Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie uproszczonego systemu do analizy durotaksji komórkowej, w której wiele komórek ssaków migruje preferencyjnie w kierunku sztywniejszego podłoża. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie podłoży z polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności. Następnie przygotowany PDMS wlewa się do każdego dołka płytki sześciodołkowej i usuwa wszelkie pęcherzyki powietrza.

Komory Durex są następnie dopełniane poprzez umieszczenie wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego na wierzchu PDMS w każdej studni w celu stworzenia nakładki. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek do komór Durex z gęstością, która zapewni komórkom wystarczającą przestrzeń do migracji bez istotnych interakcji z innymi komórkami. W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię żywych komórek do badania osi w migrujących komórkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak żele poliakrylamidowe, jest istnienie pojedynczego przejścia między miękkim PDMS a sztywnym szkłem, zamiast stosowania alternatywnych żeli gradientowych. Ponadto powlekanie PDMS komponentami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak fibronektyna, nie wymaga sieciowania chemicznego, które jest niezbędne w przypadku żeli poliakrylamidowych. Aby przygotować jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, należy najpierw odważyć odpowiednią ilość materiału za pomocą probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Odważ około 10 g roztworu bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) do probówki o pojemności 50 ml. Dla podłoża w stosunku 90:1 podziel odważoną masę roztworu bazy PDMS przez 90. Aby określić właściwą ilość potrzebnego roztworu sieciującego, dodaj obliczoną ilość roztworu sieciującego PDMS do probówki; mieszaninę bazy i sieciującego PDMS mieszaj energicznie przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na tym etapie, po użyciu małej szpatułki, w mieszaninie znajdzie się niewielka liczba pęcherzyków powietrza. Wirować podłoże PDMS w wirówce laboratoryjnej przez pięć minut przy 50 $\times$g. Pozostawić w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków, jeśli nadal są obecne.

Po pięciu minutach ponownego wirowania, pipetujemy 1 mL podłoża PDMS w stosunku 90:1 do każdej studni 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowych. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza w PDMS można na tym etapie usunąć, przebijając je igłą o rozmiarze 21 G.

Pozostaw PDMS w dołku na 30 minut, aby się rozprowadził. Następnie gotuj szklane lamelle nr 1 o średnicy 12 milimetrów w wodzie destylowanej przez pięć minut, powtórz tę czynność łącznie trzy razy. Umieść jedną osuszoną lamelkę w każdym dołku płytki do hodowli tkanek, delikatnie dotykając jednej krawędzi lamelki.

Zanurz szkiełko nakrywkę w roztworze PDMS, a następnie upuść ją na PDMS. Gdy szkiełko nakrywka osiądzie, PDMS zacznie rozprzestrzeniać się poza krawędzie szkiełka, ale nie przykryje go całkowicie. Po utwardzeniu utworzy to interfejs pomiędzy PDMS a szkłem.

Inkubuj płytkę w temperaturze 70 °C w inkubatorze przez 16 godzin, aby utwardzić PDMS. Na koniec umieść płytkę w komorze do hodowli komórkowych i sterylizuj promieniami UV przez 10 minut. Pokryj każdą komorę durox jedną mililitrem fibronektyny w fosforanie buforze soli (PBS) bez wapnia i magnezu przez jedną godzinę w temperaturze 30 °C.

Należy upewnić się, że cała powierzchnia jest zanurzona w roztworze fibronektyny w PBS. Przygotować denaturowaną termicznie 1% albuminę surowicy bydlęcej lub BSA, odważając 0,5 g BSA i rozpuszczając ją w 50 ml przefiltrowanego PBS. Roztwór należy wysterylizować przez filtr 0,22 µm przed podgrzaniem do 80 °C przez 12 minut.

Następnie odessać roztwór fibronektyny i przemyć komory trzykrotnie buforem PBS. Do każdej studniki dodać jeden mililitr BSA denaturowanego termicznie w PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć trypsyną i policzyć wybrane komórki, podczas gdy komory durex są blokowane za pomocą BSA denaturowanego termicznie. Odessać roztwór BSA z komór przed wysianiem komórek.

Wysiej 10 000 komórek w objętości dwóch mililitrów do każdego dołka komory doax. Używając pożywki wymaganej dla wybranego typu komórek, pozwól komórkom przywrzeć i rozprzestrzenić się na podłożu przez cztery godziny w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, a następnie przeprowadź obrazowanie żywych komórek na mikroskopie odwróconym w kontraście fazowym z obiektywem 10 x. Mikroskop powinien być wyposażony w zamkniętą, nawilżaną komorę środowiskową, umożliwiającą kontrolę temperatury 37 °C i poziomu 5% CO2 podczas długoterminowego obrazowania.

Obrazowanie: po tym, jak komórki rozprzestrzeniły się przez około 3,5 godziny, umieść płytkę w komorze mikroskopu. Pozostaw próbki w komorze na 30 minut w celu wyrównania temperatury i warunków. Jeśli jest to możliwe, skonfiguruj w mikroskopie zautomatyzowane odwiedzanie wielu punktów.

Skup się na styku między PDMS a szkiełkiem podstawowym i wybierz punkty do obrazowania wokół całego tego interfejsu. Przy średnio 40 punktach na obraz z komory Durex, obrazując komórki co 10 minut przez maksymalnie 16 godzin, obszar zainteresowania pojawi się w postaci dwóch linii, z których linia zewnętrzna odpowiada krawędzi szkiełka, a linia wewnętrzna rzeczywistemu stykowi między PDMS a szkiełkiem. Aby przeanalizować dane, utwórz arkusz kalkulacyjny podobny do tego przedstawionego w protokole tekstowym.

Policz liczbę zdarzeń przekroczenia granicy między PDMS a powierzchnią szklaną i odwrotnie dla każdego wygenerowanego filmu. Zdarzenie przekroczenia definiuje się jako przejście jądra komórkowego przez granicę między PDMS a szkłem w dowolnym kierunku. Zapisz liczbę zdarzeń przekroczenia w odpowiedniej kolumnie arkusza Excel, aby określić ilość wielokrotnych przekroczeń.

Policz liczbę przejść komórki przez granicę faz. Liczbę tę należy zapisać w kolumnie arkusza Excel odpowiadającej podłożu, na którym komórka znajdowała się na końcu filmu. Powtórz analizę dla każdej komórki, która przekracza granicę faz w filmie.

Należy wykluczyć komórki, które w trakcie obrazowania przemieściły się poza pole widzenia. Oblicz procent komórek, które migrowały z PDMS na powierzchnię szklaną i w związku z tym uległy durotaksis. Aby to zrobić:

Zsumuj liczbę zdarzeń przejścia z miękkiego na twarde podłoże oraz liczbę wielokrotnych zdarzeń przejścia zakończonych na podłożu twardym, a następnie podziel wynik przez całkowitą liczbę zdarzeń przejścia. Oblicz procent wielokrotnych przejść, dzieląc sumę wielokrotnych przejść przez całkowitą liczbę przejść, aby rozpocząć analizę mechanizmu molekularnego, za pomocą którego komórki reagują na sygnały mechaniczne w swoim otoczeniu. Wybrane białka można wyciszyć za pomocą IRNA, zgodnie z przedstawioną tutaj metodą.

Około 70% komórek kontrolnych traktowanych irna wykazywało axis. W uderzającym kontraście, po wyciszeniu CD gap za pomocą RNAi, komórki nie wykazywały preferencji co do tego, czy migrowały na podłoże twarde, czy miękkie. Co więcej, komórki z wyciszonym CD gap wielokrotnie przekraczały granicę.

Podczas gdy komórki kontrolne traktowane irna zazwyczaj przekraczały granicę tylko raz, reprezentatywne ścieżki komórek kontrolnych irna pokazują, że komórki te zazwyczaj migrowały przez granicę raz i preferencyjnie pozostawały na sztywniejszej powierzchni w porównaniu do CD gap. Komórki traktowane irna, które nie wykazały preferencji co do sztywności, przekraczały granicę wielokrotnie.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat przygotowywania podłoży PDMS, montażu komór duris oraz ilościowego oznaczania podatków DUR.