Name: Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę obrazowania immunofluorescencyjnego do kwantyfikacji syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA w komórkach. Technika umożliwia identyfikację białek regulujących metabolizm mtDNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki, Polska (numer grantu/nagrody: 2018/31/D/NZ2/03901).

1. Przygotowanie mieszaniny siRNA
<ol>
	<li>Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu komórki nasienne (np. HeLa) umieszcza się na szalce o średnicy 100 mm, tak aby następnego dnia osiągnęły 70%-90% konfluencji. 
	UWAGA: Wszystkie operacje muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią ilość siRNA rozcieńczonego do stężenia 140 nM w pożywce Opti-MEM (patrz tabela materiałów). Jako zbiornik może służyć 96-dołkowa płytka.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu siRNA (lub pożywki Opti-MEM dla próbek kontrolnych) do każdej studzienki czarnej 384-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej. 
	UWAGA: W zależności od liczby badanych próbek siRNA można użyć pipety elektronicznej lub wielokanałowej.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią ilość roztworu odczynnika do transfekcji RNAiMAX (patrz tabela materiałów) w pożywce Opti-MEM. Dodać 1 μL RNAiMAX na każde 100 μL pożywki.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu odczynnika do transfekcji do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Najwygodniejszym i najszybszym sposobem na to jest użycie dozownika odczynników.</li>
	<li>Inkubować siRNA z odczynnikiem do transfekcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Podczas inkubacji (etap 1.6) odessać pożywkę za pomocą urządzenia ssącego (patrz Tabela Materiałów) i przemyć komórki 3 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml trypsyny rozcieńczonej w stosunku 1:2 w PBS i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki się odłączyły; jeśli tak, dodaj 3 ml pożywki DMEM z 10% FBS. Dokładnie zawieś komórki i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Pobrać co najmniej 150 μl zawiesiny i policzyć komórki w komorze do liczenia komórek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę komórkową o odpowiednim stężeniu (35 000/ml dla linii HeLa) w pożywce DMEM z 10% FBS, penicyliną i streptomycyną.</li>
</ol>
3. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Dodać 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą dozownika odczynników. Spowoduje to wysianie 700 komórek w każdym dołku.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić je w inkubatorze na 72 godziny (37 °C i 5% CO2 ).</li>
</ol>
4. Założenie BrdU
<ol>
	<li>Przygotować 90 μM roztwór BrdU (patrz tabela materiałów) w podłożu DMEM z 10% FBS.</li>
	<li>Po 56 godzinach od transfekcji siRNA (16 godzin przed utrwaleniem komórek) dodać 10 μl 90 μM roztworu BrdU do każdego dołka płytki 384-dołkowej (końcowe stężenie BrdU wynosi 20 μM). 
	UWAGA: Czynność należy wykonać tak szybko, jak to możliwe; Dlatego najlepiej jest używać dozownika odczynników, pipety elektronicznej lub pipety z wieloma dozownikami. Należy pamiętać o przygotowaniu studzienek kontrolnych bez dodatku BrdU.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 16 godzin (37 °C i 5% CO2 ).</li>
</ol>
5. Etykietowanie mitochondriów
<ol>
	<li>Przygotować 20 μM roztwór BrdU w DMEM z 10% FBS i dodać do niego roztwór barwnika śledzącego mitochondria (patrz tabela materiałów) do stężenia 1,1 μM.</li>
	<li>Po 15 godzinach od rozpoczęcia inkorporacji BrdU (1 godzinę przed utrwaleniem komórek) dodać 10 μl roztworu barwnika śledzącego mitochondria (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka płytki 384-dołkowej (końcowe stężenie barwnika wynosi 200 nM). 
	UWAGA: Użyj dozownika odczynników, pipety elektronicznej lub pipety z wieloma dozownikami. Pamiętaj, aby zachować studzienki kontrolne bez dodatku BrdU, ale z dodatkiem barwnika śledzącego mitochondria.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę (37 °C i 5% CO2 ).</li>
</ol>
6. Utrwalanie komórek
UWAGA: Całe mycie najwygodniej przeprowadza się za pomocą myjki do mikropłytek, natomiast dodawanie odczynników najszybciej odbywa się za pomocą dozownika odczynników.
<ol>
	<li>Za pomocą myjki do mikropłytek (patrz tabela materiałów) przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 100 μl PBS. Po drugim płukaniu pozostaw 25 μl PBS w studzience. 
	UWAGA: Pozostawienie PBS w studzience zmniejsza prawdopodobieństwo oderwania się komórek podczas dodawania płynu w następnym kroku. Wszystkie prania są zakończone z pozostawionym PBS; dlatego roztwór dodany w następnym kroku powinien być zawsze przygotowywany w stężeniu 2x, ponieważ zostanie dodany w równej objętości do pozostałego PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 25 μl 8% roztworu formaldehydu w PBS z 0,4% Triton X-100 i Hoechst 33342 w stężeniu 4 μg/ml (końcowe stężenia poszczególnych odczynników wynoszą odpowiednio 4%, 0,2% i 2 μg/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
7. Blokowanie
<ol>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 25 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 25 μl 6% BSA w PBS (końcowe stężenie BSA wynosi 3%) do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
8. Dodanie pierwszorzędowych przeciwciał
<ol>
	<li>Odessać BSA za pomocą myjki do mikropłytek i pozostawić 10 μl roztworu w studzience.</li>
	<li>Dodać 10 μl pierwszorzędowego roztworu przeciwciała przygotowanego w 3% BSA w PBS. Stosować anty-BrdU w stężeniu 0,8 μg/ml i anty-DNA w stężeniu 0,4 μg/ml (końcowe stężenia przeciwciał wynoszą odpowiednio 0,4 μg/ml i 0,2 μg/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
9. Dodanie przeciwciał drugorzędowych
<ol>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 10 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych o stężeniu 4 μg/ml przygotowanego w 6% powierzchni ciała w PBS (końcowe stężenie wynosi 2 μg/ml). Stosować przeciwciała specyficzne dla izotypu (anty-mysie IgG1 i anty-mysie IgM) sprzężone z fluorochromami, takimi jak Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 555 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 μl PBS. Po ostatnim praniu pozostaw w studzience 50 μl PBS.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę samoprzylepną folią uszczelniającą (patrz tabela materiałów) i przechowywać ją w ciemności w temperaturze 4 °C. Obrazowanie należy wykonać w ciągu 2 tygodni.</li>
</ol>
10. Obrazowanie
UWAGA: Obrazowanie musi być wykonywane za pomocą automatycznego mikroskopu szerokokątnego; mikroskop musi być wyposażony w stopień motoryczny wyposażony w elementy sterujące do automatycznego obrazowania poszczególnych obszarów płytki.
<ol>
	<li>Sprawdź ustawienia autofokusa w rogach płyty (dołki A1, A24, P24, P1) i pośrodku. 
	UWAGA: Do obrazowania zaleca się używanie obiektywu o 20-krotnej krótkiej odległości roboczej (patrz Tabela materiałów) z najwyższym możliwym otworem numerycznym.</li>
	<li>Na podstawie histogramów intensywności generowanych przez oprogramowanie do obrazowania w trybie podglądu na żywo wybierz wystarczająco długi czas naświetlania dla poszczególnych kanałów fluorescencji, aby uzyskany obraz nie był przesycony.</li>
	<li>Ustaw odpowiednią liczbę płaszczyzn do obrazowania na osi z. 
	UWAGA: Pole widzenia przy 20-krotnym powiększeniu jest na tyle duże, że nie wszystkie komórki znajdują się w tej samej płaszczyźnie ostrości, dlatego należy wykonać przekrój z, aby wyświetlić wszystkie komórki w ich prawidłowej płaszczyźnie ostrości. Zwykle wystarczy pięć samolotów. W zależności od dostępności miejsca na dysku, można zapisać pojedyncze stosy z lub tylko projekcje maksymalnej intensywności. Analiza obrazu przedstawiona w sekcji reprezentatywnych wyników opiera się na projekcjach maksymalnej intensywności.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią liczbę pól widoku do wyświetlenia dla każdego dołka. 
	UWAGA: W zależności od konfluencji, w jednym polu widzenia można zobrazować około 60-300 komórek. Zazwyczaj w przypadku komórek HeLa o konfluencji 60%-90% obrazowanie pięciu pól widzenia pozwoli na analizę od 500 komórek do ponad 1000 komórek.</li>
	<li>Wybierz studnie, które mają zostać zobrazowane, i rozpocznij obrazowanie.</li>
</ol>
11. Ilościowa analiza obrazu
UWAGA: Analiza ilościowa pozyskanych obrazów może być przeprowadzona za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak Cell Profiler15. Na potrzeby niniejszego badania analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ScanR 3.0.0 (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Rozpocznij analizę od wykonania korekcji tła dla wszystkich obrazów ze wszystkich kanałów fluorescencji. W zależności od wielkości analizowanych obiektów należy dobrać odpowiedni rozmiar filtra: 80 pikseli dla jąder komórkowych i 4 piksele dla plamek BrdU i mtDNA.</li>
	<li>Segmentację obrazu należy rozpocząć od stworzenia maski głównego obiektu na podstawie stosunku intensywności sygnału fluorescencji do tła dla kanału odpowiadającego jądrom komórkowym.</li>
	<li>Utwórz maski dla podobiektów reprezentujących odpowiednio plamki BrdU i mtDNA, korzystając z kanałów fluorescencyjnych odpowiednich dla danych struktur. 
	UWAGA: Każdy podobiekt jest przypisany do najbliższego obiektu głównego (jądra komórkowego).</li>
	<li>Ustaw parametry, które mają być mierzone podczas analizy, i zmierz intensywność poszczególnych pikseli w każdej masce dla wszystkich kanałów fluorescencji. 
	UWAGA: Konieczne jest również obliczenie liczby podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego oraz powierzchni każdego podobiektu.</li>
	<li>Zdefiniuj parametry pochodne, które mają być obliczane na podstawie uzyskanych danych. Aby uzyskać całkowite intensywności fluorescencji dla kanału BrdU lub mtDNA, należy zsumować natężenia wszystkich podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego. Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji, należy podzielić całkowitą intensywność fluorescencji przez sumę powierzchni podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że utworzony podobiekt (plamka BrdU lub mtDNA) jest rzeczywiście zlokalizowany w mitochondriach, konieczne jest ich bramkowanie w oparciu o intensywność fluorescencji z barwnika śledzącego mitochondria.</li>
	<li>Przeprowadź dalszą analizę danych uzyskanych za pomocą oprogramowania ScanR za pomocą oprogramowania statystycznego R 4.2.2 Software16 wraz z następującymi pakietami: dplyr17, data.table18, ggplot219 i ggpubr20. Ten krok jest opcjonalny.</li>
</ol>

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

<ol><li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+and+metabolic+interplay+of+redox+regulation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation).</a> Redox Biology. 26, 101284(2019).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+Mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+TCA+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nature Communications. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+cellular+life%2C+stress%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li>
<li>Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+transport+in+steroid+biosynthesis%3A+role+of+protein-protein+interactions+and+implications+in+disease+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).</li>
<li>Swenson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synthesis+to+utilization%3A+The+ins+and+outs+of+mitochondrial+heme%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme.</a> Cells. 9 (3), 579(2020).</li>
<li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+In+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+circles%2C+forks+and+humanity%3A+Topological+organisation+and+replication+of+mammalian+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA.</a> BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).</li>
<li>Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+and+expression+of+mammalian+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).</li>
<li>Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+and+segregating+the+human+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Separating and segregating the human mitochondrial genome.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+Improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).</li>
<li>Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=dplyr">https://CRAN.R-project.org/package=dplyr</a> (2021).</li>
<li>Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=data.table">https://CRAN.R-project.org/package=data.table</a> (2020).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ggplot2.tidyverse.org">https://ggplot2.tidyverse.org</a> (2016).</li>
<li>Kassambara, A. ggpubr: &#34;ggplot2&#34; based publication ready plots. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr">https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr</a> (2020).</li>
<li>Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+cell+lines+lacking+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).</li>
<li>Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+mitochondrial+genome+responses+in+HeLa+cells+treated+with+inhibitors+of+mitochondrial+DNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression.</a> Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).</li>
<li>Spelbrink, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+deletions+associated+with+mutations+in+the+gene+encoding+Twinkle%2C+a+phage+T7+gene+4-like+protein+localized+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria.</a> Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).</li>
<li>Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+regulates+mitochondrial+transcription+initiation%2C+DNA+packaging%2C+and+genome+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).</li>
<li>Krasich, R., Copeland, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+in+the+mitochondria%3A+A+critical+review+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence.</a> Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).</li>
<li>Kotrys, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+revealed+C6orf203%2FMTRES1+as+a+factor+preventing+stress-induced+transcription+deficiency+in+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria.</a> Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).</li>
<li>Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleic+acid+replication+in+single+cells+and+chromosomes+by+immunologic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+biogenesis%3A+visualization+and+duel+incorporation+of+BrdU+and+EdU+into+newly+synthesized+mtDNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+measurements+of+heterogeneity+in+HeLa+cells+across+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Historycznie rzecz biorąc, znakowanie DNA przez inkorporację BrdU i wykrywanie przeciwciał było wykorzystywane w replikacji jądrowego DNA i badaniach nad cyklem komórkowym 14,27,28. Do tej pory wszystkie protokoły wykrywania DNA znakowanego BrdU obejmowały etap denaturacji DNA (kwaśny lub termiczny) lub trawienie enzymatyczne (DNaza lub proteinaza), aby umożliwić ekspozycję na epitopy i ułatwić penetrację przeciwciał. Protokoły ...

Dla większości komórek eukariotycznych mitochondria są niezbędnymi organellami, ponieważ odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Przede wszystkim mitochondria są kluczowymi dostawcami energii dla komórek1. Mitochondria są również zaangażowane w regulację homeostazy komórkowej (na przykład wewnątrzkomórkowa klasa redoks2 i równowaga wapniowa < klasa sup = 'xref'>3), sygnalizacja komórkowa < klasa sup = 'xref'>4,< klasa sup = 'xref'>5, apoptoza < klasa sup = 'xref'>6, synteza różnych związków biochemicznych < klasa sup = 'xref'> 7,< klasa sup = 'xref'>8 oraz wrodzona odpowiedź immunologiczna< klasa sup = 'xref'>9. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z różnymi stanami patologicznymi i chorobami ludzkimi10. 
Funkcjonowanie mitochondriów zależy od informacji genetycznej znajdującej się w dwóch oddzielnych genomach: jądrowym i mitochondrialnym. Genom mitochondrialny koduje niewielką liczbę genów w porównaniu z genomem jądrowym, ale wszystkie geny kodowane przez mtDNA są niezbędne dla życia człowieka. Mitochondrialna maszyneria białkowa niezbędna do utrzymania mtDNA jest kodowana przez nDNA. Podstawowe składniki replikosmu mitochondrialnego, a także niektóre czynniki biogenezy mitochondriów, zostały już zidentyfikowane (omówione w poprzednich badaniach11,12). Jednak mechanizmy replikacji i utrzymania mitochondrialnego DNA są nadal dalekie od zrozumienia. W przeciwieństwie do nDNA, genom mitochondrialny występuje w wielu kopiach, co zapewnia dodatkową warstwę do regulacji ekspresji genów mitochondrialnych. Obecnie znacznie mniej wiadomo na temat dystrybucji i segregacji mtDNA w organellach, w jakim stopniu procesy te są regulowane, a jeśli tak, to jakie białka są w nie zaangażowane13. Wzorzec segregacji ma kluczowe znaczenie, gdy komórki zawierają mieszaną populację mtDNA typu dzikiego i zmutowanego. Ich nierównomierne rozmieszczenie może prowadzić do powstawania komórek ze szkodliwą ilością zmutowanego mtDNA.
Do tej pory, czynniki białkowe niezbędne do utrzymania mtDNA były identyfikowane głównie za pomocą metod biochemicznych, analiz bioinformatycznych lub badań związanych z chorobami. W niniejszej pracy, w celu zapewnienia dużej szansy na zidentyfikowanie czynników, które wcześniej wymykały się identyfikacji, opisano inną strategię. Metoda opiera się na znakowaniu mtDNA podczas replikacji lub naprawy za pomocą 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), nukleozydowego analogu tymidyny. BrdU jest łatwo włączany do powstających nici DNA podczas syntezy DNA i, ogólnie rzecz biorąc, jest używany do monitorowania replikacji jądrowego DNA14. Jednak opracowana tutaj procedura została zoptymalizowana pod kątem wykrywania BrdU wbudowanego w mtDNA za pomocą immunofluorescencji przeciwciał anty-BrdU.
Podejście pozwala na wysokoprzepustową kwantyfikację syntezy i dystrybucji mtDNA w ludzkich komórkach hodowanych in vitro. Strategia wysokiej przepustowości jest niezbędna do przeprowadzenia testów w różnych warunkach eksperymentalnych w stosunkowo krótkim czasie; W związku z tym w protokole proponuje się wykorzystanie formatu wielodołkowego do hodowli komórek i zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania. Protokół obejmuje transfekcję ludzkich komórek HeLa z biblioteką siRNA, a następnie monitorowanie replikacji lub naprawy mtDNA za pomocą znakowania metabolicznego nowo zsyntetyzowanego DNA za pomocą BrdU. Podejście to łączy się z barwieniem immunologicznym DNA za pomocą przeciwciał anty-DNA. Oba parametry są analizowane za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo mitochondria są wizualizowane za pomocą określonego barwnika. Aby zademonstrować specyficzność protokołu, barwienie BrdU przetestowano na komórkach pozbawionych mtDNA (komórki rho0), na komórkach HeLa po wyciszeniu dobrze znanych czynników podtrzymujących mtDNA oraz na komórkach HeLa po leczeniu inhibitorem replikacji mtDNA. Poziomy mtDNA mierzono również niezależną metodą, a mianowicie qPCR.

<table><tbody><tr><td>2&,3&prime;-Dideoksycytydyna (ddC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5782</td><td></td></tr><tr><td>384&nbsp; Mikropłytki do hodowli komórkowych Well, czarne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#781946</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoksyurydyna (BrdU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-1G</td><td>Rozpuścić proszek BrdU w wodzie do 20 mM roztworu podstawowego i podwielokrotności. Użyj 20 i mikro; Rozwiązanie M BrdU do etykietowania.</td></tr><tr><td>Samoprzylepna folia uszczelniająca</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-095-0060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1</td><td>wtórne Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 kozie przeciwciało anty-mysie IgM</td><td>wtórne Thermo Fisher</td><td>Scientific A-21426</td><td></td></tr><tr><td>BioTek 405 LS myjka mikropłytek</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Komora do liczenia komórek Thoma</td><td>Heinz Herenz</td><td>REF:1080339</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Formaldehyd jest toksyczny; prosimy o uważne zapoznanie się z kartą charakterystyki.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 mysie przeciwciało monoklonalne anty-BrdU (IIB5) pierwotne Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne IgM</td><td>Progen</td> <td># 61014</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#13778150</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>Barwnik śledzący mitochondria&nbsp;</td></tr><tr><td>Dozownik odczynników Multidrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Orca-R2 (C10600) Kamera CCD</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>qPCR starter Fw B2M (odniesienie)</td><td></td><td></td><td>CAGGTACTCCAAAGATTCAGG&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter qPCR Fw GPI (gen referencyjny)</td><td></td><td></td><td>GACCTTTACTACCCAGGAGA</td></tr><tr><td>Starter qPCR Fw MT-ND1&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TAGCAGAGACCAACCGAACC&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter qPCR Fw POLG</td><td></td><td></td><td>TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC</td></tr><tr><td>qPCR starter Fw TFAM</td><td></td><td></td><td>GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT</td></tr><tr><td>qPCR primer Fw TWNK</td><td></td><td></td><td>GCCATGTGACACTGGTCATT</td></tr><tr><td>qPCR primer Rev B2M (odniesienie)</td><td></td><td></td><td>GTCAACTTCAATGTCGGATGG&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter qPCR Rev GPI (gen referencyjny)</td><td></td><td></td><td>AGTAGACAGGGCAACAAAGT</td></tr><tr><td>starter qPCR Rev MT-ND1&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ATGAAGAATAGGGCGAAGGG&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter qPCR Rev POLG</td><td></td><td></td><td>GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG</td></tr><tr><td>Starter qPCR Rev TFAM</td><td></td><td></td><td>GGACTTCTGCCAGCATAATA</td></tr><tr><td>Starter qPCR Rev TWNK</td><td></td><td></td><td>AACATTGTCTGCTTCCTGGC</td></tr><tr><td>Mikroskop ScanR</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA Ctrl</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-5</td><td></td></tr><tr><td>siRNA POLG</td><td>Invitrogen</td><td>POLGHSS108223</td><td></td></tr><tr><td>siRNA TFAM</td><td>Invitrogen</td><td>TFAMHSS144252</td><td></td></tr><tr><td>siRNA TWNK</td><td>Invitrogen</td><td>C10orf2HSS125597</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie ssące</td><td>NeoLab</td><td>2-9335</td><td>Urządzenie ssące do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biowest</td><td>L0931-500</td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x 0,75 NA cel</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego dna

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

Zdecydowana większość procesów komórkowych wymaga ciągłego dostarczania energii, której najczęstszym nośnikiem jest cząsteczka ATP. Komórki eukariotyczne wytwarzają większość ATP w mitochondriach przez fosforylację oksydacyjną. Mitochondria są wyjątkowymi organellami, ponieważ mają własny genom, który jest replikowany i przekazywany następnemu pokoleniu komórek. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, w komórce znajduje się wiele kopii genomu mitochondrialnego. Szczegółowe badanie mechanizmów odpowiedzialnych za replikację, naprawę i utrzymanie genomu mitochondrialnego jest niezbędne do zrozumienia prawidłowego funkcjonowania mitochondriów i całych komórek zarówno w warunkach normalnych, jak i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metodę, która pozwala na wysokoprzepustową kwantyfikację syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach ludzkich hodowanych in vitro. Podejście to opiera się na immunofluorescencyjnej detekcji aktywnie zsyntetyzowanych cząsteczek DNA znakowanych przez inkorporację 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) i jednoczesnym wykrywaniu wszystkich cząsteczek mtDNA z przeciwciałami anty-DNA. Dodatkowo mitochondria są wizualizowane za pomocą określonych barwników lub przeciwciał. Hodowla komórek w formacie wielodołkowym i wykorzystanie automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego ułatwiają badanie dynamiki mtDNA i morfologii mitochondriów w różnych warunkach eksperymentalnych w stosunkowo krótkim czasie.

Schemat procedury wysokoprzepustowych badań dynamiki syntezy i dystrybucji mtDNA przedstawiono na Rysunku 1. Zastosowanie formatu wielodołkowej płytki umożliwia jednoczesną analizę wielu różnych warunków eksperymentalnych, takich jak wyciszanie różnych genów przy użyciu biblioteki siRNA. Warunki zastosowane do znakowania nowo syntetyzowanych cząsteczek DNA za pomocą BrdU pozwalają na wykrycie DNA znakowanego BrdU w mitochondriach komórek HeLa (Rysunek 2A), ale m...

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Protokół ma na celu zidentyfikowanie dysfunkcji białek prowadzących do zmian w liczbie cząsteczek mitochondrialnego DNA. Badania te mogą również ujawnić czynniki związane z dystrybucją mitochondrialnego DNA w mitochondriach. Mechanizmy replikacji i utrzymania mitochondriów wciąż nie są w pełni poznane.Znacznie mniej wiadomo na temat regulacji dystrybucji genomów mitochondrialnych w organellach i zaangażowanych w nich białek. W związku z tym zidentyfikowanie i scharakteryzowanie niektórych nowych graczy będzie miało ogromne znaczenie. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka przepustowość i protokół o wysokiej zawartości.Możemy jednocześnie testować wiele warunków eksperymentalnych i mierzyć różne parametry podczas jednego eksperymentu. W badaniach obejmujących cały genom proponowany protokół daje możliwość nakreślenia globalnego obrazu tego, w jaki sposób informacja genetyczna kodowana jądrowo reguluje swój mitochondrialny odpowiednik. Ponadto ma potencjał do identyfikacji białek, których dysfunkcja powoduje stres w mitochondrialnym DNA i aktywuje szlak odpowiedzi interferonowej.Na początek przygotuj 140-nanomolową mieszaninę małych interferujących RNA lub siRNA, rozcieńczając siRNA w pożywce Opti-MEM. Dodać pięć mikrolitrów rozcieńczonej mieszanki do dołków czarnej mikropłytki do hodowli komórkowych z 384 dołkami. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu odczynnika do transfekcji RNAiMAX w pożywce Opti-MEM i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki.Z płytki 384-dołkowej z dozownikiem odczynników. Aby rozpocząć transfekcję komórek, dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek HeLa do 384 dołków zawierających rozcieńczone siRNA, aby zasiać 700 komórek HeLa na studzienkę. Po godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej umieść studzienkę w inkubatorze na 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby włączyć BrdU do transfekowanych komórek, dodaj 10 mikrolitrów 90-mikromolowego roztworu BrdU do każdego dołka po 56 godzinach transfekcji siRNA. Inkubuj komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Specyfikę włączenia BrdU do mitochondrialnego DNA komórek HeLa badano przy użyciu komórek rzędu zerowego pozbawionych mitochondrialnego DNA.Aby rozpocząć znakowanie mitochondriów, przygotuj 20-mikromolowy roztwór BrdU w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Następnie dodaj barwnik śledzący mitochondria, aby dostosować końcowe stężenie do 1,1 mikromola. Po 15 godzinach dodaj 10 mikrolitrów roztworu barwnika śledzącego mitochondria do zawiesiny komórek HeLa zawierającej studzienki.Inkubuj komórki przez godzinę. Warunki użyte do znakowania nowo zsyntetyzowanych cząsteczek DNA za pomocą BrdU pozwoliły na wykrycie DNA znakowanego BrdU w mitochondriach komórek HeLa. Sygnał uzyskany za pomocą przeciwciał anty BrdU był specyficzny i obserwowano go tylko w komórkach traktowanych BrdU niezależnie od leczenia BrdU, w mitochondriach komórek rzędu zero nie wykryto sygnału przeciwciała anty-BrdU lub anty-DNA.Kwantyfikacja sygnału fluorescencyjnego z przeciwciał anty BrdU wykazała, że komórki rzędu zero traktowane BrdU wykazywały ten sam niski poziom fluorescencji, co komórki nietraktowane BrdU, podczas gdy sygnał dla linii rodzicielskich A549 i HeLa był 50 razy wyższy. Aby rozpocząć utrwalanie komórek HeLa, należy dwukrotnie przepłukać komórkę HeLa zawierającą płytkę 384-dołkową 100 mikrolitrami PBS za pomocą myjki do mikropłytek. Pozostaw 25 mikrolitrów PBS w studzience po drugim umyciu i dodaj 25 mikrolitrów 8% roztworu formaldehydu.Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przepłucz każdą studzienkę cztery razy 100 mikrolitrami PBS i pozostaw 25 mikrolitrów PBS w studzience po ostatnim myciu. Dodać 25 mikrolitrów 6% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA w PBS do każdego dołka i inkubować płytkę w ciemności przez 30 minut.Aby rozpocząć dodawanie przeciwciała pierwotnego, należy odessać albuminę surowicy bydlęcej lub BSA z utrwalonych i zablokowanych transfekowanych komórek HeLa, pozostawiając 10 mikrolitrów roztworu BSA w studzience. Następnie dodać 10 mikrolitrów pierwszorzędowego roztworu przeciwciała przygotowanego w 3% BSA w PBS i inkubować płytkę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 mikrolitrami PBS, pozostawiając 10 mikrolitrów po ostatnim myciu.Następnie dodaj 10 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do płytki 384-dołkowej. Używaj przeciwciał specyficznych dla izotypu sprzężonych z fluorochromami, takich jak Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 555. Po inkubacji płytki w ciemności przez godzinę, przepłukać każdą studzienkę czterokrotnie 100 mikrolitrami PBS i pozostawić 50 mikrolitrów PBS w studzience po ostatnim myciu.Zastosowanie przeciwciał anty DNA pozwoliło na monitorowanie rozmieszczenia mitochondrialnego DNA w komórce w danych warunkach eksperymentalnych. Regulacja w dół mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A, TFAM, doprowadziła do drastycznych zmian w dystrybucji mitochondrialnego DNA z mniejszą liczbą mitochondrialnych plamek DNA niż w komórkach kontrolnych. Kwantyfikacja średniego sygnału fluorescencyjnego z przeciwciała anty-DNA wykazała kilkukrotny wzrost po wyciszeniu TFAM w porównaniu z innymi badanymi warunkami.Aby rozpocząć obrazowanie transfekowanych komórek HeLa, wybierz wystarczająco długi czas ekspozycji dla poszczególnych kanałów fluorescencyjnych w trybie podglądu na żywo w oparciu o histogramy intensywności wygenerowane przez oprogramowanie do obrazowania. Ustaw odpowiednią liczbę płaszczyzn do obrazowania na osi Z. Wybierz odpowiednią liczbę pól widoku do wyświetlenia dla każdego dołka.Aby rozpocząć analizę ilościową pozyskanych obrazów, należy wykonać korekcję tła dla wszystkich obrazów ze wszystkich kanałów fluorescencyjnych. W zależności od wielkości analizowanych obiektów należy wybrać odpowiedni rozmiar filtra. Następnie rozpocznij segmentację obrazu od stworzenia maski głównego obiektu na podstawie stosunku intensywności sygnału fluorescencji do tła dla kanału odpowiadającego jądrom komórkowym.Twórz maski dla podobiektów reprezentujących BrdU i plamki mitochondrialnego DNA, korzystając z kanałów fluorescencyjnych właściwych dla danych struktur. Ustaw parametry i zmierz intensywność poszczególnych pikseli w każdej masce dla wszystkich kanałów fluorescencji. Aby uzyskać całkowite intensywności fluorescencji dla BrdU lub mitochondrialnego kanału DNA, należy zsumować intensywności wszystkich podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego.Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji, należy podzielić całkowitą intensywność fluorescencji przez sumę powierzchni podobiektów przypisanych do danego jądra komórkowego. Wyniki obrazowania zweryfikowano poprzez pomiar poziomu mitochondrialnego DNA i ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Leczenie dideoksycytydyną, czyli ddC, skutkowało bardzo silnym spadkiem poziomu mitochondrialnego DNA.Słabszy efekt zaobserwowano w przypadku wyciszania TFAM i helikazy migotania, podczas gdy transfekcja komórek z polimerazą gamma mitochondrialnego DNA lub siRNA POLG miała niewielki wpływ na liczbę kopii mitochondrialnego DNA. Kwantyfikacja TFAM i ekspresji helikazy migotania potwierdziła skuteczne zmniejszenie ekspresji mRNA do około 15 do 20% poziomów kontrolnych. W POLG ekspresja mRNA została zmniejszona tylko do 30%, co wyjaśnia nieoczekiwany skromny wpływ na liczbę kopii mitochondrialnego DNA.

high-throughput-image-based-quantification-mitochondrial-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w pojedynczych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie EdU z protokołem tyramidowej amplifikacji sygnału (TSA), aby zwizualizować replikację mtDNA w obrębie przedziałów subkomórkowych neuronów.

Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA). W tym protokole opisujemy enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, który można wykorzystać do uniknięcia przeszacowania poziomów metylacji mtDNA spowodowanych drugorzędową strukturą mtDNA.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj wysokoprzepustową metodę obrazowania immunofluorescencyjnego do kwantyfikacji syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA w komórkach. Technika umożliwia identyfikację białek regulujących metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Przeglądaj więcej filmów