Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie uproszczonego systemu do analizy dureksu komórkowego, przez który wiele komórek ssaków preferencyjnie migruje w kierunku bardziej sztywnego podłoża. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie substratów z polimetylu suboksanu lub PDMS o określonej sztywności. Następnie przygotowany PDMS wlewa się do każdej studzienki sześciodołkowej płytki i usuwa wszelkie pęcherzyki powietrza.

Komory Durex są następnie uzupełniane przez umieszczenie wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego na wierzchu PDMS w każdym studzience w celu utworzenia nakładki. Ostatnim krokiem jest zasianie komórek w komorach Duro w gęstości, która daje komórkom wystarczająco dużo miejsca do migracji bez znaczących interakcji z innymi komórkami. Ostatecznie, mikroskopia żywych komórek jest używana do badania axxis w migrujących komórkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak poliakrylamid, jest to, że istnieje jeden krok między miękkim PDMS a sztywnym szkłem zamiast gradientowych alternatyw żelowych. Również powlekanie PDMS macierzą zewnątrzkomórkową Składniki takie jak fibronektyna nie wymagają chemicznego sieciowania, które jest wymagane w przypadku żeli poliakrylamidowych. Aby przygotować jedną sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej, najpierw rozerwij resztę za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Odważyć około 10 gramów roztworu zasady polidimetylosuboksanu lub PDMS w probówce o pojemności 50 mililitrów. W przypadku substratu 90 do jednego podziel zmierzoną masę roztworu bazowego PDMS przez 90. Aby określić odpowiednią ilość potrzebnego roztworu sieciującego, dodaj obliczoną ilość roztworu sieciującego PDMS do energicznie wymieszanej mieszaniny sieciownika bazowego A-P-D-M-S przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Za pomocą małej szpatułki na tym etapie mieszanina będzie zawierać niewielką liczbę pęcherzyków powietrza. Odwirować substrat PDMS w wirówce stołowej przez pięć minut po 50 razy. G. Dodaj temperaturę pokojową, aby usunąć bąbelki, jeśli nadal są bąbelki.

Po pięciu minutach ponownie odwirować, odpipetować jeden mililitr 90 na jeden substrat PDMS do każdej studzienki poddanej działaniu kultury tkankowej. Płytka sześciodołkowa. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza obecne w PDMS można wyeliminować na tym etapie, przebijając je igłą o rozmiarze 21.

Pozwól PDMS rozprzestrzeniać się w studzience przez 30 minut. Następnie zagotuj 12-milimetrową szklankę Numer jeden, przykrywka szkiełkuje w wodzie destylowanej przez pięć minut, w sumie trzy razy. Umieść po jednym wysuszonym szkiełku przykrywkowym do każdego dołka płytki do hodowli tkankowej, delikatnie dotykając jednej strony pokrywy.

Wsuń do roztworu PDMS, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe na PDMS. Gdy szkiełko nakrywkowe osiada, PDMS zacznie wchodzić w krawędzie szkiełka nakrywkowego, ale nie pokryje go całkowicie. Spowoduje to wygenerowanie interfejsu między PDMS a szkłem po utwardzeniu.

Inkubować płytkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza w piekarniku przez 16 godzin, aby utwardzić PDMS. Na koniec umieść płytkę w kapturze do hodowli komórkowej i sterylizuj UV przez 10 minut. Każdą komorę durox pokryć jednym mililitrem fibronektyny w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu przez jedną godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że cała powierzchnia jest zanurzona w fibronektynie w roztworze PBS. Przygotuj 1% albuminę surowicy bydlęcej lub BSA o naturze cieplnej, ważąc 0,5 grama BSA i rozpuszczając ją w 50 mililitrach filtra PBS. Wysterylizuj roztwór przez filtr punktowy o średnicy 22 mikronów przed ogrzewaniem w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 12 minut.

Następnie odessać roztwór fibronektyny i trzykrotnie przemyć komory PBS. Dodaj jeden mililitr zdenaturowanego ciepła BSA w PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, oczy trypsyny i policz wybrane komórki, podczas gdy komory dureksu blokują się pod wpływem ciepła. Denaturowany roztwór BSA aspirowany BSA z komór tuż przed posiewem komórek.

Umieść 10 000 komórek w objętości dwóch mililitrów w każdej studzience komory doax. Używając pożywki wymaganej dla konkretnego rodzaju komórek, pozwól komórkom przylegać i rozprowadzać się na podłożu przez cztery godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, wykonaj obrazowanie żywych komórek pod mikroskopem odwróconym przy użyciu kontrastu fazowego z obiektywem 10x. Mikroskop powinien być wyposażony w zamkniętą komorę nawilżaną w środowisku, umożliwiającą kontrolę temperatury na poziomie 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 podczas długotrwałego obrazowania.

Obrazowanie, po rozproszeniu komórek przez około 3,5 godziny, zmontuj płytkę w komorze mikroskopu. Pozostawić próbki do zrównoważenia w komorze przez 30 minut. Skonfiguruj automatyczne wizyty wielopunktowe na mikroskopie, jeśli jest dostępny.

Skoncentruj się na interfejsie między PDMS a szklaną szkiełkiem nakrywkowym i wybierz punkty do zobrazowania wokół interfejsu. Przy średniej 40 punktach na obraz komory Durex, komórki co 10 minut przez okres do 16 godzin, obszar zainteresowania pojawi się jako dwie linie, przy czym zewnętrzna linia odpowiada krawędzi szkiełka nakrywkowego, a wewnętrzna linia odpowiada rzeczywistemu interfejsowi między PDMS a szkiełkiem nakrywkowym. Aby przeanalizować dane, wygeneruj arkusz kalkulacyjny, taki jak ten pokazany w protokole tekstowym.

Policz liczbę zdarzeń przejścia od PDMS do powierzchni szkła i odwrotnie od każdego wygenerowanego filmu. Zdarzenie skrzyżowania definiuje się jako jądro komórkowe przechodzące przez granicę między PDMS a szkłem w dowolnym kierunku. Zapisz liczbę zdarzeń skrzyżowania w odpowiedniej kolumnie w arkuszu kalkulacyjnym Excel, aby określić ilościowo wiele skrzyżowań.

Policz, ile razy komórka przekroczyła interfejs. Liczba ta powinna być zapisana w kolumnie Excel odpowiadającej podłożu, na którym znajdowała się komórka na końcu filmu. Powtórz analizę dla każdej komórki, która przecina interfejs w filmie.

Wyklucz komórki, które migrują poza pole widzenia podczas obrazowania. Oblicz procent komórek, które migrowały z PDMS na powierzchnię szkła i dlatego przeszły Duro Texas. Aby to zrobić.

Zsumuj liczbę zdarzeń skrzyżowania z miękkiego na twardy oraz wiele zdarzeń skrzyżowania, które zakończyły się na twardym i podziel przez łączną liczbę zdarzeń skrzyżowania. Oblicz procent wielokrotnych przejść, dzieląc sumę wielokrotnych przecięć przez całkowitą liczbę przejść, aby zacząć rozumieć mechanizm molekularny, za pomocą którego komórki odpowiadają mechanicznym sygnałom w swoim środowisku. Określone białka można powalić za pomocą IRNA, jak pokazano tutaj.

Około 70% komórek kontrolnych leczonych irna wykazywało axxis. W uderzającym kontraście, gdy przerwa CD została zniszczona za pomocą RNAi, komórki nie miały preferencji co do tego, czy migrują na twarde, czy miękkie podłoże. Co więcej, komórki knockdown z luką CD przekroczyły wielokrotność granicy.

Podczas gdy komórki kontrolne poddane działaniu irna na ogół przekraczają granicę tylko wtedy, gdy reprezentatywne ścieżki kontroli. Komórki irna pokazują, że komórki na ogół migrują przez granicę raz i preferencyjnie pozostają na sztywniejszej powierzchni w porównaniu z luką CD. Irna traktowała komórki, które nie wykazywały preferencji dla żadnej ze sztywności i wielokrotnie przekraczały granicę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować podłoża PDMS, zmontować komory duris i określić ilościowo podatki DUR.