Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA
May 5th, 2023
Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.
Protokół ma na celu zidentyfikowanie dysfunkcji białek prowadzących do zmian w liczbie cząsteczek mitochondrialnego DNA. Badania te mogą również ujawnić czynniki związane z dystrybucją mitochondrialnego DNA w mitochondriach. Mechanizmy replikacji i utrzymania mitochondriów wciąż nie są w pełni poznane.
Znacznie mniej wiadomo na temat regulacji dystrybucji genomów mitochondrialnych w organellach i zaangażowanych w nich białek. W związku z tym zidentyfikowanie i scharakteryzowanie niektórych nowych graczy będzie miało ogromne znaczenie. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka przepustowość i protokół o wysokiej zawartości.
Możemy jednocześnie testować wiele warunków eksperymentalnych i mierzyć różne parametry podczas jednego eksperymentu. W badaniach obejmujących cały genom proponowany protokół daje możliwość nakreślenia globalnego obrazu tego, w jaki sposób informacja genetyczna kodowana jądrowo reguluje swój mitochondrialny odpowiednik. Ponadto ma potencjał do identyfikacji białek, których dysfunkcja powoduje stres w mitochondrialnym DNA i aktywuje szlak odpowiedzi interferonowej.
Na początek przygotuj 140-nanomolową mieszaninę małych interferujących RNA lub siRNA, rozcieńczając siRNA w pożywce Opti-MEM. Dodać pięć mikrolitrów rozcieńczonej mieszanki do dołków czarnej mikropłytki do hodowli komórkowych z 384 dołkami. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu odczynnika do transfekcji RNAiMAX w pożywce Opti-MEM i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki.
Z płytki 384-dołkowej z dozownikiem odczynników. Aby rozpocząć transfekcję komórek, dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek HeLa do 384 dołków zawierających rozcieńczone siRNA, aby zasiać 700 komórek HeLa na studzienkę. Po godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej umieść studzienkę w inkubatorze na 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Aby włączyć BrdU do transfekowanych komórek, dodaj 10 mikrolitrów 90-mikromolowego roztworu BrdU do każdego dołka po 56 godzinach transfekcji siRNA. Inkubuj komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Specyfikę włączenia BrdU do mitochondrialnego DNA komórek HeLa badano przy użyciu komórek rzędu zerowego pozbawionych mitochondrialnego DNA.
Aby rozpocząć znakowanie mitochondriów, przygotuj 20-mikromolowy roztwór BrdU w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Następnie dodaj barwnik śledzący mitochondria, aby dostosować końcowe stężenie do 1,1 mikromola. Po 15 godzinach dodaj 10 mikrolitrów roztworu barwnika śledzącego mitochondria do zawiesiny komórek HeLa zawierającej studzienki.
Inkubuj komórki przez godzinę. Warunki użyte do znakowania nowo zsyntetyzowanych cząsteczek DNA za pomocą BrdU pozwoliły na wykrycie DNA znakowanego BrdU w mitochondriach komórek HeLa. Sygnał uzyskany za pomocą przeciwciał anty BrdU był specyficzny i obserwowano go tylko w komórkach traktowanych BrdU niezależnie od leczenia BrdU, w mitochondriach komórek rzędu zero nie wykryto sygnału przeciwciała anty-BrdU lub anty-DNA.
Kwantyfikacja sygnału fluorescencyjnego z przeciwciał anty BrdU wykazała, że komórki rzędu zero traktowane BrdU wykazywały ten sam niski poziom fluorescencji, co komórki nietraktowane BrdU, podczas gdy sygnał dla linii rodzicielskich A549 i HeLa był 50 razy wyższy. Aby rozpocząć utrwalanie komórek HeLa, należy dwukrotnie przepłukać komórkę HeLa zawierającą płytkę 384-dołkową 100 mikrolitrami PBS za pomocą myjki do mikropłytek. Pozostaw 25 mikrolitrów PBS w studzience po drugim umyciu i dodaj 25 mikrolitrów 8% roztworu formaldehydu.
Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przepłucz każdą studzienkę cztery razy 100 mikrolitrami PBS i pozostaw 25 mikrolitrów PBS w studzience po ostatnim myciu. Dodać 25 mikrolitrów 6% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA w PBS do każdego dołka i inkubować płytkę w ciemności przez 30 minut.
Aby rozpocząć dodawanie przeciwciała pierwotnego, należy odessać albuminę surowicy bydlęcej lub BSA z utrwalonych i zablokowanych transfekowanych komórek HeLa, pozostawiając 10 mikrolitrów roztworu BSA w studzience. Następnie dodać 10 mikrolitrów pierwszorzędowego roztworu przeciwciała przygotowanego w 3% BSA w PBS i inkubować płytkę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 mikrolitrami PBS, pozostawiając 10 mikrolitrów po ostatnim myciu.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do płytki 384-dołkowej. Używaj przeciwciał specyficznych dla izotypu sprzężonych z fluorochromami, takich jak Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 555. Po inkubacji płytki w ciemności przez godzinę, przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 mikrolitrami PBS i pozostawić 50 mikrolitrów PBS w studzience po ostatnim myciu.
Zastosowanie przeciwciał anty DNA pozwoliło na monitorowanie rozmieszczenia mitochondrialnego DNA w komórce w danych warunkach eksperymentalnych. Regulacja w dół mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A, TFAM, doprowadziła do drastycznych zmian w dystrybucji mitochondrialnego DNA z mniejszą liczbą mitochondrialnych plamek DNA niż w komórkach kontrolnych. Kwantyfikacja średniego sygnału fluorescencyjnego z przeciwciała anty-DNA wykazała kilkukrotny wzrost po wyciszeniu TFAM w porównaniu z innymi badanymi warunkami.
Aby rozpocząć obrazowanie transfekowanych komórek HeLa, wybierz wystarczająco długi czas ekspozycji dla poszczególnych kanałów fluorescencyjnych w trybie podglądu na żywo w oparciu o histogramy intensywności wygenerowane przez oprogramowanie do obrazowania. Ustaw odpowiednią liczbę płaszczyzn do obrazowania na osi Z. Wybierz odpowiednią liczbę pól widoku do wyświetlenia dla każdego dołka.
Aby rozpocząć analizę ilościową pozyskanych obrazów, należy wykonać korekcję tła dla wszystkich obrazów ze wszystkich kanałów fluorescencyjnych. W zależności od wielkości analizowanych obiektów należy wybrać odpowiedni rozmiar filtra. Następnie rozpocznij segmentację obrazu od stworzenia maski głównego obiektu na podstawie stosunku intensywności sygnału fluorescencji do tła dla kanału odpowiadającego jądrom komórkowym.
Twórz maski dla podobiektów reprezentujących BrdU i plamki mitochondrialnego DNA, korzystając z kanałów fluorescencyjnych właściwych dla danych struktur. Ustaw parametry i zmierz intensywność poszczególnych pikseli w każdej masce dla wszystkich kanałów fluorescencji. Aby uzyskać całkowite intensywności fluorescencji dla BrdU lub mitochondrialnego kanału DNA, należy zsumować intensywności wszystkich podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego.
Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji, należy podzielić całkowitą intensywność fluorescencji przez sumę powierzchni podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego. Wyniki obrazowania zweryfikowano poprzez pomiar poziomu mitochondrialnego DNA i ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Leczenie dideoksycytydyną, czyli ddC, skutkowało bardzo silnym spadkiem poziomu mitochondrialnego DNA.
Słabszy efekt zaobserwowano w przypadku wyciszania TFAM i helikazy migotania, podczas gdy transfekcja komórek z polimerazą gamma mitochondrialnego DNA lub siRNA POLG miała niewielki wpływ na liczbę kopii mitochondrialnego DNA. Kwantyfikacja TFAM i ekspresji helikazy migotania potwierdziła skuteczne zmniejszenie ekspresji mRNA do około 15 do 20% poziomów kontrolnych. W POLG ekspresja mRNA została zmniejszona tylko do 30%, co wyjaśnia nieoczekiwany skromny wpływ na liczbę kopii mitochondrialnego DNA.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół wysoko-przepustowy do badania metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach. Metoda wykorzystuje zautomatyzowane obrazowanie immunofluorescencyjne do wykrywania i ilościowego określania syntezy i dystrybucji mtDNA, umożliwiając badania nad wpływem inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszenia genów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Dynamika mitochondriów
Tło
- Mechanizmy replikacji i utrzymania mitochondrialnego DNA nie są w pełni zrozumiane.
- Dystrybucja mitochondrialnego DNA w organellach jest słabo scharakteryzowana.
- Identyfikowanie białek zaangażowanych w dystrybucję mtDNA jest kluczowe dla zrozumienia funkcji mitochondriów.
- Techniki wysoko-przepustowe mogą ulepszyć badania nad dynamiką mtDNA.
Cel badania
- Badanie dynamiki metabolizmu mtDNA w komórkach.
- Zbadanie wpływu różnych warunków komórkowych na syntezę i dystrybucję mtDNA.
- Identyfikowanie nowych białek zaangażowanych w regulację mtDNA.
Stosowane metody
- Format płytki wielootworowej dla analizy wysoko-przepustowo.
- Zautomatyzowane obrazowanie immunofluorescencyjne do ilościowego określania.
- Zastosowanie inhibitorów i technik wyciszenia genów.
- Ocenienie wpływu stresów komórkowych na metabolizm mtDNA.
Główne wyniki
- Identyfikacja białek wpływających na liczbę cząsteczek mtDNA.
- Wgląd w czynniki wpływające na dystrybucję mtDNA w mitochondriach.
- Demonstracja efektywności protokołu w analizie wysoko-zawartościowej.
- Potencjalni nowi gracze w regulacji mtDNA zidentyfikowani.
Wnioski
- Opracowany protokół zapewnia solidną ramę dla badania dynamiki mtDNA.
- Zrozumienie metabolizmu mtDNA może ujawnić ważne mechanizmy komórkowe.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych znaleziskach, aby dalsze eksplorować funkcję mitochondriów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput image-based quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) synthesis and distribution enables systematic interrogation of mitochondrial genome maintenance under diverse perturbations. This capability is critical for de-risking early discovery programs targeting mitochondrial function and for clarifying the mechanistic impact of gene silencing or compound treatment on cellular bioenergetics. The approach supports predictive confidence in target validation and informs risk-adjusted portfolio decisions in disease-relevant contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of nuclear-encoded regulators of mtDNA replication and distribution.
- Supports identification of proteins whose dysfunction triggers mitochondrial DNA stress responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying direct effects on mitochondrial genome integrity.
- Provides high-content data for prioritizing targets with mitochondrial relevance.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts of mtDNA synthesis and distribution for assay standardization.
- Supports high-throughput screening of gene knockdowns or small molecules affecting mitochondrial function.
- Enables reproducible, scalable workflows using multi-well formats and automated imaging.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial genome maintenance metrics with disease-relevant cellular models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of mitochondrial targets.
- Supports translational biomarker development by linking mtDNA dynamics to functional outcomes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of mitochondrial modulators in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, high-throughput assessment of mitochondrial genome maintenance in cell-based models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nuclear-mitochondrial interactions and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Delivers fluorescence-based measurements for comparing gene silencing, inhibitor, or stress conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial DNA metrics to disease-relevant phenotypes when supported by model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, high-content platform adaptable to diverse genetic or pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative mtDNA analysis across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying mitochondrial risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging and quantitative fluorescence analysis.
- Needs automated microscopy platforms and robust image analysis software.
- Demands cross-team standardization of cell culture, labeling, and analysis protocols.
- Adaptable to various cell lines and genetic perturbations with protocol optimization.
- Dependent on validated antibodies and dyes for specificity and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:21
Preparation of siRNA Mixture for Mitochondrial DNA Synthesis
2:00
Cell Transfection and 5‐Bromo‐2’‐Deoxyuridine (BrdU) Incorporation in HeLa Cells
3:14
5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells
4:51
HeLa Cell Fixation with Hoechst 33342 and Blocking
5:51
Addition of Primary and Secondary Antibodies to the Transfected HeLa Cells to Monitor the mtDNA Distribution
7:49
Quantitative Image Analysis to Measure the mtDNA and Gene Expression Levels in the Transfected HeLa Cells
