystuje istotne dla choroby modele infekcji Coxsackievirus A16 do oceny aktywności inhibitora w fizjologicznie odpowiednim układzie.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków przeciwwirusowych, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o dane mechanistyczne i ilościowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez określenie, czy związki działają poprzez hamowanie wiązania wirusa czy poprzez mechanizmy po wniknięciu do komórki.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki ustandaryzowanym protokołom pomiaru wiązania wirusa, inaktywacji oraz czasu dodania substancji.
- Analityka: Generuje ilościowe zmienne zależne (procent hamowania infekcji, przewidywania powinowactwa wiązania) do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy dane dotyczące hamowania wniknięcia z postępami w badaniach przedklinicznych poprzez walidację zaangażowania miejsca docelowego w regionach kapsydu wirusa.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko innym picornaviruses lub wirusom bezotoczkowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozróżnienie efektów przeciwwirusowych występujących przed przyłączeniem, podczas wiązania oraz po związaniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analiz w formatach czasu dodania, wiązania oraz inaktywacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie zaangażowania celu przed rozpoczęciem zasobożerniej optymalizacji związku wiodącego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka dzięki podwójnej walidacji w testach funkcjonalnych oraz dokowaniu strukturalnym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu wirusologii, hodowli komórkowych oraz obsługi oprogramowania do dokowania molekularnego (np. UCSF Chimera).
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego w celu pracy z wirusami i przeprowadzenia testu plackowego.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa jednostek wirusologii i biologii obliczeniowej w celu spójnej interpretacji danych.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji przy rozszerzaniu testów na inne systemy wirusowe lub linie komórkowe poza komórki RD.
- Ograniczenie praktyczne: Dokładność dokowania zależy od jakości struktury białka i przygotowania ligandu, co wymaga walidacji poprzez mutogenezę lub testy wiązania.
