Name: Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę badania durotaksji komórek ssaków przy użyciu podłoży PDMS o zdefiniowanej sztywności. Technika ta umożliwia obserwację migracji komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH R01 GM47607, CA163296 i NSF 1334493 do CET. Dziękujemy członkom laboratorium Turnera za krytyczną lekturę manuskryptu. Wszystkie dane przedstawione w tym raporcie zostały powtórzone za zgodą Wormer et al. 201411.

1. Przygotowanie komór Durotaxis
<ol>
	<li>Aby przygotować jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, wytaruj wagę za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odważyć około 10 g roztworu podstawowego PDMS w probówce o pojemności 50 ml (roztwór jest dość lepki).</li>
	<li>W przypadku podłoża 90:1 (zgodność ~1 kPa) należy podzielić zmierzoną masę roztworu zasadowego PDMS w probówce przez 90, aby określić odpowiednią ilość potrzebnego roztworu sieciującego. Dodaj obliczoną ilość roztworu sieciującego PDMS do tej samej probówki. 
	Przykład: 10 g / 90 = 0,11 g. Dodaj 0,11 g roztworu sieciującego PDMS do roztworu podstawowego PDMS. 
	UWAGA: Rozwiązania bazowe i sieciujące są dostępne w zestawie PDMS.</li>
	<li>Energicznie mieszaj mieszaninę zasady PDMS i środka sieciującego przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą małej szpatułki. Na tym etapie mieszanina będzie zawierać dużą liczbę pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odwirować substrat PDMS w wirówce stołowej przez 5 minut przy 50 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków. Jeśli po upływie 5 minut nadal pozostają bąbelki, ponownie odwirować.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml substratu PDMS w proporcji 90:1 do każdego dołka na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza obecne w PDMS można wyeliminować na tym etapie, przebijając je za pomocą igły 21 G. Pozwól PDMS rozprzestrzeniać się przez 30 minut w studzience.</li>
	<li>Gotuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w wodzie destylowanej przez 5 minut. Powtórz dwa razy i przechowuj szkiełka nakrywkowe w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Umieść po jednym, wysuszonym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku płytki do hodowli tkankowej, delikatnie dotykając jednej strony szkiełka nakrywkowego do roztworu PDMS, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe na PDMS. Gdy szkiełko nakrywkowe osiada, PDMS zacznie wchodzić w krawędzie szkiełka nakrywkowego, ale nie pokryje go całkowicie. Spowoduje to wygenerowanie interfejsu między PDMS a szkłem po utwardzeniu (patrz rysunek 1A,B).</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 70 °C w piecu przez 16 godzin w celu utwardzenia (utwardzenia) PDMS. Umieść płytkę w kapturze do hodowli komórkowej i sterylizuj UV przez 10 min. 
	UWAGA: Najlepiej jest wykonać płytki w ciągu kilku dni od użycia. Płyty mogą być jednak zawijane w Parafilm bez żadnego bufora i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni bez zauważalnego spadku jakości.</li>
</ol>
2. Poszycie komórek
UWAGA: Jeśli badasz efekt knockdownu za pośrednictwem siRNA, wykonaj knockdown, korzystając z instrukcji producenta lub zoptymalizowanego protokołu dla wybranego typu komórki.
<ol>
	<li>Każdą komorę dwunastnicy należy pokryć 1 ml fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w PBS bez wapnia i magnezu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, fibronektynę można zastosować dzień przed analizą, inkubując PDMS z 10 μg/ml fibronektyny w PBS przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że cała powierzchnia jest zanurzona w roztworze fibronektyny w PBS.</li>
	<li>Przygotować denaturowany 1% BSA. Odważyć 0,5 g masy ciała i rozpuścić ją w 50 ml PBS. Przefiltrować, wysterylizować roztwór przez filtr 0,22 μm i podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 12 minut. 
	Uwaga: Roztwór należy przygotować dzień przed posiewem komórek i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór fibronektyny i przemyć 3 razy PBS. Dodać 1 ml denaturowanego termicznie BSA w PBS do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Trypsynizuj i policz wybrane komórki, podczas gdy komory durotaxis blokują się za pomocą denaturowanego ciepła BSA.</li>
	<li>Płytkę 1 x 105 komórek w objętości 2 ml do każdego dołka komory durotaxis, używając pożywki wymaganej dla danego typu komórek. Pozostawić komórki do przylegania i rozprowadzić na podłożu przez 4 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Komórki U2OS są rutynowo utrzymywane w DMEM z 10% FBS, uzupełnionymi 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianem sodu i 10 I.U./ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny. 
	UWAGA: Numer komórki użyty w tym przykładzie jest zoptymalizowany pod kątem komórek U2OS. Może być wymagana optymalizacja pod kątem innych typów komórek. Ta gęstość daje komórkom wystarczająco dużo miejsca do migracji bez znaczących interakcji z innymi komórkami.</li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie żywych komórek pod mikroskopem odwróconym, używając kontrastu fazowego z obiektywem 10X. Mikroskop powinien być wyposażony w zamkniętą, wilgotną komorę środowiskową, umożliwiającą kontrolę temperatury na poziomie 37 °C i 5% CO2 podczas długotrwałego obrazowania.</li>
	<li>Po rozproszeniu komórek przez około 3,5 godziny zmontuj płytkę w komorze mikroskopu. Pozostawić próbkę (próbki) do zrównoważenia w komorze przez 30 minut.</li>
	<li>Skonfiguruj zautomatyzowane, wielopunktowe wizyty na mikroskopie, jeśli są dostępne. Skoncentruj się na interfejsie między PDMS 90:1 a szklanym szkiełkiem nakrywkowym i wybierz punkty do obrazowania wokół interfejsu, ze średnią 40 punktami na komorę durotaxji. Obrazuj komórki co 10 minut przez maksymalnie 16 godzin. 
	UWAGA: Obszar zainteresowania pojawi się jako dwie linie, przy czym linia zewnętrzna odpowiada krawędzi szkiełka nakrywkowego, a linia wewnętrzna odpowiada rzeczywistemu interfejsowi między PDMS a szkiełkiem nakrywkowym. Zobacz rysunek 1B.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Wygeneruj arkusz kalkulacyjny jak w tabeli 1.</li>
	<li>Policz liczbę zdarzeń przejścia od PDMS do powierzchni szkła i odwrotnie od każdego wygenerowanego filmu. Zapisz liczbę zdarzeń skrzyżowania w odpowiedniej kolumnie w arkuszu kalkulacyjnym Excel. 
	UWAGA: Zdarzenie skrzyżowania definiuje się jako jądro komórkowe przechodzące przez granicę między PDMS a szkłem w dowolnym kierunku.</li>
	<li>Aby określić ilościowo wiele przecięć, policz, ile razy komórka przekroczyła interfejs. Liczba ta powinna być zapisana w kolumnie excela odpowiadającej podłożu, na którym znajdowała się komórka na końcu filmu. Powtórz analizę dla każdej komórki, która przecina interfejs w filmie. Wyklucz komórki, które migrują poza pole widzenia podczas obrazowania. 
	UWAGA: Ważne jest również, aby sprawdzić, poprzez liczenie komórek na początku eksperymentu, czy komórki są w stanie równomiernie przylegać do pokrytych fibronektyną PDMS i szklanych powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Oblicz procent komórek, które migrowały z PDMS na powierzchnię szkła (tj. Przeszły durotaksję). Zsumuj liczbę zdarzeń skrzyżowania z miękkiego na twardy oraz wiele zdarzeń skrzyżowania, które zakończyły się na twardym i podziel przez łączną liczbę zdarzeń skrzyżowania.</li>
	<li>Oblicz procent wielu przejazdów, dzieląc liczbę wielokrotnych przejazdów przez całkowitą liczbę przejazdów.</li>
</ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy prosty test do badania durotaksji w migrujących komórkach. Główną zaletą tego testu jest łatwość przygotowania komór durotaxji za pomocą PDMS. Sztywnością substratów można łatwo manipulować, zmieniając stosunek roztworu bazowego PDMS do środka sieciującego, aby umożliwić badanie różnych sztywności w teście. Jednak jednym z potencjalnych ograniczeń systemu jest to, że komórki są narażone tylko na pojedynczą zmianę sztywności substratu, w przeciwieństwie do gradientu sztywności, który jest zapewnian...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) składa się ze złożonego zestawu białek strukturalnych i sieciujących, w tym kolagenu, fibronektyny i lamininy. Chociaż powszechnie wiadomo, że ECM zapewnia ważne wsparcie strukturalne dla tkanek komórkowych, istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że komórki aktywnie reagują na zmiany fizyczne w środowisku ECM, regulując różne procesy komórkowe, w tym przeżycie komórek, różnicowanie i migrację komórek. Na przykład różnice w sztywności ECM mogą kierować mezenchymalne komórki macierzyste w kierunku różnych linii, przy czym miękkie podłoża (~1 kPa) promują linie neurogenne, podczas gdy sztywne (~25 kPa) substraty sprzyjają różnicowaniu osteogennemu1. Podobnie wykazano, że wzrost sztywności macierzy zrębu sprzyja nowotworzeniu komórek nabłonka sutka i inwazji do otaczającej tkanki2,3.
Szczególnie interesujący aspekt tej mechanosygnalizacji skutkuje procesem znanym jako durotaksja, w którym komórki migrują preferencyjnie w kierunku bardziej sztywnego substratu4,5. Komórki stale wyczuwają fizyczne cechy swojego środowiska zewnątrzkomórkowego poprzez wiązanie receptora integryny z ECM. To z kolei sprzyja akumulacji licznych białek strukturalnych i sygnałowych do ich domen cytoplazmatycznych w celu napędzania tworzenia struktur adhezyjnych znanych jako zrosty ogniskowe lub kontakty ogniskowe6,7. Ponieważ integryny nie mają wrodzonej aktywności enzymatycznej, sygnały są przekazywane z ECM przez te białka pomocnicze, aby koordynować odpowiedź komórki na zmieniające się środowisko8. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka kluczowych białek zaangażowanych w regulację mechanosygnalizacji i durotaksji jest ważnym obszarem badań.
Do badania durotaxji in vitro opracowano różne systemy modelowe, ale większość z nich wykorzystywała podłoża poliakrylamidowe pokryte kolagenem4. Jednak przygotowanie substratów poliakrylamidowych może być trudne technicznie, a kolagen stosowany w tych testach musi być chemicznie usieciowany z substratem9. Wykazano, że substraty polidimetylosiloksanu (PDMS) wykazują porównywalne właściwości mechaniczne do substratów poliakryloamidowych10. Jednak substraty PDMS są przygotowywane po prostu przez zmieszanie stosunku zasady do środka sieciującego, a substraty te mogą być pokryte białkami ECM bez potrzeby chemicznego sieciowania, dzięki czemu PDMS jest łatwiejszym narzędziem do badania wpływu sztywności na zachowanie komórki. W tym artykule opisujemy, jak przygotować prostą komorę durotaxis, w której miękkie podłoże PDMS jest zintegrowane ze szkiełkiem nakrywkowym ze szkiełka nakrywkowego.
Opisany poniżej test zapewnia szybką i prostą metodę badania durotaksji. W tym badaniu wykorzystaliśmy ludzkie komórki kostniakomięsaka U2OS w połączeniu z nokautacją cdGAP za pośrednictwem siRNA, aby zbadać rolę tego ogniskowego białka adhezyjnego w durotaxsji11. Co ważne, protokół ten może być łatwo dostosowany do indywidualnych wymagań. Inne typy komórek mogą być podstawione w miejsce komórek U2OS, a każde białko może zostać powalone lub nadmiernie eksprymowane w celu określenia wpływu na zachowanie komórek podczas durotaksji. Co więcej, protokół ten może zostać dostosowany do włączenia białek znakowanych fluorescencyjnie w celu analizy ich dynamiki i zachowania przy użyciu podejść FRAP lub FRET.

<table><tbody><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td></tr><tr><td>#1 Szkło nakrywkowe 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sód Pirogronian</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Skład i właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej są bardzo zróżnicowane w zależności od typu tkanki. Ta różnorodność zrębu tkanki łącznej ma ogromny wpływ na zachowanie komórek w celu regulacji normalnych i patologicznych procesów, w tym proliferacji komórek, różnicowania, sygnalizacji adhezji i migracji kierunkowej. W związku z tym wrodzona zdolność niektórych typów komórek do migracji w kierunku sztywniejszego lub mniej podatnego substratu macierzy jest określana jako durotaksja. Zjawisko to odgrywa ważną rolę podczas rozwoju embrionalnego, gojenia się ran i inwazji komórek rakowych. W tym miejscu opisujemy prosty test do badania durotaksji, in vitro, przy użyciu substratów polidimetylosiloksanu (PDMS). Przygotowanie opisanych komór durotaxji tworzy sztywną powierzchnię styku między stosunkowo miękkim żelem PDMS a szkiełkiem nakrywkowym ze szkiełka nakrywkowego. W podanym przykładzie użyliśmy tych komór dęciaka dwubiegunowego, aby zademonstrować rolę białka aktywującego GTPazę cdc42 / Rac1, cdGAP, w mechanowykrywaniu i regulacji dęcia dwuosiowego w ludzkich komórkach kostniakomięsaka U2OS. Test ten można łatwo dostosować do innych typów komórek i/lub knockdown innych białek będących przedmiotem zainteresowania w celu zbadania ich ról w mechanosygnalizacji i durotaksji.

Schemat komory do durotaksji przedstawiono na Rysunku 1A. Miękki substrat z PDMS (mieszanina bazy PDMS i utwardzacza w stosunku 90:1) rozprowadza się w płytce 6-dołkowej, a na wierzchu PDMS umieszcza się szklaną lamkę, która następnie częściowo pokrywa górną powierzchnię lamki, tworząc tym samym interfejs między dwoma substratami o różnej podatności. Sztywność miękkiego substratu z PDMS wynosi ~1 kPa, co jest porównywalne z typową podatnością tkanki mózgowej, podczas gdy sztywność szkła wynosi około 1-2 ...

Wiele komórek ssaków preferencyjnie migruje w kierunku bardziej sztywnej matrycy lub substratu poprzez durotaksję. Celem tego protokołu jest dostarczenie prostego systemu in vitro, który może być używany do badania i manipulowania zachowaniami durotaksji komórek poprzez włączenie substratów polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności, łączących się ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie uproszczonego systemu do analizy durotaksji komórkowej, w której wiele komórek ssaków migruje preferencyjnie w kierunku sztywniejszego podłoża. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie podłoży z polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności. Następnie przygotowany PDMS wlewa się do każdego dołka płytki sześciodołkowej i usuwa wszelkie pęcherzyki powietrza.Komory Durex są następnie dopełniane poprzez umieszczenie wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego na wierzchu PDMS w każdej studni w celu stworzenia nakładki. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek do komór Durex z gęstością, która zapewni komórkom wystarczającą przestrzeń do migracji bez istotnych interakcji z innymi komórkami. W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię żywych komórek do badania osi w migrujących komórkach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak żele poliakrylamidowe, jest istnienie pojedynczego przejścia między miękkim PDMS a sztywnym szkłem, zamiast stosowania alternatywnych żeli gradientowych. Ponadto powlekanie PDMS komponentami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak fibronektyna, nie wymaga sieciowania chemicznego, które jest niezbędne w przypadku żeli poliakrylamidowych. Aby przygotować jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, należy najpierw odważyć odpowiednią ilość materiału za pomocą probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Odważ około 10 g roztworu bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) do probówki o pojemności 50 ml. Dla podłoża w stosunku 90:1 podziel odważoną masę roztworu bazy PDMS przez 90. Aby określić właściwą ilość potrzebnego roztworu sieciującego, dodaj obliczoną ilość roztworu sieciującego PDMS do probówki; mieszaninę bazy i sieciującego PDMS mieszaj energicznie przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Na tym etapie, po użyciu małej szpatułki, w mieszaninie znajdzie się niewielka liczba pęcherzyków powietrza. Wirować podłoże PDMS w wirówce laboratoryjnej przez pięć minut przy 50 $\times$g. Pozostawić w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków, jeśli nadal są obecne.Po pięciu minutach ponownego wirowania, pipetujemy 1 mL podłoża PDMS w stosunku 90:1 do każdej studni 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowych. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza w PDMS można na tym etapie usunąć, przebijając je igłą o rozmiarze 21 G.Pozostaw PDMS w dołku na 30 minut, aby się rozprowadził. Następnie gotuj szklane lamelle nr 1 o średnicy 12 milimetrów w wodzie destylowanej przez pięć minut, powtórz tę czynność łącznie trzy razy. Umieść jedną osuszoną lamelkę w każdym dołku płytki do hodowli tkanek, delikatnie dotykając jednej krawędzi lamelki.Zanurz szkiełko nakrywkę w roztworze PDMS, a następnie upuść ją na PDMS. Gdy szkiełko nakrywka osiądzie, PDMS zacznie rozprzestrzeniać się poza krawędzie szkiełka, ale nie przykryje go całkowicie. Po utwardzeniu utworzy to interfejs pomiędzy PDMS a szkłem.Inkubuj płytkę w temperaturze 70 °C w inkubatorze przez 16 godzin, aby utwardzić PDMS. Na koniec umieść płytkę w komorze do hodowli komórkowych i sterylizuj promieniami UV przez 10 minut. Pokryj każdą komorę durox jedną mililitrem fibronektyny w fosforanie buforze soli (PBS) bez wapnia i magnezu przez jedną godzinę w temperaturze 30 °C.Należy upewnić się, że cała powierzchnia jest zanurzona w roztworze fibronektyny w PBS. Przygotować denaturowaną termicznie 1% albuminę surowicy bydlęcej lub BSA, odważając 0,5 g BSA i rozpuszczając ją w 50 ml przefiltrowanego PBS. Roztwór należy wysterylizować przez filtr 0,22 µm przed podgrzaniem do 80 °C przez 12 minut.Następnie odessać roztwór fibronektyny i przemyć komory trzykrotnie buforem PBS. Do każdej studniki dodać jeden mililitr BSA denaturowanego termicznie w PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć trypsyną i policzyć wybrane komórki, podczas gdy komory durex są blokowane za pomocą BSA denaturowanego termicznie. Odessać roztwór BSA z komór przed wysianiem komórek.Wysiej 10 000 komórek w objętości dwóch mililitrów do każdego dołka komory doax. Używając pożywki wymaganej dla wybranego typu komórek, pozwól komórkom przywrzeć i rozprzestrzenić się na podłożu przez cztery godziny w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, a następnie przeprowadź obrazowanie żywych komórek na mikroskopie odwróconym w kontraście fazowym z obiektywem 10 x. Mikroskop powinien być wyposażony w zamkniętą, nawilżaną komorę środowiskową, umożliwiającą kontrolę temperatury 37 °C i poziomu 5% CO2 podczas długoterminowego obrazowania.Obrazowanie: po tym, jak komórki rozprzestrzeniły się przez około 3,5 godziny, umieść płytkę w komorze mikroskopu. Pozostaw próbki w komorze na 30 minut w celu wyrównania temperatury i warunków. Jeśli jest to możliwe, skonfiguruj w mikroskopie zautomatyzowane odwiedzanie wielu punktów.Skup się na styku między PDMS a szkiełkiem podstawowym i wybierz punkty do obrazowania wokół całego tego interfejsu. Przy średnio 40 punktach na obraz z komory Durex, obrazując komórki co 10 minut przez maksymalnie 16 godzin, obszar zainteresowania pojawi się w postaci dwóch linii, z których linia zewnętrzna odpowiada krawędzi szkiełka, a linia wewnętrzna rzeczywistemu stykowi między PDMS a szkiełkiem. Aby przeanalizować dane, utwórz arkusz kalkulacyjny podobny do tego przedstawionego w protokole tekstowym.Policz liczbę zdarzeń przekroczenia granicy między PDMS a powierzchnią szklaną i odwrotnie dla każdego wygenerowanego filmu. Zdarzenie przekroczenia definiuje się jako przejście jądra komórkowego przez granicę między PDMS a szkłem w dowolnym kierunku. Zapisz liczbę zdarzeń przekroczenia w odpowiedniej kolumnie arkusza Excel, aby określić ilość wielokrotnych przekroczeń.Policz liczbę przejść komórki przez granicę faz. Liczbę tę należy zapisać w kolumnie arkusza Excel odpowiadającej podłożu, na którym komórka znajdowała się na końcu filmu. Powtórz analizę dla każdej komórki, która przekracza granicę faz w filmie.Należy wykluczyć komórki, które w trakcie obrazowania przemieściły się poza pole widzenia. Oblicz procent komórek, które migrowały z PDMS na powierzchnię szklaną i w związku z tym uległy durotaksis. Aby to zrobić:Zsumuj liczbę zdarzeń przejścia z miękkiego na twarde podłoże oraz liczbę wielokrotnych zdarzeń przejścia zakończonych na podłożu twardym, a następnie podziel wynik przez całkowitą liczbę zdarzeń przejścia. Oblicz procent wielokrotnych przejść, dzieląc sumę wielokrotnych przejść przez całkowitą liczbę przejść, aby rozpocząć analizę mechanizmu molekularnego, za pomocą którego komórki reagują na sygnały mechaniczne w swoim otoczeniu. Wybrane białka można wyciszyć za pomocą IRNA, zgodnie z przedstawioną tutaj metodą.Około 70% komórek kontrolnych traktowanych irna wykazywało axis. W uderzającym kontraście, po wyciszeniu CD gap za pomocą RNAi, komórki nie wykazywały preferencji co do tego, czy migrowały na podłoże twarde, czy miękkie. Co więcej, komórki z wyciszonym CD gap wielokrotnie przekraczały granicę.Podczas gdy komórki kontrolne traktowane irna zazwyczaj przekraczały granicę tylko raz, reprezentatywne ścieżki komórek kontrolnych irna pokazują, że komórki te zazwyczaj migrowały przez granicę raz i preferencyjnie pozostawały na sztywniejszej powierzchni w porównaniu do CD gap. Komórki traktowane irna, które nie wykazały preferencji co do sztywności, przekraczały granicę wielokrotnie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat przygotowywania podłoży PDMS, montażu komór duris oraz ilościowego oznaczania podatków DUR.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Platforma iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatyzuje proces jednoczesnego pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach. iTACS został zaprojektowany, aby ułatwić rozwój kierowany przez społeczność i umożliwić naukowcom korzystanie ze wszystkich funkcji platformy, niezależnie od ich wykształcenia.

Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Poznaj uproszczoną metodę badania durotaksji komórek ssaków przy użyciu podłoży PDMS o zdefiniowanej sztywności. Technika ta umożliwia obserwację migracji komórek w czasie rzeczywistym.

Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

Przeglądaj więcej filmów